Evaluación de la eficacia, transmisión y replicación de una vacuna viva lapinizada contra la Peste Porcina Clásica

La Peste Porcina Clásica (PPC) es una enfermedad viral altamente infectocontagiosa caracterizada por producir un cuadro clínico complejo en los cerdos; que dependiendo de la edad, su estado inmune y características propias del virus, puede tener un desenlace fatal, llevando a la muerte a un alto porcentaje de los cerdos afectados. Los animales que logran sobrevivir pueden desarrollar infecciones crónicas a veces imperceptibles, que los retrasan en su crecimiento y que muchas veces se convierten en portadores y fuente de infección para los animales susceptibles.

La PPC está considerada como una de las patologías prioritarias transfronterizas de la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE), en la categoría de las enfermedades de los suidos debido a su gran poder de distribución, ya que puede extenderse más allá de las fronteras entre países, trayendo como consecuencia el cierre de comercio dentro y fuera de los países afectados de productos cárnicos y derivados de la producción porcina, así como animales vivos. Además, es de carácter obligatorio la notificación de cualquier caso investigado y confirmado, por parte de las autoridades sanitarias de cada país a la OIE (Blood et al., 1988; Moennig y Edwards et al., 2000). 

La primera descripción de la enfermedad fue en 1810 en Tennessee, Estados Unidos de Norteamérica, aunque algunos autores afirman que posiblemente se presentó por primera vez en Francia en 1822. Más tarde se detectó en 1830 en el estado de Ohio en Estados Unidos de Norteamérica, trasladándose a Inglaterra en 1862, extendiéndose a los países escandinavos y después al resto de Europa. En 1903 De Schweinette y Dorset (citado por Blood et al., 1988) confirmaron la etiología viral de la enfermedad.

Muchos son los procedimientos que se han utilizado para combatir esta enfermedad en diferentes países, utilizando tanto vacunas inactivadas simultaneadas con suero como vacunas vivas atenuadas. Baker en 1946, logró obtener una mutante menos virulenta, haciendo pases seriados en conejos la cual fue utilizada en la elaboración de distintas vacunas que resultaban más antigénicas, pero que no eran totalmente inocuas y tenían que utilizarse simultáneamente con suero. A partir de los años 60 las vacunas vivas utilizadas, tanto lapinizadas por sucesivos pases en conejo como otras cepas atenuadas propagadas en cultivos celulares, han tenido particular importancia. Las vacunas lapinizadas fueron mejoradas a mediados de los 60 utilizando ya cepas totalmente lapinizadas y carentes de efectos teratógenos, las cuales han permitido conjuntamente con otras obtenidas por pases en cultivos celulares, la eliminación de la enfermedad de los países de la actual Unión Europea entre los años 1970 y 1980 (Aynaud, 1988). 

Se han desarrollado cinco vacunas vivas modificadas denominadas: cepa China “C” lapinizada (Terpstra et al., 1990), cepa “C” atenuada en cultivo de células RK-13 (Rivero et al., 1988), cepa Japonesa (GPE-) atenuada mediante pases en células de ratón (Nishimori et al., 1996), la cepa francesa Thiverval (Aynaud y Launais, 1978) y la cepa PAV-250, atenuadas en células PK-15. 

Recientemente, varios tipos de nuevas vacunas han sido desarrolladas, como son la vacuna E2 basada en un péptido sintético, vacuna de subunidades, vacunas de vectores a virus vivo y vacunas genéticas. Estas vacunas pueden conferir parcial o completa protección frente al virus de desafío, pero son inferiores a la cepa China, especialmente en prevenir la excreción y distribución de los virus virulentos.

La historia de la obtención y estudios realizados a la cepa China (cepa vacunal contra la PPC) data de varias décadas:

1940 – 1951: Se obtuvo dos cepas atenuadas de PPC (cepa Rovac de USA y cepa SFA de Inglaterra) que procedían de conejos tras varios pasajes seriados, (Baker 1946). 

