PRRS: Optimizar protocolos de muestreo

Con el objetivo de mejorar el valor diagnóstico de las puntas de la lengua para la vigilancia del PRRS, un estudio dirigido por el Dr. Onyekachukwu Henry Osemeke de la Universidad Estatal de Iowa tuvo como objetivo optimizar los protocolos para aumentar la probabilidad de recuperar aislados vivos del PRRSV de los fluidos de la punta de la lengua.

El aislamiento exitoso de los virus del PRRS de las puntas de la lengua post mortem mejora su valor diagnóstico como un tipo de muestra para la vigilancia del rebaño. Financiado por el Centro de Información de Salud Porcina , el estudio evaluó cuatro protocolos diferentes de recolección de muestras en 597 puntas de lengua de lechones nacidos muertos y muertos. Las muestras con los valores de Ct más bajos en las pruebas de PCR del PRRSV se seleccionaron para el aislamiento del virus en dos líneas celulares y macrófagos alveolares primarios. En general, las tasas más altas de aislamiento exitoso del virus se encontraron en fluidos extraídos de tejidos frescos de la lengua usando PBS (22,6%) y en células ZMAC (21%).

La vigilancia del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino es particularmente difícil en escenarios de baja prevalencia debido al costo de analizar unidades representativas y las complejidades asociadas con la ecología del PRRSV (Muñoz-Zanzi et al., 2006). Recientemente, se demostró que la muestra de la punta de la lengua o de los fluidos de la punta de la lengua post mortem es un enfoque rentable y sensible a la población para la vigilancia del PRRSV en piaras porcinas. Si bien la detección del ARN del PRRSV mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR) es la prueba más solicitada para la vigilancia del PRRSV en EE. UU. (Trevisan et al., 2019), el aislamiento del virus vivo sigue siendo crucial para confirmar la presencia de PRRSV infeccioso en una piara. Actualmente, no hay evidencia documentada de que se aísle el PRRSV vivo específicamente de muestras de la punta de la lengua.

Por lo tanto, el objetivo del estudio descrito en este trabajo fue identificar qué protocolos de recolección, procesamiento y cultivo celular mejoran la recuperación de aislados vivos de PRRSV a partir de fluidos de la punta de la lengua recolectados en animales muertos perinatalmente. Mediante la optimización de las técnicas de recolección y los procedimientos de análisis, este estudio buscó mejorar el valor diagnóstico de las puntas de la lengua como tipo de muestra para la vigilancia del PRRSV. Como aplicación práctica, esto podría ofrecer a los ganaderos porcinos una herramienta más representativa del rebaño para la formulación de vacunas vivas.

Para completar este estudio, se recolectaron muestras de 597 animales muertos perinatales de un hato reproductor de 5000 cabezas positivo al virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) durante un período de cuatro días. Los tejidos linguales se agruparon en 20 lotes (aproximadamente 30 animales muertos o lenguas por lote). Cada lengua se dividió en cuatro cuartos, y cada cuarto se asignó aleatoriamente a uno de cuatro protocolos de recolección: 1) extracción de fluidos linguales de tejido fresco con solución salina tamponada con fosfato; 2) extracción de fluidos linguales de tejido fresco con medio de transporte viral; 3) extracción de fluidos linguales en solución salina tamponada con fosfato tras un ciclo de congelación-descongelación; y 4) homogeneizado de tejido lingual.

El resultado fue un total de 80 muestras (20 lotes x 4 protocolos) que se enviaron a un laboratorio de diagnóstico veterinario autorizado por la NAHLN para la prueba de RT-qPCR. Se promediaron los valores umbral del ciclo de RT-qPCR entre los cuatro protocolos en cada uno de los 20 lotes, y se seleccionaron los 10 lotes con los valores medios de Ct más bajos para el aislamiento del virus (VI). Se analizó la capacidad de dos líneas celulares (ZMAC y MARC-145) y un lote de macrófagos alveolares primarios para aislar con éxito el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV).

Todas las muestras dieron positivo para PRRSV por RT-qPCR, con valores promedio de Ct para los grupos de solución salina tamponada con fosfato, medio de transporte de virus, congelación-descongelación y homogeneizado de 21,9, 21,8, 22,6 y 24,8, respectivamente. PRRSV se aisló exitosamente de tejidos de la lengua en todos los grupos con tasas de éxito variables. La tasa de éxito de aislamiento del virus fue del 22,6% en el grupo de solución salina tamponada con fosfato, del 12,1% en el grupo de medio de transporte de virus y del 2,8% en los grupos de congelación-descongelación y homogeneizado. La probabilidad de aislamiento viral exitoso fue del 3,1% en células MARC-145, del 21,0% en células ZMAC y del 4,8% en células de macrófagos alveolares primarios. Los lotes de mortalidad con solo lechones nacidos muertos tuvieron una probabilidad del 35,5% de aislamiento exitoso de PRRSV, mientras que los lotes con lechones nacidos muertos y muertos tuvieron una probabilidad del 1,0%.

Los investigadores concluyeron que el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) vivo puede aislarse de fluidos de la punta de la lengua post mortem. La extracción de fluidos de la punta de la lengua de lechones nacidos muertos frescos mediante solución salina tamponada con fosfato o un medio de transporte viral aumenta las probabilidades de aislamiento exitoso del virus. La línea celular ZMAC superó a la línea celular MARC-145 y a los macrófagos alveolares primarios en este estudio. Garantizar una cadena de frío desde la toma de muestras hasta su llegada al laboratorio mantiene la calidad diagnóstica de las mismas. El aislamiento del PRRSV a partir de muestras agregadas, como los fluidos de la punta de la lengua, ofrece varias ventajas para la vigilancia y el desarrollo de vacunas. Dado que el aislamiento del virus mediante muestras agregadas permite la detección conjunta eficiente de múltiples cepas de PRRSV dentro de un rebaño, existen grandes ventajas para la vigilancia y el desarrollo de vacunas autógenas.

Dado que no es posible predecir cuándo ni dónde aparecerá la próxima enfermedad emergente, la evaluación crítica de protocolos de muestreo convenientes para su aplicabilidad y eficacia en la vigilancia de enfermedades ayudará a la industria a monitorear y detectar enfermedades conforme surgen. Este estudio proporciona información objetiva sobre las aplicaciones de las pruebas diagnósticas y las mejores prácticas para la obtención de fluidos de la punta de la lengua en casos de mortalidad perinatal.

Implicaciones para la industria: El virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) vivo se puede aislar de los fluidos linguales post mortem. La extracción de TF de lechones nacidos muertos frescos utilizando PBS o VTM aumenta las posibilidades de un aislamiento exitoso del virus. La línea celular ZMAC superó a la línea celular MARC-145 y a las células PAM en este estudio. Asegurar una cadena de frío desde la recolección de la muestra hasta su llegada al laboratorio mantiene la calidad diagnóstica de las muestras.