Suero fermentado por Lactobacillus casei y Lactobacillus acidophilus con propiedades probióticas para cerdos jóvenes

Introducción

En las condiciones intensivas de producción del cerdo, y fundamentalmente durante los primeros días de nacidos, el riesgo de enfermedades gastrointestinales es elevado.Tradicionalmente, se han adoptado estrategias para la erradicación de estas enfermedades infecciosas, entre las que se destacan la utilización de antibióticos como tratamiento preventivo. El empleo indiscriminado de estos fármacos es la causa de la aparición de cepas con drogoresistencia y de la presencia de residuos de antibióticos en las carnes, por lo que se ha prohibido internacionalmente su uso (García y cols., 2006).

Hasta la fecha, el mayor esfuerzo se ha realizado incorporando a los piensos sustancias o aditivos legalmente permitidos que ejercen una acción moduladora de la población microbiana o directamente un efecto antimicrobiano. Algunos delos aditivos que se emplean actualmente son los microorganismos probióticos. Lactobacillus acidophilus y Lactobacillus caseiconstituyen las especies bacterianas probióticas que más se utilizan de forma profiláctica en cerdos.

La utilización del suero para la formulación de un preparado probiótico para animales de cría, puede tener un efecto positivo sobre el estado de salud del animal y permitir un mayor aprovechamiento de este subproducto de quesería que constituye un contaminante ambiental. Es por ello que nuestro trabajo tuvo como objetivoobtener un producto fermentado a partir de suero dulce de queso de leche de vaca con cepas de Lactobacilluscasei y Lactobacillusacidophiluscon propiedades probióticas para cerdos lactantes

Materiales y Métodos

En los experimentos se utilizaron cepas de Lactobacillus acidophilus (L. acidophilus) y Lactobacillus casei (L. casei) procedentes del Banco de Cepas del Instituto de Investigaciones de la Industria Alimenticia (IIIA). Para las pruebas de Antagonismo se empleó una cepa enteropatógena salvaje de Escherichia coli (E.coli), aislada de cerdos enfermos con diarreas en el Centro Nacional de Epizootiología, Diagnóstico e Investigación (CENEDI). Las bacterias lácticas fueron mantenidas en leche esterilizada (10 % sólidos totales) mediante reactivaciones semanales y conservadas en refrigeración a 4 - 6 °C. La cepa de E. coli fue mantenida en Agar Sangre de Carnero al 10 %, mediante reactivaciones semanales, conservándola en refrigeración a 4 - 6 °C. Los monocultivos de L. acidophilus (Viabilidad=107ufc.mL-1) y L. casei (Viabilidad=107 ufc.mL-1) fueron inoculados en el suero dulce de queso de leche de vaca a razón de 1 % v/v, empleándose para el cultivo mixto de bacterias lácticas una relación de inóculo 1 :1. Para los estudios de antagonismo se ajustó la concentración de E. coli a 3 x 10 8ufc. mL-1 y seguidamente
se inoculó dicha suspensión en 100 mL de suero fermentado.

La caracterización físico química del suero se realizó según los procedimientos establecidos (AOAC, 1990). La determinación de las cenizas se realizó destruyendo toda la materia orgánica por incineración a 550 ºC. La calidad microbiológica se determinó según lo establecido en las normas vigentes: coliformes (NC: ISO 4832:2010), hongos y levaduras viables (NC: 100:2014), bacterias lácticas (NC: ISO 7889: 2009).Para la determinación de la viabilidad de E. coli se empleó un método similar al utilizado para las bacterias lácticas realizando el conteo en placa con el medio Agar Violeta Rojo Bilis (BIOCEM).

El estudio de la fermentación se realizó en envases de vidrio de 125 mL de capacidad con 100 mL de volumen efectivo en condiciones estáticas. Los frascos con suero pasterizado (90 ºC por 5 min.)fueron inoculados con los monocultivos de L. acidophilusy L. casei y el cultivo mixto. Las variantes de suero inoculado fueron incubadas a 37 °C tomándose muestras cada 1 h durante 24 h para realizar las determinaciones de acidez y pH. Los resultados se expresaron tomando el valor promedio de tres repeticiones por variable a estudiar.

