Aspergillus y Fusarium en maíz y avena. Nuevas estrategias sostenibles para su control

Fecha de publicación: 1/6/2021
Fuente: Engormix.com y Universidad Complutense de Madrid

La "Detección de especies potencialmente toxígenas de Aspergillus y Fusarium en maíz y avena. Diseño de nuevas estrategias sostenibles para su control" fue el eje central de la investigación realizada por Marta Garcia Díaz para su tesis doctoral en la Facultad de Ciencias Biológicas, Departamento de Genética, Fisiología y Microbiología de la Universidad Complutense de Madrid (España) durante el 2020.

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La destacada investigador señala en el resumen de su trabajo que dado el riesgo que presentan las micotoxinas, la Unión Europea ha establecido unos contenidos máximos permitidos de las mismas en los cereales y sus productos derivados. A su vez el Codex alimentarius, creado por la FAO, recoge diferentes medidas de protección, que pueden ayudar a minimizar el riesgo de contaminación por micotoxinas en los granos de cereal como es la aplicación de buenas prácticas agrícolas (BPA). Paralelo a ello, la tendencia de los consumidores, principalmente en Europa, demandan productos más naturales, por lo que es necesaria la búsqueda de nuevos métodos de control eficaces y sostenibles con el medio ambiente. En ese contexto, aparecen los extractos de plantas aromáticas, como los aceites esenciales, que demuestran tener fuertes propiedades antifúngicas y además son capaces de interferir en la biosíntesis de las micotoxinas. Estas cualidades junto con su baja toxicidad y su aceptación por parte de los consumidores, los hacen buenos candidatos para su aplicación como fungicidas naturales para controlar hongos productores de micotoxinas.

España es uno de los principales países productores de cereal a nivel mundial y el maíz y la avena son dos de los más importantes. La mayor cantidad de la producción de maíz se destina habitualmente para la fabricación de piensos, mientras que la producción de avena ha aumentado considerablemente en los últimos años debido a la demanda por parte de los consumidores de productos más saludables para la dieta.

En este contexto, el primer objetivo de esta Tesis Doctoral fue evaluar el riesgo de contaminación por micotoxinas que presentan el maíz y la avena en España. Para ello, en primer lugar, se analizó la contaminación por micotoxinas y sus hongos productores a largo del ciclo de cultivo del maíz. Fueron evaluadas tres etapas (antesis, cosecha y almacenamiento) durante tres cosechas consecutivas (2016-2018) en diferentes parcelas situadas al Sur de Madrid. Esta explotación agrícola aplica BPA tanto en campo como durante el almacenamiento y, además, cuenta con un secadero y almacén de grano propios. Para determinar la presencia de las principales especies productoras de micotoxinas en el maíz se utilizaron protocolos de PCR específicos descritos con anterioridad o desarrollados durante este trabajo, como es el caso de los protocolos para F. graminearum, F. langsethiae, F. fujikuroi, F. poae, F. sporotrichioides y F. temperatum. Los niveles de micotoxinas se determinaron mediante LC-MS/MS.

Las especies detectadas en alguna de las etapas durante el ciclo del cultivo del maíz fueron F. verticillioides F. proliferatum, F. graminearum, A. flavus, A. parasiticus, A. carbonarius y especies del agregado A. niger (A. niger y A. welwitschiae). Fusarium verticillioides y F. proliferatum, especies potencialmente productoras de fumonisinas tipo B (FB), y A. flavus potencialmente productora de aflatoxinas (AF) fueron las especies más predominantes en todas las etapas evaluadas, destacando la presencia de A. flavus desde las primeras etapas del cultivo, tanto en flores masculinas como en femeninas.

De todas las toxinas analizadas, las FB fueron las únicas detectadas tanto en muestras tomadas en el momento de la cosecha como en almacén, aunque con niveles muy bajos siempre por debajo de los establecidos por la legislación Europea. A pesar de la alta incidencia de A. flavus, no se detectaron AF en ninguna de las etapas del cultivo.

Los resultados alcanzados en este trabajo ponen de manifiesto la importancia de las BPA en el ciclo del cultivo del maíz para prevenir la contaminación por micotoxinas. Se ha demostrado que a pesar de que la contaminación por importantes especies toxígenas ocurre desde inicio del cultivo, el control de la temperatura y la humedad durante el almacenamiento de los granos de maíz, son claves para impedir el desarrollo de estos hongos y la consecuente producción de micotoxinas.

