Extractos naturales de Zacate de limón (Cymbopogon citratus) y Hierba de San Juan (Hypericum perforatum) como conservadores de semen porcino

Introducción

Actualmente, los porcicultores alrededor del mundo han implementado la técnica de IA obteniendo resultados satisfactorios, debido a que, como describen Quintero-Moreno et al. (2016) esta consiste en “incorporar métodos de cría de una mayor eficiencia y rentabilidad, aumentando la productividad con una reducción de costos” lo cual, ha motivado que en la actualidad el 90% aproximadamente de las cerdas en producción a nivel mundial hayan sido sometidas a la IA con semen diluido y refrigerado (da Costa et al., 2011), esto debido a que, al realizar dicho proceso, se obtiene un mayor porcentaje en fertilidad, mejora genética, disminución en trasmisión de enfermedades así como, el rendimiento de las dosis seminales reduciendo el costo de producción (Knox, R. V.,2016).

Dicha técnica fue utilizada por Ivanov en animales domésticos de granja a finales de siglo XIX. Posteriormente, dicha técnica fue perfeccionada por Milanov en el año de 1938 con el uso de diluyentes seminales para semen de toro los cuales, estaban compuestos principalmente de glucosa, sulfato de potasio y una baja cantidad de electrolitos, lo cual, permitía su conservación en un rango de temperatura entre los 7 y 20 °C. Sin embargo, el uso de dichos diluyentes en varias especies animales provocaban una baja viabilidad seminal y por consecuencia una baja fertilidad y prolificidad una vez inseminada la hembra. No obstante, fue hasta 1980 con el desarrollo de diluyentes específicos, para semen de cerdo de corta duración como lo es, Betsville Thawing Solution (BTS) que dicho conservador fue implementado en granjas porcinas (Rodríguez-Gil y Estrada, 2013).

Con el paso del tiempo, los conservadores seminales se fueron perfeccionando hasta los que se conocen actualmente, cumpliendo los requerimientos básicos necesarios para brindar una vida media útil al espermatozoide. Sin embargo, a pesar de que éstos logran una conservación espermática de 3 a 7 días aproximadamente, se ha observado daño a dicho esperma debido al deficiente manejo que se emplea desde su recolección hasta su conservación, ocasionando su muerte lo cual, libera radicales libres provocando especies reactivas al oxígeno generando apoptosis celular (Funahashi, H. y Sano, T., 2005).

Existe escasa información en la literatura sobre la incorporación y aprovechamiento de agentes antioxidantes para una mejor viabilidad espermática. Tomando en cuenta que, los espermatozoides de cerdo son altamente susceptibles a la peroxidación lipídica, así como, a la capacitación temprana dichos antioxidantes pueden favorecer la disminución de radicales libres logrando una mayor estabilidad de estos en el medio de dilución. De acuerdo a lo reportado por Valdebenito, N. (2007), el uso de la cafeína en el agua de Truchas Arcoiris (Oncorhynchus mykiss) duplicó la motilidad espermática aumentando la fertilidad. Por otra parte, el uso de fumarato de magnesio en las dosis seminales logró incrementar la viabilidad seminal del cerdo, así como, la adición de ácidos grasos poliinsaturados en el alimento mejorando las características espermáticas. Por otro lado, se ha hecho uso de extractos naturales en las dosis seminales como lo menciona Desroches, N.R. et. al. (2005), empleando Lowbush blueberries (Vaccinium angustifolium Aiton) mostraron retrasar la capacitación espermática aproximadamente una semana. Esto debido al contenido de polifenoles en las hojas de las plantas, así como, en sus frutos, que derivan en flavonoides liberando sus propiedades antioxidantes atribuidas a la combinación de anillos aromáticos y grupos hidroxilos, los cuales ensamblan sus estructuras químicas neutralizando los radicales libres en los lípidos (Martínez-Flórez, S., et al., 2002, Kumar, S. and Pandey, A.k., 2013).