1950 – 1957: Un grupo chino desarrolló una vacuna lapinizada contra la Peste Porcina, ahora conocida como "cepa C", la cual fue generada después de cientos de pasajes seriados en conejos utilizando la vía parenteral. 

1960: La vacuna obtenida a la que se le llamó vacuna lapinizada contra la Peste Porcina fue introducida en los países cercanos a China, por ejemplo, algunos países del este Europeo y fue rápidamente propagada en todo el mundo utilizándose muchos alias, como "K", "CL" y "CL" (cepa china lapinizada). Actualmente este tipo de vacuna ha superado la prueba durante medio siglo y ha ganado un lugar permanente.

1963: Fue aprobada en Hungría una cepa adaptada a conejos procedente de China, que por no tener virulencia residual podía ser aplicada sin suero teniendo una alta capacidad antigénica (Bognar et al., 1963). 

1966 - 2001: Investigadores de varios países realizaron estudios con la cepa China lapinizada, demostrando que es muy segura y generalmente inocua, no revierte virulencia y no hay transmisión vertical (Bran et al., 1966; Bran et al. 1971; Terpstra, 1978; Kojnok et al., 1980; Precausta et al,. 1983; Wang, 1996; Aynaud 1988; Qiu 1999, 2006; Lorena et al., 2001). 

2001 – Hasta la fecha: Se han continuado los estudios moleculares iniciados a finales del 90 a animales inmunizados con la cepa China producida en conejos o cultivos celulares. 

La cepa que se utiliza en la actualidad no presenta virulencia residual, siendo totalmente apatógena incluso para madres gestantes y lechones. Tiene una rápida actividad protectiva al inducir inmunidad y presenta interferencia viral con el virus patógeno. La vacuna se ha caracterizado por su alta eficacia, confiriendo a los animales una inmunidad de amplio espectro en algunas ocasiones de por vida; protección consistente tanto en inmunidad celular como humoral, contra genotipos y subgenotipos del virus. Los anticuerpos maternos derivados de la inmunización de las madres pueden conferir sólida protección a la progenie; pero se ha probado la inhibición de esta actividad en animales vacunados con la cepa China por la interferencia de anticuerpos maternos. 

En Cuba la PPC o Cólera Porcino fue reportado inicialmente en la década del 30 y se piensa que pudo haber sido introducida de cerdos importados desde los EUA según Frías-Leporeau en el 2002, sin embargo en el año 1928 se hablaba de esta patología, incluso existía una legislación sobre Cólera Porcino a través del Decreto Presidencial No. 1,103 del 9 de junio de 1928 donde se establece en todo el territorio de la república la inmunización anticolérica de los cerdos que se encuentran destinados a la crianza. Cuba es uno de los países en la región del Caribe donde se han descrito múltiples brotes de PPC, siendo considerado un país con PPC endémica que presenta una población de más de 2 millones de cerdos.

De 1974 a 1992 hubo un silencio epizoótico hasta que ocurre la reemergencia de la enfermedad, que tuvo gran importancia desde el punto de vista económico. Durante el periodo de 1993 a 1997 se informaron más de 400 brotes, ocurriendo principalmente en las provincias del este y oeste de la isla, reapareciendo primeramente en el Occidente y extendiéndose paulatinamente a casi todas las provincias del país, coincidiendo con la crisis económica a raíz de la caída del campo socialista que conllevó a graves afectaciones en las unidades de crianza especializada. Según datos de la OIE, la enfermedad se volvió a detectar en Cuba el 12 de octubre del año 2001 y el resurgimiento de la enfermedad a partir de 1993 después de casi 20 años de silencio epizoótico, generó múltiples interrogantes acerca del origen del brote. 