Para la comprobación de la resistencia de las bacterias lácticasa la barrera gástrica del cerdose realizó un estudio “in vitro”. Se acidificó el suero con HCl hasta obtener diferentes valores de pH: 3.0, 2.5, 2.0 y 1.5, inoculándose el cultivo probiótico L. casei yL. acidophilus con 8.9 y 9.5 X 107ufc. mL-1 respectivamente. Se propició un tiempo de contacto de 1 h a 37°C. Como patrón se tomó el suero inoculado sin ajuste de pH, determinándose el conteo de viables a cada uno de los pH ensayados. Se utilizó bilis fresca de cerdo recolectada en la planta piloto de carne del IIIA. Seutilizaron erlenmeyers de 150 mL de capacidad conteniendo 100 mL de caldo MRS más 0.1 %; 0.5 %; 1.0 % de bilis fresca de cerdo. Se inocularon los erlenmeyers al 1% con las cepas de microorganismos seleccionados para este estudio y se incubaron a una temperatura de 37 °C durante 3 h de contacto. Como patrón se utilizó la viabilidad del cultivo en medio caldo MRS (Oxoid)sin bilis. Se realizó la prueba combinada que simula la barrera gástrica, manteniendo el suero fermentado en un tiempo de contacto de 1 h a un pH 2.5 (ajustándose con solución ácida de HCl). Seguidamente se adicionó solución de bilis fresca de cerdo hasta una concentración de 0.5 %, y se incubó a 37 °C durante 3 h de contacto. Como control se utilizó el suero fermentado. El conteo de viables fue el criterio utilizado para analizar el efecto de la barrera gástrica sobre los lactobacilos.

El enfrentamiento de las bacterias probióticas presentes en el suero fementado y la bacteria enteropatógena E. colise realizó ajustando la población inicial de microorganismos patógenos según la escala del método turbidimétrico desarrollado por Mc Farland, 1995. Los diámetros de los tubos y el volumen de las suspensiones utilizadas fueron iguales a los estándares. La concentración de E. coli se ajustó a 3 x 10 8ufc. mL-1 y seguidamente se inoculó dicha suspensión en 100 mL de suero fermentado, contenido en elenmeyers de 150 mL de capacidad. Se agitó durante 5 min.en zaranda a 150 r.p.m. Posteriormente se prepararon las diluciones en agua peptonada estéril y se procedió a la siembra a profundidad en medio Agar Violeta Rojo Bilis (BIOCEM). La incubación se realizó a una temperatura de 37 ºC, durante 24 h. Paralelamente se inocularon elenmeyers con las mismas condiciones pero sólo con E. coli, tomándose estos como patrón. La cuantificación del patógeno se realizó a las 0 y a las 24 h de incubación. Esta prueba se le realizó a 5 muestras de tres corridas experimentales. Los resultados se procesaron mediante el promedio del recuento de las colonias en placas duplicadas, expresándose como viabilidad celular del patógeno (Logufc/ mL).

Para el estudio "in vivo" se utilizaron 300 crías pertenecientes a 30 camadas con 10 animales cada una procedente de madres Yorkshire-Landrace entre 4 y 6 partos y padres CC21, alojados en maternidades típicas, con piso de cemento y paredes de bloques con refugio central, distribuidos en un experimento completamente aleatorizado con dos tratamientos y 15 repeticiones de 10 animales cada uno.Se suministró diariamente el suero fermentado a las madres en cantidades de 40 mL por animal durante 15 días antes del parto y a las crías 20 mL por animal desde el nacimiento hasta el destete. Las madres y sus crías fueron manejadas y alimentadas según las indicaciones referidas en Procedimientos Técnicos para estas categorías de animales (Domínguez, 2006). A las crías se les suministró una dosis de 20 mL del suero fermentado por vía oral, en el 1er y 2do día de vida respectivamente, coincidiendo con manipulaciones zootécnicas de los cerditos. A partir del tercer día se colocó la dosis de suero fermentado en un recipiente con suficiente frente de comedero para el total de la camada.

Después de los siete días de edad el suero fermentado se suministró sobre el “pienso de inicio” colocado en los comederos lineales. Las crías del tratamiento control fueron alimentadas con “pienso de inicio” solamente, a partir del séptimo día hasta el destete (41 días promedio). Los parámetros que se midieron fueron:peso al nacer y al destete,ganancia media diaria, incidencia de diarreas, mortalidad y morbilidad de las crías.Previo al análisis estadístico de los datos, se comprobó la normalidad y la homogeneidad de varianza de éstos mediante la prueba de Kolmogorov- Smirnov y la prueba de Bartlett respectivamente. Para determinar diferencias significativas entre las fuentes de variación se emplearon los análisis de varianza de clasificación simple. Para la selección de las mejores condiciones de tratamiento se empleó la prueba StudentNeumanKeuls.