Es por esto que, se propone el uso de extractos naturales como Cymbopogon citratus e Hypericum perforatum debido a su alto poder antioxidante logrando proteger la membrana espermática y, concentración de azúcares, los cuales proporcionan energía y alimento al espermatozoide por un periodo de tiempo prolongado. Dicha metodología traerá consigo grandes beneficios como lo son, la disminución del costo de producción por dosis seminales y, facilidad de la obtención de dichos extractos para su uso sustituyendo los diluyentes comerciales de corta duración para su posterior implementación en la inseminación artificial (IA).

Materiales y Métodos

Muestras de semen

Las muestras seminales fueron obtenidas una vez por semana mediante la técnica manual de mano enguantada (n=3) de un semental Yorkshire de año y medio de edad alojado en un corral de piso de cemento de 51 m², bebedero y comedero adecuados, esto adaptado a los protocolos de bienestar animal. Previo al inicio del estudio se realizaron pruebas bacteriológicas en sangre y dosis seminales, así como, se analizaron niveles de inmunogoboulinas A (IgA) e Inmunoglobulinas G (IgG). El volumen de las dosis se determinó mediante una probeta graduada con una precisión de 0.05 ml. La viabilidad de las dosis seminales se evaluó mediante fluorescencia empleando el equipo Seminal Quality System (SQS® Zoitech Lab).

Síntesis de las muestras

Extractos naturales

Para el desarrollo de los extractos naturales se utilizó té comercial de Cymbopogon citratus (Lagg’s®) e Hypericum perforatum previamente deshidratada los cuales, fueron seleccionados por sus propiedades antioxidantes. Dichos extractos, se realizaron colocando un sobre de té de limón o 1 gr de Hierba de San Juan respectivamente en 50 ml de agua bidestilada a una temperatura de 50 °C durante 30 minutos. Posteriormente, se dejaron reposar a temperatura ambiente durante una hora aproximadamente.

Finalmente, para el grupo control, se preparó una solución de diluyente comercial de corta duración BTS (Zoitech Lab®) en un litro de agua bidestilidad en agitación constante durante 30 minutos.

Las disoluciones seminales en los diferentes sistemas se realizaron colocando 5 ml de semen puro recién recolectado con tres diferentes concentraciones (0.250, 0.125 y 0.0625 µL) de cada solución a una temperatura de 37 °C. Las muestras fueron almacenadas a 17 °C y analizadas durante 3 días consecutivos (0, 24, 48 y 72 horas).

Pruebas antioxidantes de los extractos naturales mediante DPPH* (2,2-difenil-1- picrylhydrazyl)

Para la determinación de la actividad antioxidante se preparó una solución de DPPH* de 180 μM en metanol al 80% para lo cual, se pesaron 1.775 mg de DPPH* en un matraz volumétrico de 25 ml y se aforó con metanol al 80%, posteriormente, el antioxidante sintético de referencia, Trolox (ácido-6-hidroxi-2, 5, 7, 8-tetrametilcroman-2-carboxílico), se preparó pesando 10 mg de este en 25 mL de metanol al 80% obteniendo una concentración madre de 1600 µM para la realización de la curva de calibración, para sus posteriores disoluciones y, finalmente, partiendo de la solución madre se realizaron las siguientes concentraciones, las cuales fueron preparadas en frascos ámbar por separado como se muestra en el cuadro 1.

Cuadro 1. Concentraciones para la realización de la curva de calibración.

Para la preparación de las muestras, se tomaron 20 µL de cada extracto y se colocaron en una microplaca de 96 pocillos, posteriormente se agregaron 260 µL de DPPH y, finalmente se leyeron a 510 nm cada 5 minutos durante 120 minutos.

Determinación de azúcares totales mediante Cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC)

Para la determinación de azúcares totales las muestras de los extractos naturales se centrifugaron a 10, 000 rpm durante un periodo de 10 minutos para sedimentar los sólidos suspendidos en cada solución y facilitar su filtración. A continuación, estas se pasaron por cartuchos Sep-Pak C18 Waters, los cuales fueron reactivados previamente tomando 3 ml de metanol grado y 6 ml de agua grado HPLC. Finalmente, la muestra fue filtrada con una membrana tamaño de poro 0.45 µm (Millipore).