En estudios filogenéticos realizados por investigadores cubanos entre los años 1999 y 2005 (Díaz de Arce et al., 1999, 2005, y Perera et al., 2005), con la secuencia completa del gen de la proteína E2 de aislamientos cubanos, se demostró claramente que los mismos forman un clúster independiente, ubicados en el subgenotipo 1.2. Más recientemente se ha publicado que aislados cubanos del 2009, 2010 y 2011 que fueron comparados con la cepa de desafío de la vacuna cubana, cepa ''Margarita '' que fue aislada en 1958, caracterizados a nivel molecular, están estrechamente relacionados filogenéticamente a la misma. Probablemente debido a la posición de Cuba como isla, no se ha producido ninguna introducción indirecta de los países vecinos e igualmente de otras partes del Sur y Centroamérica. El VPPC que circula en Cuba pertenece a un único subgenotipo que no se reporta fuera del archipiélago cubano. Tomando en consideración los resultados del análisis de la secuencia de la proteína E2 así como las de las regiones no terminales 5'NTR-E2, se demuestra que los aislados cubanos forman un nuevo subgenotipo que se propone ser designado como subgenotipo 1.4 (Postel A. et al., 2012).

Evaluar la eficacia, transmisión y replicación de la vacuna viva lapinizada contra la Peste Porcina Clásica.

Se utilizó un lote de vacuna contra la PPC (Lote 12041) producido en la Empresa Productora de Vacunas Virales y Bacterianas (EPVVB) del Grupo Empresarial LABIOFAM, Cuba, utilizando la cepa China lapinizada. El lote fue envasado en bulbos de vidrio transparentes, de 50 mL, calidad hidrolítica II, con tapón de goma con dos espigas de 20 mm y casquillo de aluminio de 20 mm. Cada bulbo contiene 50 dosis y el volumen de la pastilla liofilizada es de 6,3 mL.

El lote del biológico previo a su utilización fue caracterizado desde el punto de vista organoléptico, microbiológico, seguridad y eficacia, comprobándose que cumplía con los requisitos de calidad que se establecía en su tecnología de producción. Sensorialmente la apariencia y el color de la pastilla que se formó al ser liofilizado el producto era porosa y uniforme siendo de color rojo brillante en la superficie, cumpliendo con el requisito de esterilidad pues no hubo crecimiento fúngico y bacteriano. Además resultó inocuo y eficaz cumpliendo con las 100 DP50%, establecidos en el ensayo de Potencia. Los bulbos de vacuna fueron resuspendidos en un volumen de 50 mL con solución salina estéril (suero fisiológico estéril, Braun), para aplicar 2 mL por animal en estudio, correspondiendo a una dosis vacunal. 

Virus de desafío: Cepa Margarita VPPC, cuyo aislamiento se obtuvo en 1958 en La Habana. Esta cepa se amplificó mediante infecciones experimentales en cerdo y posteriormente se tituló en la misma especie (DL50), perteneciendo al subgenotipo 1.4 y utilizándose con un título de 105 dosis infectiva media (DICT50%). 

Cepa C lapinizada, (Pestiffa, Merial) utilizada como control positivo.
Cepas de referencia: Brescia y Thiverval.
Cepa de referencia de VPPC: Alfort 187 (CSF 0902)

Cerdos domésticos de 6 semanas de edad (Seronegativos a VPPC, VDVB y VBD) de la raza Landrace x Large White. Se trabajaron teniendo en cuenta las exigencias instituidas en el Comité Ético de Experimentación Animal diseñadas en el Centro de Investigación de Sanidad Animal de Barcelona, según los requerimientos implantados en la Comisión de Experimentación Animal de Cataluña la cual sigue los requisitos previstos en el Real Decreto 1201/2005. 

Kit de ELISA de bloqueo para la detección de anticuerpos frente a la glicoproteína E2 del VPPC (IDEXX).
Kit de PrioCHEK® CSFV Ab 2.0, ELISA para detección in vitro de anticuerpos contra el virus de la PPC en suero y plasma porcino. Prionics Lelystad B. V.
Kit NucleoSpin® RNA Virus (Macherey-Nagel), para la extracción del ARN viral. 