Por otro lado, se evaluó el estado actual del maíz y la avena en España con respecto a su riesgo de contaminación por micotoxinas. Para ello se determinó la presencia de las principales especies de Fusarium y Aspergillus potencialmente productoras de micotoxinas en estos cereales, tanto en muestras de campo recolectadas en las principales zonas cerealistas españolas durante tres campañas (2016-2018), como en muestras disponibles comercialmente en España. La detección de estas especies en las muestras de cereal se evaluó mediante protocolos de PCR específicos para cada especie. Las principales especies detectadas fueron A. flavus, A. niger, F. verticillioides y F. proliferatum y, en general, el porcentaje de contaminación fue mayor en las muestras procedentes de maíz que las de avena, tanto en el caso de las muestras de campo como en las comerciales. La presencia de estas especies potencialmente toxígenas indicaría un posible riesgo de contaminación por AF, ocratoxina A y FB en los productos de maíz y avena cultivados y consumidos en España.

Como ya se ha mencionado anteriormente, la Unión Europea establece unos límites respecto al contenido máximo permitido de algunas micotoxinas en cereales y sus derivados. Los estudios amplios de incidencia de micotoxinas en alimentos como el realizado en esta Tesis pueden ser muy útiles para considerar si es pertinente modificar los límites planteados en la normativa. Los resultados obtenidos en este estudio indican que el posible riesgo de contaminación por micotoxinas en maíz y avena en España no es tan elevado como para tener que plantear una nueva legislación en avena o modificar los niveles vigentes permitidos en maíz y sus derivados. Además, se ha confirmado la importancia de las técnicas moleculares, como los protocolos de PCR específicos utilizados en este trabajo, para la realización de estudios de incidencia de hongos productores de micotoxinas, así como para su detección temprana con el fin de predecir el riesgo de contaminación por micotoxinas en productos alimentarios. En el caso de detectar especies productoras, se deberían establecer medidas estrictas de control para evitar el desarrollo de los hongos e impedir que las micotoxinas entren en la cadena alimentaria.

Durante la realización de los trabajos anteriormente mencionados, se aislaron una gran variedad de cepas de Fusarium y Aspergillus de las muestras de cereal analizadas, con el fin de realizar un estudio para comprobar posibles relaciones filogenéticas. Las principales especies aisladas e identificadas coinciden con las detectadas mediante las PCR específicas realizadas en los granos de cereal, siendo F. verticillioides, F. proliferatum A. flavus y las especies del agregado A. niger (A. tubingensis, A. niger y A. welwitschiae) las mayoritarias. El estudio filogenético se realizó utilizando el método de Neighbor-Joining y secuencias parciales del gen que codifica el factor de elongación-1α, la β-tubulina y la calmodulina para los aislados del género Fusarium, de Aspergillus sección Flavi y del agregado A. niger, respectivamente. Los estudios filogenéticos revelaron que no existe variabilidad intraespecífica en ningún caso, y no se pudieron establecer relaciones entre las fuentes de aislamiento o la ubicación del cultivo.

Otro de los objetivos de esta Tesis Doctoral fue evaluar el efecto de extractos de planta sobre el crecimiento de A. flavus y su capacidad para producir AF, con el fin de desarrollar un sistema eficaz y sostenible para controlar la contaminación por AF durante el almacenamiento de los granos de maíz, determinando cuáles serían las condiciones más apropiadas para su aplicación.

En primer lugar, se evaluó el efecto in vitro de AE e hidrolatos (HL) de seis plantas aromáticas sobre el crecimiento y la producción de AF de A. flavus. Los extractos analizados fueron obtenidos de Rosmarinus officinalis, Thymus vulgaris,
Satureja montana (SM), Origanum virens (OV), O. majoricum y O. vulgare. Para ello se suplementó medio de cultivo CYA con diferentes cantidades de dichos compuestos hasta alcanzar concentraciones finales de 10, 100, 500 y 1000 µg/mL, y se calculó la tasa de crecimiento y la fase de latencia de A. flavus en todas las condiciones. La producción de AF se detectó por HPLC tras 6 días de incubación. Los resultados revelaron que, en general, el efecto de los AE es muy superior al de los HL, destacando los AE de SM y OV que fueron capaces de reducir tanto el crecimiento como la producción de AF de A. flavus incluso a bajas dosis (100 µg/mL).

Una vez conocida la eficacia de los AE de SM y OV, se planteó estudiar cómo afectan las condiciones de humedad a su capacidad para reducir el crecimiento y la producción de AF en A. flavus. Para ello, se realizó un ensayo in vitro con diferentes concentraciones de AE (350, 700 y 1000 µg/mL) a tres niveles de actividad de agua (0,94, 0,96 y 0,98 aw). El crecimiento del hongo se valoró mediante espectrofotometría utilizando el Bioscreen C y la concentración de AF se determinó mediante HPLC-FLD.