Se utilizó un módulo de separación Waters Alliance® e2695 y un detector de índice de refracción Waters Alliance® 2414. Se empleó una columna Bio-Rad Fermentation Monitoring (150 x 7.8 mm), agua grado HPLC como fase móvil a un flujo de 0.8 ml/min a 60 ºC. Para la adquisición de los resultados obtenidos se utilizó el software Empower Pro.

Análisis estadístico

Se utilizó un diseño experimental completamente al azar donde se evaluaron 3 tratamientos con 3 repeticiones cada uno, integrado por el grupo control; semen diluido con BTS. Tomando en cuenta como variables las concentraciones de Zacate de limón y Hierba de San Juan (0.250, 0.125 y 0.0625 µl). Se empleó el paquete estadístico Minitab 18® y los datos obtenidos de los tratamientos se compararon mediante la prueba de Fisher con una confianza del 95% ya que, existen diferentes marcadores para cada objeto estudiado.

Resultados y Discusión

DPPH*

Dicho método se utilizó para determinar la capacidad antioxidante de los extractos naturales, los cuales donan protones estabilizando dichos radicales libres (RL), como consecuencia de las sustancias antioxidantes presentes en ellas. El proceso de la reacción se midió espectrofotométricamente a 510 nm y los resultados se expresaron en % inhibición.

Se realizó un estudio de la cinética de la capacidad antioxidante de los extractos de Zacate de limón y Hierba de San Juan durante un periodo de tiempo de 120 minutos haciendo dichas mediciones cada 5 minutos con una triple repetición. En la gráfica 1, se muestran los resultados de la evolución de las propiedades antioxidantes de dichos extractos utilizados donde, hierba de San Juan tardó aproximadamente 30 minutos en estabilizarse llegando a un 87% de inhibición, lo que indica una mayor estabilidad en un menor tiempo, en comparación con el té de limón, el cual tardó 40 minutos para estabilizarse llegando a un 82% de inhibición por lo que, coincide con lo reportado por Silva et al., en 2004.

Gráfica 1. Resultados de la evolución de las propiedades antioxidantes de los extractos naturales, en la cual, la línea punteada pertenece a hierba de San Juan y las figuras romboides a té de limón.

HPLC

Debido a la importancia del contenido energético en los conservadores seminales, en este caso, para semen de cerdo, los cuales brindan un mejor funcionamiento espermático permitiendo mantener el metabolismo celular y el movimiento del flagelo brindando una motilidad adecuada elevando la tasa de fecundación una vez realizada la IA, en la presente investigación, se seleccionó el uso de dos diferentes extractos naturales con una concentración mínima tanto de glucosa como de fructosa generando un aporte de energía a dichos espermatozoides.

Los cromatogramas obtenidos muestran la identificación de los azúcares, basándose en la comparación de los tiempos de retención de los compuestos con los determinados a partir de estándares de glucosa y fructosa (Sigma-Aldrich®). Cada pico refleja la separación física de cada uno de los componentes de la mezcla. El tiempo de retención (RT) para la glucosa corresponde a 3.78 minutos, mientras que para fructosa es de 4.14 minutos.

Tal es el caso, como se observa en la gráfica 2 para el extracto de Hierba de San Juan la concentración tanto de glucosa como de fructosa se encuentran por debajo del límite de cuantificación por otro lado, para Zacate de limón el contenido de fructosa no fue relevante debido a sus bajas concentraciones, sin embargo, para el caso de glucosa se obtuvieron 0.558 g/L, la cual brinda una energía espermática favorable para su conservación (gráfica 3). Dichos extractos, fueron diluidos y suplementados en concentraciones especificas a las fracciones seminales establecidas, observando una viabilidad aceptable durante 48 horas consecutivas, siendo comparados con el grupo testigo, en el cual se utilizó BTS debido a su alto contenido en glucosa ya que, como reporta Gadea, J. (2003), la adición de fructosa a dichos diluyentes no resulta favorecedor en la conservación seminal a corto y largo plazo.

