Proceso de rastreabilidad en aves: análisis del par de isótopos δ13c y δ15n

En la rastreabilidad de animales, la composición isotópica de los tejidos sirve como rastreador (trazador) natural de las diferentes dietas con diferentes materiales isotópicos. Por otro lado, la relación entre la composición isotópica del material ingerido y la del tejido animal, puede responder al status nutricional, la tasa de reconversión (turnover) y la ruta biosintética (Kock et al., 1994). Algunos autores han evaluado de forma separada (análisis univariado) a los isótopos de carbono y nitrógeno. Rogers (2009) evaluó el alimento de gallinas mediante la técnica de isótopos estables y analizó los resultados de carbono y nitrógeno, por separado, para los componentes de los huevos, pero concluyó que éstos presentaron resultados diferentes entre el carbono-13 y el nitrógeno-15 de la misma muestra.

Carrijo et al. (2006) percibieron la necesidad del análisis de los datos de enriquecimiento relativo del carbono-13 (δ¹³C) asociado al del nitrógeno-15 (δ¹⁵N) (análisis multivariado), lo que permitió verificar en el músculo pectoral la inclusión de harina de carne y hueso de origen bovino en la alimentación de pollo de engorde. También en pollos, Gottmann et al. (2008) identificaron en el músculo pectoral la inclusión de vísceras de aves en la alimentación, así como de otros ingredientes alternativos (harina de trigo y levadura). Oliveira et al. (2010) analizaron el músculo pectoral, la quilla y la tibia de pollos de engorde, con el objetivo de identificar cuál de estos tejidos sería mejor para el rastreo de harina de vísceras de aves en la dieta de pollos de engorde, en aluna fase de su producción.

Denadai et al. (2005) evaluaron huevos de ponedoras de dos avicultores de la región de Bastos, SP, Brasil, uno de los cuales utilizaba solamente productos de origen vegetal y el otro, un subproducto de origen animal. Mediante el sistema del doble eje isotópico (d¹³C y d¹⁵N) observaron que estos huevos poseían patrones isotópicos distintos, sugiriendo la posibilidad de rastrear la inclusión de harina de origen animal en la alimentación de ponedoras, detectándola en el huevo. En codornices productoras de carne, Móri et al. (2007) detectaron los subproductos de origen animal utilizados en las dietas de estas aves, en el músculo pectoral, la quilla y la tibia. Denadai (2008) y Denadai et al. (2009) detectaron la inclusión de 1.5% de harina de carne y hueso de bovinos en la albúmina de huevos de aves alimentadas con este ingrediente. Concluyeron que el análisis combinado de d¹⁵N y d¹⁵C, o sea, el análisis multivariado de los datos de los isótopos estables de carbono y nitrógeno, hace posible la detección en la dieta de las aves.

De esta manera, en la literatura se encuentran trabajos con isótopos de carbono y de nitrógeno analizados de forma univariada y multivariada, con fines de rastreabilidad. El objetivo del presente artículo fue esclarecer las diferencias entre las técnicas analíticas y establecer un análisis estadístico que presente mayores detalles sobre los resultados de los isótopos estables de carbono-13 y nitrógeno-15 para la rastreabilidad, en aves. A manera de ejemplo se evaluaron los datos de carbono-13 y nitrógeno-15 de huevos, músculo pectoral y quilla de aves, por métodos estadísticos univariados (ANOVA y prueba de Tukey) y multivariado (MANOVA).

Los datos de los huevos fueron provenientes de Denadai (2008), quien utilizó 240 gallinas ponedoras bajo un diseño experimental completamente al azar, con cinco tratamientos y seis repeticiones. Los tratamientos consistieron en niveles de inclusión (0; 1.5; 3.0; 4.5 y 6.0%) de harina de carne y hueso de bovino en una dieta a base de maíz y torta (pasta o harina) de soya (soja). El día 35 se tomaron aleatoriamente 12 huevos por tratamiento, dos por repetición, para medir el enriquecimiento isotópico de δ¹³C y δ¹⁵N.

 

Tanto las técnicas univariadas (ANOVA) cuanto la MANOVA se utilizan para evaluar la significancia estadística de las diferencias entre grupos. Para el sistema ANOVA, la hipótesis nula probada es la igualdad de medias de la variable dependiente a lo largo de los grupos. En el sistema MANOVA, la hipótesis nula probada es la igualdad de vectores de medias sobre múltiples variables dependientes a lo largo de los grupos. El aspecto único del análisis MANOVA es que la variable estadística combina de manera óptima las múltiples medidas dependientes en un solo valor, lo que maximiza las diferencias a lo largo de los grupos.