R_C strain: 5´-GGCCTAGATGGTTGCCG-3´
F_C strain: 5´- CCACGGGGAGACCATTGTTC-3´
Sonda 5´- 6FAM-TGATAGGGGTAGAGGCAACATTAAAACAAC-3´-BHQ1
Oligo directo: CSF-100F: 5´-ATGCCCAYAGTAGGACTAGCA-3´
Oligo reverso: CSF-192R: 5´- CTACTGACGACTGTCCTGTAC-3´
Sonda CSF-1: 5´-FAM- TGGCGAGCYCCCTGGGTGKTCTAAGT-TAMRA-3´

Línea celular PK-15 (ATCC Ref. CCL-33-USA).

MEM- E (GIBCO®-USA)
Medio de cultivo (RPMI, Gibco)

Soluciones: Las soluciones y tampones necesarios se prepararon de acuerdo a las siguientes formulaciones:

PBS-Tween: Solución de lavado, tween-20 al 0.05% (SIGMA, EE.UU.), disuelto en PBS.
Solución anticoagulante: EDTA 0.342 mol/L, pH 7.2.
Tripán azul: Colorante para el conteo de células, Tripán azul 5 g/L (SIGMA, EE.UU.), NaCl 8.5 g/L (Merck, Alemania). 

Primeramente se realizó la normalización de la técnica de RT-PCR en tiempo real basada en sonda Taqman para la detección de ARN de cepas vacunales lapinizadas de VPPC, considerándose como resultados positivos la emisión de fluorescencia (CT por sus siglas en inglés) igual o menor que 42. Las muestras en las que la fluorescencia era indetectable fueron asumidas como negativas. Los valores de CT entre 10 y 23 se contemplaron como alta carga de ARN viral; del 24 al 29 moderada y 30-42 baja carga de ARN viral (Liu et al., 2011). 

Como paso previo a la reacción de qRT-PCR, se procedió a la extracción del ARN viral mediante el kit NucleoSpin® RNA Virus (Macherey-Nagel) siguiendo las instrucciones del productor. Como control positivo se incluyó la cepa C lapinizada, (Pestiffa, Merial) utilizando la dosis/cerdo recomendada por el fabricante. Para comprobar la especificidad se incluyeron las siguientes cepas de referencia: Brescia, Alfort 187, Margarita y Thiverval. Además se incluyeron muestras de control negativo (1 cada 9 extracciones).

Se efectuó un análisis de la sensibilidad de la técnica (Liu et al., 2011) en las condiciones de normalización y con los virus utilizados en este estudio. Con este fin, se utilizaron las siguientes cepas:

1 Pestiffa (Merial), que fue seleccionada como control positivo del ensayo. 

2 La cepa Margarita adaptada a cultivos celulares (Ganges et al., 2005).

Con el propósito de conocer la capacidad de detección de la técnica de RT-PCR en tiempo real utilizada (Liu et al., 2011) se incluyó la cepa china procedente de LABIOFAM en el estudio de sensibilidad. Se realizaron diluciones seriadas en base 10 partiendo del material puro para cada cepa vírica y cada una de ellas diluidas desde la dilución 10 -1 a 10 -6, además de los respectivos controles negativos del ensayo y de extracción de ARN. 

Animales empleados en el ensayo: Se dividieron en tres grupos, el primero se colocó en el box 1 con 18 cerdos domésticos de seis semanas de edad (Seronegativos a VPPC, VDVB y VBD) de la raza Landrace x Large White. El 2do grupo de 14 cerdos con las mismas características y origen que los del primer grupo, se agruparon en dos boxes.

Vacunación: De los 18 cerdos del primer grupo se vacunaron 16 animales, identificados del 1 al 16 (dos cerdos extra se utilizaron como controles negativos no vacunados (17 y 18). La vacunación, toma de muestra y sacrificio fueron realizados según se refleja en la figura 1. Los animales fueron sacrificados a razón de dos cerdos de forma seriada a los 4, 8, 12, 17, 22, 26 y 30 dpv. 

Figura 1. Esquema de inmunización previsto para los animales del estudio con la vacuna cubana contra la PPC, elaborada en LABIOFAM.