Resultados y Discusión

Los resultados de la caracterización físico-químicay microbiológica del suero dulce de quesería estuvieron acorde con lo referido para un suero dulce de quesería en las normas vigentes. Esto nos indicó que el suero seleccionado como sustrato para este estudio presentó buenos índices de calidad y variados componentes que pueden satisfacer las necesidades nutricionales de las bacterias ácido lácticas utilizadas en los experimentos.

En el estudio de la fermentación se pudo obtener un buen desarrollo de la acidez y el pH indicativo de la producción de ácido láctico por parte de los cultivos lácticos. El cultivo mixto de los lactobacilos mostró siempre un mayor poder acidificante.

Los valores de viabilidad de los cultivos de L. casei y L. acidophilus frente a la barrera gástrica de pH arrojó valores de viabilidad para ambos lactobacilos entre los órdenes de 105 y 107ufc. mL- 1, aunque en el caso del cultivo de L. casei se observó una disminución de la viabilidad más marcada que la mostrada por L. acidophilus. El análisis de varianza indicó que existen diferencias significativas (p ≤ 0.05) en el número de viables obtenido a los diferentes valores de pH ensayados con relación al control (pH = 4.5). Estas diferencias desde el punto de vista biológico no se consideran invalidantes pues los valores de viabilidad celular, luego de ser sometidos a condiciones drásticas, fueron superiores a los informados como mínimo terapéutico.

Los valores de las medias de la viabilidad obtenida al enfrentar el cocultivo a bilis fresca de cerdoindicaron que la resistencia de los cultivos a la bilis fue buena, aun en presencia del 1 % de bilis como condición extrema, obteniéndose conteos de viables en el orden de 106 y 107 ufc. mL- 1. Aunque debemos señalar que la viabilidad del cultivo de L.acidophilus fue menor a la alcanzada para L.casei. El análisis de varianza de clasificación simple indicó que existen diferencias significativas (p ? 0.05) en los valores de viabilidad celular obtenidos para las diferentes concentraciones de bilis empleadas con respecto a patrón. Aunque los conteos de células viables más altos se obtuvieron con 0.1% de bilis fresca de cerdo, cabe destacar que los valores mas bajos de viabilidad (empleando 1 % de bilis) estuvieron por encima del mínimo terapéutico, lo cual sugiere que ambos lactobacilos fueron capaces de crecer en presencia de concentraciones biliares similares a las que se pueden encontrar en el intestino del cerdo.

Los conteos microbianos obtenidos en la prueba de simulación de la barrera gástrica combinando las condiciones de pH y bilis mostraron que la viabilidad de ambos lactobacilos se mantuvo en el orden de 107ufc. mL-1, la menos afectada fue la del cultivo de L. acidophilus. Es válido destacar, que aunque los valores de las medias de la viabilidad de los lactobacilos bajo éstas condiciones de estrés, resultaron ser significativamente diferentes (p ? 0.05)delcontrol, el resultado es aceptable ya que se mantuvo también en este caso, la viabilidad de las bacterias por encima del valor mínimo terapéutico requerido.

El estudio de la capacidad antagónica de los microorganismos presentes en el producto hacia E. coli, mostró que a las 24 h de incubación se alcanza un 100% de inhibición del patógeno, este resultado coincide con los obtenidos por otros autores.

Para la evaluación de la actividad biológica del suero fermentado en cerdos lactantesse partió de 15 camadas de cerdos lactantes cuyos pesos iniciales se enmarcaron en la media de los valores esperados según las normas establecidas en manual de procedimientos técnicos para la crianza porcina en Cuba (Domínguez, 2006). Los pesos al destete fueron altos en ambos tratamientos experimentales lo cual estuvo relacionado directamente con la edad al destete que fue superior a los 40 días. Se observó que los cerditos que consumieron el suero fermentado alcanzaron un 7 % más de peso vivo que los animales del tratamiento control, aunque el análisis de varianza no arrojó diferencias significativas (p? 0.05) entre los pesos de los animales de ambos tratamientos.