El uso de ANOVA(s) univariadas separadas puede crear problemas cuando intentamos controlar la tasa de error general o experimental. Por ejemplo, consideremos la evaluación de una serie de cinco variables dependientes por medio de ANOVA(s) separadas, siempre usando 0.05 como nivel de significancia. Dado que no existen diferencias reales en las variables dependientes, es de esperar la observación de un efecto significativo sobre cualquier variable dependiente dada, el 5% del tiempo. Sin embargo, Hair et al. (2009), observaron que en cinco pruebas separadas, la probabilidad de error Tipo I gira alrededor del 5%, si todas las variables dependientes están perfectamente correlacionadas, y el 23% (1- 0.95⁵), si las variables dependientes son no correlacionadas. De esta manera, una serie de pruebas estadísticas separadas deja sin control a la tasa de error Tipo I efectiva general o experimental. Si el investigador sedea mantener bajo control la tasa de error experimental y existe cuando menos algún grado de interrelación entre las variables dependientes, en este será apropiado el análisis MANOVA.

Para complementar al análisis MANOVA, se pueden crear gráficas bidimensionales evaluando las diferencias de un vector respuesta con los demás. Este tipo de evaluación es más utilizado cuando lo que se desea es una comparación única como el estándar, por ejemplo, si tenemos 10 tratamientos, se generarían 10 gráficas para evaluar todas las diferencias posibles, lo que dificulta mucho el proceso de análisis.

La primera fase consistió en analizar separadamente los datos de isótopos estables de carbono-13 y de nitrigênio-15, utilizando el análisis de varianza univariada (ANOVA) complementado con la prueba de Tukey. Este análisis se realizó para verificar la influencia de la tasa de error Tipo I descrita por Hair et al. (2005), verificando así si las variables están perfectamente correlacionadas. En la segunda fase, los datos se exploraron mediante análisis multivariados MANOVA, evaluando la comparación del estándar (0% de inclusión) con los demás tratamientos, representada por una gráfica bidimensional. Se finalizó con una evaluación de los resultados obtenidos por los métodos y la definición del método más propicio a ser utilizado para datos de rastreabilidad en aves, con isótopos estables de carbono-13 y nitrógeno-15.

Se puede observar que existió diferencia significativa entre los tratamientos, para el análisis de varianza (ANOVA) (P<0.01) de la variable carbono-13 para los datos de huevos y que solamente los tratamientos con la adición de 4.5 y 3.0% de harina de carne y hueso de bovino no presentaron diferencia significativa entre sí. Los demás presentaron diferencias con la prueba de Tukey al 5% de significancia (Cuadro 1).

Para la variable de nitrógeno-15 se observó que el análisis de varianza (ANOVA) fue significativo (P<0.01) y que el tratamiento con la inclusión de 6.0% de harina de carne y hueso de bovino no difirió del tratamiento con 4.5% de inclusión. El tratamiento con inclusión de 4,5 no difirió del que tenía el 3.0% de inclusión. El de 1.5% de inclusión no difirió del que tenía 0% de inclusión, según la prueba de Tukey con el 5% de significancia (Cuadro 2), resultado que fue diferente del obtenido para la variable de carbono-13.

Se puede observar para el análisis MANOVA que existió diferencia significativa entre los tratamientos (Cuadro 2) para todos los criterios usados. En la Figura 1 se representó la diferencia del estándar (0% de inclusión de harina de carne y hueso de bovino) con los demás tratamientos, donde se observó que sólo el tratamiento con 1.5% no presentó diferencias con respecto al estándar.

Cuadro 1. Prueba de Tukey de la variable carbono-13 para los huevos

Cuadro 2. MANOVA para las variables de carbono-13 y nitrógeno-15 en los huevos

Figura 1. Representación bidimensional del análisis MANOVA. Comparación de los diferentes tratamientos con inclusión de harina de carne y hueso de bovino y el tratamiento sin inclusión, para huevos

Cuando se realizó el análisis estadístico para cada variable por separado (análisis Univariado) se observó para la variable carbono-13 diferencia entre el estándar y el tratamiento con 1.5 de inclusión, pero esto no se observó para la variable nitrógeno-15. Sin embargo, al realizar el análisis conjunto (análisis multivariado) se observó que estos tratamientos no difirieron entre sí (Cuadro 2 y Figura 1). Podemos resaltar la necesidad de análisis de carbono-13 y nitrógeno-15 para rastreabilidad en aves y el análisis estadístico conjunto de estos datos (análisis multivariado), observando que este análisis mostró un resultado más propicio para problemas con más de una variable dependiente.

La rastreabilidad por isótopos estables se debe evaluar con más de una variable, como el carbono-13 y el nitrógeno-15.

El análisis estadístico adecuado para problemas con más de variable dependiente, en este caso carbono-13 y nitrógeno-15, puede ser el análisis multivariado MANOVA, complementado por una prueba entre grupos.

A la fundación de Amparo a la Investigación del Estado de São Paulo, Brasil, por la beca posdoctoral.