Técnicas diagnósticas para el Síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS): Interpretación.

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El PRRS es una enfermedad viral de gran impacto económico dentro de la porcicultura; se caracteriza por un aumento en las repeticiones del celo en las hembras, abortos tardíos, disminución de la fertilidad, incremento en el número de cerdos momificados, nacidos muertos y débiles; aumento en el porcentaje de mortalidad en lactancia y al destete; 2 a 5 semanas posteriores aparecen los abortos, mortinatos, momias y disminución en el tamaño de las camadas. El período de incubación es de 4 a 7 días en que los cerdos manifiestan anorexia y fiebre.

El virus que causa el PRRS (PRRSV) se ha sido clasificado como un Arterivirus, ARN envuelto. La literatura ha descrito dos características importantes que pueden crear confusión para el diagnóstico serológico de la enfermedad: a) la variabilidad antigénica de la cepas entre diversos virus aislados (europeos y norteamericanos), y b) la presencia aparente de infección persistente durante el período de recuperación. El PRRSV puede detectarse en orina durante 14 días, 42 en saliva y en semen hasta 43 días después de la exposición.



Las pruebas diagnósticas actuales para la detección del virus PRRSV pueden identificar virus viables (aislamiento del virus [VI]), antígenos virales (inmunohistoquímica, inmunoflourescencia directa), ácidos nucleicos virales (reacción en cadena de la polimerasa [PCR], hibridación in-situ) y anticuerpos IgG circulantes
(inmunofluorescencia indirecta, test IDEXX ELISA®, sueroneutralización).


Aislamiento viral (VI)
La recuperación del PRRSV de los tejidos o del suero de animales sospechosos, conlleva una técnica de laboratorio complicada, tardada y costosa. El PRRSV es fácilmente inactivado por temperaturas superiores a la de congelación, así como por la autolisis generada en los órganos y tejidos de los animales afectados y que murieron por esta causa. Por ello se recomienda tomar las muestras (sangre) de animales que estén sufriendo el proceso de manera activa o en su caso sacrificarlos para poder tomar de la mejor manera posible las muestras necesarias ( suero, pulmón, tonsilas.)

El PRRSV se puede aislar en macrófagos alveolares del cerdo o en una línea celular continua derivada de riñones de mono verde africano conocida como células MA-104; sin embargo, el aislamiento de virus es un trabajo intensivo, tiene un bajo nivel de sensibilidad en comparación con la PCR y depende de los virus viables presentes en la muestra. El tiempo de realización del aislamiento puede ir de 8 días a varias semanas de trabajo.

Inmunohistoquímica ((IHQ)

La inmunohistoquímica detecta el antígeno de PRRSV en tejidos fijados con formaldehído utilizando diferentes sistemas de marcado y métodos de detección. Las muestras de elección para ésta técnica son las tonsilas y el pulmón. Es importante señalar que el tipo de fijador utilizado, el tiempo de fijación y el método utilizado para realizar la técnica pueden influenciar los resultados que se obtengan para la misma.

Inmunofluresecencia directa

Prueba rápida y económica. Se utiliza tejido fresco, preferentemente pulmón, el cual se congela a -70 grados centígrados y se hacen cortes finos. Se utiliza un anticuerpo monoclonal contra PRRSV conjujado cpon fluoresceína. La lectura se realiza en un microscopio de inmuinoflourescencia. Prueba específica pero no es altamente sensible, sobre todo si el tejido ha sufrido algo de autolisis.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Esta prueba se emplea para identificar al virus y para caracterizarlo; es más sensible que el aislamiento viral tradicional. Es una técnica altamente sensible y específica. Esta prueba consiste en la amplificación de un segmento del material genético del PRRSV, este segmento es la fracción ORF7 la cual codifica para la producción de la proteína de la nucleocápside y que es detectada de manera visual en una placa de gel de agarosa.

Las muestras más adecuadas para realizar la técnica son: sangre completa, semen (5 ml), raspados de tonsilas orales, tejido linfoide y pulmón; en el caso de sangre se utiliza anticongelante; para los raspados orales se envían los hisopos en tubos con agua peptonada, medio Stuart o infusión cerebro-corazón. Las muestras deben ser remitidas al laboratorio inmediatamente después de haber sido colectadas. Para los casos de órganos y semen deben enviarse en congelación en tanto que la sangre y los raspados de tonsilas orales, en refrigeración. Es importante cumplir con estas indicaciones para que la prueba sea exitosa ya que el virus es muy sensible al calor. Esta prueba es recomendable para la evaluación y/o diagnóstico de reproductores y semen.

Hibridación in situ ( HIS)

la hibridación in-situ (HIS) detecta el ARN del PRRSV en tejido fijado con formaldehído y posee el más alto grado de sensibilidad de todos los ensayos anteriormente mencionados, pero no está disponible de forma rutinaria en la mayoría de los laboratorios diagnósticos.