Rodríguez y cols., (1997) obtuvieron un resultado similar al obtenido en este trabajo, cuando aplicaron un cocultivo de L. acidophilusy Streptococcusthermophilusa crías porcinas. El comportamiento sanitario de cerdos en lactancia con el uso del producto en estudio arrojó una mortalidad en los cerdos del grupo control más baja si se toman como referencia los logrados en la crianza porcina cubana en el 2006, que fue superior al 15 % en esta categoría de cerdos (Informe Técnico 2006), estos resultados indicaron un buen manejo en los procedimientos de crianza en la unidad donde se realizó el experimento. Se logró también disminuir en un 50 % el indicador de muerte en esta categoría, lo que demostró de forma clara los efectos beneficiosos de L. acidophilus y L. casei como probióticos en la dieta de cerdos en la etapa de crías. Los resultados expuestos en este trabajo coinciden con los descritos por García y cols. (2006), cuando emplearon L. acidophilus como cultivo probiótico en la dieta de cerdos jóvenes y por Boucourt y cols. (2002) y Brizuela (2003) con el uso de preparados probióticos a partir de L. rhamnosus.

Por otra parte se obtuvo menos animales destetados con bajo peso, indicador de gran importancia en crianza porcina pues facilita la formación de grupos tecnológicos semanales. En el estudio de la incidencia de animales con diarreas en las dos primeras semanas de vida, para el grupo de cerditos tratados los eventos de diarreas no comenzaron a aparecer hasta el cuarto día de vida, mientras que en el grupo control desde el segundo día de vida presentaron cuadros diarreicos. Aunque ambos tratamientos mostraron una tendencia similar el número de cerdos con diarreas fue mayor en el grupo control que no consumieron el suero fermentado, lo que demostró el efecto beneficioso cuando se incluyó este producto en la dieta de los animales. Estos resultados son similares a los informados por García y cols. (2006) cuando utilizaron un producto probiótico elaborado a partir del cultivo de L. acidophilus en la dieta de cerdos, obteniendo una menor incidencia de diarreas y de muertes en los animales tratados con el producto.

Los resultados obtenidos en la alimentación de los cerditos con el suero fermentado (pruebas “in vivo”) confirman la validez de los resultados obtenidos “in vitro” y demuestran que el suero dulce de quesería fermentado con el cultivo mixto de L. casei y L. acidophilus presenta características probióticas. Otro resultado alentador es la mejoría del comportamiento zootécnico e higiénico sanitario de los cerdos hasta el destete, lo cual puede repercutir favorablemente en el incremento de la producción de carne de cerdo.

Referencias

AOAC.Official Methods of Analysis of the Association of Official Chemists.William Horowitz. 15 Ed. Washington. DC, 1990.
Boucourt, R., Savón, L., &Dìaz, J. 2002. Efecto de la actividad probiótica de Lactobacillusrhamnosus en indicadores fisiológicos, productivos y de salud de cerdos jóvenes. XVIII Congreso Panamericano de Ciencias Veterinarias. Palacio de las Convenciones. Ciudad Habana. 135 p.Cuba.
Brizuela, M. A. 2003. Selección de cepas de Bacterias Ácido Lácticas para la obtención de un preparado con propiedades probióticas y su evaluación en cerdos Tesis presentada en opción al Grado Científico de Doctor en Ciencias Veterinarias Universidad Agraria de La Habana. Cuba.
Domínguez, P. L. 2006. Procedimientos técnicos para la criaza porcina. Instituto de Investigaciones Porcinas. MINAGRI. 108 p.Cuba.

García, H. 2004. Obtención de leche fermentada con microorganismos mesófilosprobióticos., Tesis en opción al título de Máster en Ciencia y Tecnología de los Alimentos. Universidad de la Habana.
García, A., Moya, Y., García, H., Beldarían, T., Hernández., U. Lorenzo, A, 2006. Comportamiento de cerdos jóvenes alimentados con una sustancia prebiótica obtenida a partir de Lactobacillusacidophilus. Proyecto 531011 Informe final etapa 06. IIIA. 7p. Cuba.
NC-ISO 4831: 2010. Microbiología de alimentos de consumo humano y animal. Guía general para la enumeración de coliformes. Técnica del conteo de colonias. Método de Referencia. Cuba.
NC-ISO 7889: 2009. Yogurt. Enumeración de microorganismos característicos. Técnica del conteo de colonias a 37ºC. Cuba.
NC: 100: 2014. Microbiología de alimentos de consumo humano y animal. Guía General para la enumeración de levaduras y mohos. Técnica de placa vertida a 25 ºC. Cuba.
Rodríguez, J. C.; Madrigal, A.; Marrero, L.; Quiñones, R.; Reyes, J.; Reyes, F.; Hernández, J.C. y Calero, I. 1997. Evaluación de dos esquemas de tratamiento con bacterias acidificantes en lechones lactantes. Seminario Científico Internacional “Alimentación Alternativa para el Trópico” y IV Encuentro sobre Nutrición de animales monogástricos. Instituto de Ciencia Animal. La Habana 14 p. Cuba.

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