Estos análisis se llevaron a cabo en la Universidad de Cranfield (Reino Unido) bajo la dirección del Dr. Ángel Medina. En cierta medida, los AE de SM y OV retrasaron el crecimiento de A. flavus a las tres aw analizadas, reduciéndose la producción de AF en todos los casos. Sin embargo, el efecto fue mucho más significativo a altos niveles de aw, cuando la producción de AF por parte del hongo es máxima. Estos resultados ponen de manifiesto la utilidad de la aplicación de los AE de SM y OV, tanto para controlar la contaminación por AF en matrices alimentarias con elevada aw, como cuando las condiciones de humedad durante el almacenamiento no pueden ser controladas.

Los AE son extractos altamente volátiles, por lo que es preciso desarrollar un correcto procedimiento para su aplicación y así alargar su efecto en el tiempo sobre las matrices alimentarias. Por tanto, el último objetivo de esta Tesis se centró en optimizar el método de aplicación de los AE seleccionados sobre los granos de maíz para controlar la contaminación por AF durante el almacenamiento de los mismos. Para estandarizar el proceso, la puesta a punto del método de aplicación se realizó con un AE comercial de tomillo (TEO). En primer lugar, se evaluaron los procedimientos de aplicación más sencillos (contacto directo, volatilización y pulverización) sobre granos de maíz previamente inoculados con A. flavus y se valoró su efecto tras 9 y 28 días de incubación. El crecimiento del hongo se estimó mediante un recuento de viables mientras que la concentración de AF producida se analizó mediante TLC. Los resultados obtenidos indicaron que es necesario que el TEO entre en contacto con los granos para obtener una eficacia máxima, y que su efecto antifúngico se pierde con el tiempo, lo que hace necesario proteger el AE antes de su aplicación. Por este motivo, siguiendo el mismo protocolo anterior, se evaluó la efectividad del TEO encapsulado por distintos materiales (goma arábica, gelatina, alginato y niosomas). La encapsulación en niosomas fue el único método que permitió que el AE redujera tanto el crecimiento como la producción de AF de A. flavus respecto al control no tratado.

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Maíz inoculado con A. flavus (A7) en placas de Petri con cristales de sulfato de potasio y recipiente de aceites esenciales.

Los niosomas son sistemas basados en lípidos que no presentan toxicidad, son biodegradables y fáciles de manipular, por lo que son buenos candidatos a la hora de ser aplicados a las matrices alimentarias. Posteriormente, se realizó un estudio a mayor escala simulando las condiciones reales de almacenamiento de los granos para comprobar si realmente los AE de SM y OV encapsulados en niosomas eran efectivos para reducir la contaminación por AF. Para ello se colocaron 100 g de maíz inoculado con A. flavus en bolsas tejidas de polipropileno y se añadieron, en su caso, 500 μg/g de los AE de SM u OV encapsulados en niosomas. Las bolsas se almacenaron durante 90 días en cajas de plástico en las que se monitorizó la temperatura y humedad con una sonda a lo largo del experimento. El crecimiento de A. flavus y la concentración de AF en los granos de maíz se evaluaron a los 45, 60, 75 y 90 días mediante el recuento de viables y TLC, respectivamente. Los resultados obtenidos confirman que el nuevo método desarrollado sería eficaz para prevenir la presencia de AF en los granos de maíz almacenados cuando las condiciones ambientales no pueden ser controladas.

Ambos AE encapsulados en niosomas redujeron tanto el crecimiento como la producción de AF durante el periodo de incubación, prolongando considerablemente la eficacia que se había observado con respecto al AE no encapsulado. Cabe destacar el efecto del AE de SM con una reducción del crecimiento del 79 % a los 60 días de almacenamiento, frente al 52 % del AE de OV. La aplicación de los AE encapsulados fue capaz de reducir la presencia de AF durante 75 y 90 días en el caso del AE de OV y SM, respectivamente, con respecto al control.

Por tanto, en esta Tesis se ha confirmado la importancia de las BPA para reducir el riesgo ocasionado por la presencia de micotoxinas en los granos de cereal durante el almacenamiento de los mismos. Además, se ha puesto de manifiesto la utilidad de las técnicas moleculares para estudiar el estado de los cultivos en relación a la presencia de especies potencialmente toxígenas y detectar tempranamente estos hongos, de manera que se puedan tomar estrictas medidas de control y evitar la producción de toxinas durante el almacenamiento de los granos. Por otro lado, se ha desarrollado un nuevo método de control sostenible con el medio ambiente e inocuo para la salud basado en
AE encapsulados que puede ser utilizado para reducir el riesgo por micotoxinas en los cereales cuando las condiciones ambientales no pueden ser controladas.

El trabajo de la autora para optar al grado de Doctora en Microbiología y Parasitología contó con la dirección de la Dra. Belén Patiño Álvarez y la Dra. Jéssica Gil Serna, esta dividido en cuatro capítulos y cuenta con 207 páginas. 

Para acceder al trabajo completo en el Repositorio Digital de la universidad española haga CLICK sobre la imagen de portada del documento:

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