Gráfica 2. Se observa el pico correspondiente a fructosa de hierba de San Juan bajo el límite de cuantificación a un tiempo de liberación de 4 min.

Gráfica 3. Se observa el pico correspondiente a glucosa en té de limón, la cual se encuentra bajo el límite de cuantificación a un tiempo de liberación de 3.7 min.

SQS

Las dosis seminales obtenidas fueron evaluadas al momento de su recolección y, después de su dilución con los extractos naturales y BTS como grupo testigo utilizando el equipo SQS. La preparación de la muestra para su evaluación consistió en 20 µL de semen previamente diluido en dichos extractos o BTS (1:9) en una tinción de fluorescencia, por último, se colocó en un portaobjetos específico de cuatro cámaras y se introdujo al equipo para su posterior lectura.

Según lo reportado por Del Valle Rodríguez, A. (2017) los parámetros adecuados para una viabilidad seminal aceptable para su posterior uso en IA deben ser superiores al 70%. En la tabla 1 se muestran los resultados del análisis de las dosis seminales, en este caso, se obtuvo una viabilidad mayor del 70% en el tiempo 0 y 48 horas para la mayoría de los extractos como para BTS, exceptuando la concentración de Zacate de Limón de 0.250 µl de 64.6%. Posteriormente, en un lapso de 48 a 72 horas se puede observar un decaimiento gradual para BTS y Zacate de Limón en sus tres concentraciones llegando hasta un 55%. Por tal motivo, es posible el uso de dichos extractos ya que, en el análisis estadístico realizado existe una diferencia significativa en dichos porcentajes obtenidos respecto al uso de BTS para las tres diluciones en los periodos de tiempo de 0 a 72 horas, así como, un promedio de viabilidad superior al 70%, siendo una alternativa de menor costo y de fácil acceso para la realización de diluciones seminales, así como para su conservación durante tres días consecutivos debido a su poder antioxidante y azúcares totales.

Extractos naturales de Zacate de limón (Cymbopogon citratus) y Hierba de San Juan (Hypericum perforatum) como conservadores de semen porcino - Image 1

Conclusión

El uso de extractos naturales como sustitutos de diluyentes comerciales para semen de cerdo, puede ser una nueva alternativa para su preservación debido a sus características por un periodo de tiempo de 72 horas. La implementación de este nuevo método de conservación en producción porcina abre una nueva línea de investigación.

Guerrero-Guzmán, Andrea*¹, Villarreal-Pavón, Fabiola², Zamudio-Ojeda, Adalberto³, Velázquez-Juárez, Gilberto⁴, Ramos-Ibarra, Roberto⁵, Sánchez-Chiprés, David^*1,6
¹Posgrado Maestría Interinstitucional en Producción Pecuaria, Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Universidad de Guadalajara, México
²Licenciatura en Medicina Veterinaria y Zootecnista, Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Universidad de Guadalajara, México
³Departamento de Física, Centro Universitario de Ciencias Exactas e Ingeniería, Universidad de Guadalajara, México
⁴Departamento de Química, Centro Universitario de Ciencias Exactas e Ingeniería, Universidad de Guadalajara, México.
⁵Departamento de Farmacobiología, Centro Universitario de Ciencias Exactas e Ingeniería, Universidad de Guadalajara, México.
⁶División de Ciencias Veterinarias, Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Universidad de Guadalajara, México.
*Autor responsable y de correspondencia: Andrea Guerrero Guzmán y David Sánchez Chiprés, Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Camino Ramón Padilla Sánchez 2100, Nextipac, 44600 Zapopan, Jal.

Extractos naturales de Zacate de limón (Cymbopogon citratus) y Hierba de San Juan (Hypericum perforatum) como conservadores de semen porcino

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