PRUEBAS SEROLÓGICAS

Ninguna prueba serológica es 100% específica y sensible. Todas las pruebas tienen pros y contras en sus procesos y resultados

La interpretación de los resultados serológicos es uno de los puntos más importantes en el proceso de diagnóstico, por esta razón es importante conocer los fundamentos de cada prueba.

El tomar la muestra representativa es de vital importancia para que los resultados que obtengamos sean representativos y confiables.

En forma general, un muestreo de 30 sueros provee una confianza del 95% cuando suponemos tener una prevalencia de al menos 10%, de acuerdo al siguiente cuadro.


Inmunoensayo enzimatico (ELISA)

Es una técnica indirecta que utiliza un sistema de proporción muestra a positivo (S/P). IDEXX ofrece un kit que tiene la ventaja de utilizar la cepa Lelystad (europea) y una americana del PRRSV, por lo que es una magnifica alternativa para el diagnóstico. Posee una sensibilidad del 95% y una especificidad del 95% además de ser rápida.

La prueba de ELISA IDEXX® es una prueba serológica utilizada rutinariamente en los laboratorios de diagnóstico de todo el mundo. La prueba de ELISA detecta la formación de anticuerpos frente a PRRSV de 9 a 13 días después de la exposición al virus. Los resultados se presentan en forma de proporción de muestra a positivos (s/p) donde niveles de 0,4 o superiores se consideran positivos.

Los animales persistentemente infectados con PRRSV pueden ser serológicamente positivos a la prueba de ELISA durante 56 a 225 días después de la infección. Por lo tanto, la presencia de un anticuerpo en un animal vivo no vacunado, en ausencia de una viremia detectable, es indicativa de una de las siguientes situaciones:

1. El animal está persistentemente infectado con PRRSV presente en un punto tisular.
2. El animal ha eliminado el virus y ya no está infectado
3. Se ha producido un resultado falso positivo debido a un error en la especificidad de la prueba.

Debido a características del PRRSV (períodos de actividad y de reposo; 80% de prevalencia en las piaras) la información serológica de una muestra no es suficiente para diagnosticar PRRSV en la piara. Los resultados positivos pueden o no indicar que PRRSV ha provocado la enfermedad. La serología negativa a PRRSV en una muestra en el tiempo puede tener también tener varias interpretaciones como pueden ser:

  • Los cerdos no están infectados con PRRSV.
  • Los cerdos fueron infectados recientemente con PRRSV pero aún no han seroconvertido.
  • Los cerdos fueron infectados con PRRSV pero son seronegativos.
  • La prueba empleada fue negativa debido a una baja sensibilidad o error de laboratorio.

Por lo anterior, si se realizan serologías únicas para PRRSV, los resultados deben usarse para determinar si la piara ha sido expuesta al virus y no para determinar si hay animales infectados.

El diagnóstico de infección por PRRSV como la causante de falla reproductiva o de enfermedad respiratoria puede lograrse mostrando una seroconversión en muestras subsecuentes .

Qué hacer en caso de un "singleton reactor" a la prueba de ELISA para PRRS

Un "singleton reactor" a la prueba de ELISA para PRRS se define como un único animal que reacciona positivo a ésta prueba dentro de una población que se ha monitoreado.

Las alternativas para confirmar si el animal está infectado o no son las siguientes:






1. Muestrear de nuevo éste animal junto con otros cerdos que estén en contacto para correr de nuevo ELISA ( Es lo más accesible en México).
2. Correr una prueba serológica alternativa como es la IFA o ELISA competitiva.
3. Realizar prueba biológica (inoculación in vivo).

Inmunofluorescencia indirecta

Esta prueba detecta IgG, las que aparecen de 7 a 11 días postinfección, con una producción máxima a los 30-50 días y declina hasta ser detectable alrededor de 4 a 6 meses postinfección.

Esta técnica consiste en poner la muestra del suero sospechoso en contacto con células infectadas por PRRSV, para posteriormente buscar evidencia de la reacción antígeno- anticuerpo mediante la utilización de un anticuerpo contra PRRS conjugado con fluoresceína. Es una prueba rápida, económica y específica (99.5% de especificidad) .

La prueba de IFA sólo puede detectar anticuerpos producidos contra las cepas que se encuentren altamente relacionadas con la cepa que es utilizada en la prueba. En forma general, es necesario realizar dos pruebas simultáneas, una con la cepa norteamericana y otra con la cepa europea.




Prueba por neutralización viral en suero (SVN)

Es una prueba específica, pero de baja sensibilidad. Los anticuerpos detectables por ésta técnica perduran por más tiempo que los detectables por IFA y ELISA. No es una prueba muy utilizada en la actualidad, debido al costo de realización y al tiempo de respuesta para los resultados.

Para una evaluación diagnóstica definitiva de PRRSV con respecto a infección actual se sugiere que la información serológica sea interpretada en combinación con los resultados de histopatología, microbiología e historia clínica.

 
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