Del segundo grupo se vacunaron 7 animales identificados del 19 al 25 y 7 se inocularon con 2 mL de suero fisiológico estéril (Braun) dejándose como contacto de los vacunados (identificados del 26 al 32), según aparece en la figura 2.

 

Figura 2. Esquema de inmunización y desafío previsto para los animales del estudio con la vacuna cubana contra la PPC, elaborada en LABIOFAM. 

Todos los animales se vacunaron por vía intramuscular en el músculo del cuello lado derecho, a razón de 2 mL por cerdo. 

Paralelamente al experimento se incluyó un tercer grupo de cerdos no vacunados identificados del 33 al 38, que se mantuvieron en un box diferente del animalario de nivel de bioseguridad 3 que se utilizaron como controles para el seguimiento de la infección de la prueba de desafío vírico. 

El desafío se realizó a los 16 dpv a 11 cerdos del 2do grupo (6 vacunados: 20-25) y cinco contactos: (del 28-32) con 105 DICT50 del virus Margarita. Dos cerdos no fueron desafiados y se sacrificaron a 16 días post vacunación (antes del desafío): un cerdo del grupo vacunado (número 19) y dos cerdos del grupo no vacunado (26 y 27).

Se efectuó un seguimiento clínico diario y se registraron los signos y síntomas desarrollados, utilizando un sistema de valoración clínica. 

En la evaluación de los signos clínicos se realizó una puntuación de 0 a 7 de la siguiente manera: 

0: sin síntomas
0-uno: Fiebre (de leve a alta, pero solamente fiebre)
2: Fiebre alta además de signos clínicos leves
3: Signos clínicos leves-moderadas y ausencia de trastornos nerviosos
4: Ligeros trastornos nerviosos y otros síntomas clínicos moderados (distintos a los nerviosos)
5: Trastornos nerviosos graves y presencia o no de otros síntomas clínicos, de moderados a graves o Postración.
6: Signos clínicos graves (incluyendo trastornos nerviosos graves)
7: Muerte.

Por razones éticas, se realizó la eutanasia, cuando la puntuación clínica alcanzó un valor de cinco o superior.

Recolección de muestras: Se colectaron muestras de: Hisopos nasales (HN), Hisopos bucales (HB), Hisopos rectales (HR), sueros y órganos como tonsilas, linfonodo pre-escapular (punto de inoculación), pulmón y riñón. 

Técnicas de ensayo empleadas: Se usaron técnicas para la detección del antígeno viral y detección de Anticuerpos (Ac). 

Como paso previo a la reacción de qRT-PCR, se procedió a la extracción del ARN viral mediante el kit NucleoSpin® RNA Virus (Macherey-Nagel) siguiendo las instrucciones del fabricante. Como control positivo se incluyó la cepa C lapinizada, (Pestiffa, Merial) aplicando la dosis/cerdo recomendada por el fabricante. 

Mezcla de reacción (1X) (AgPath-ID One Step RT-PCR kit. Ambion)
Buffer 2X -----    10ul
Enzima -----    0.8ul
Oligo Reverso: R_C strain a 20uM -- 1ul
Oligo Directo: F_C strain: 20uM   --   1ul
Sonda C strain: 20uM -----    0.75ul
Agua ------- 3.45ul
17ul mix/pocillo +  3ul RNA problema

Marcador MGB FAM (NONE)
Termo perfil
45ºC ----------- 20min
95ºC ----------- 10 min

95ºC ----------- 15 seg
59ºC ---------  30 seg*           45 ciclos
72ºC ---------  30 seg

*(paso de lectura de la fluorescencia)

Para comprobar la especificidad se incluyeron las mismas cepas de referencia utilizadas en la normalización, incluyendo la cepa de desafío Margarita adaptada a cultivos celulares (Ganges et al., 2005), que es la cepa que ha circulado en Cuba originando la epizootia de PPC del 1993 y que continúa en la actualidad (Díaz de Arce et al., 1999; Díaz de Arce et al., 2005; Pérez et al., 2012), así como muestras de control negativo (uno de cada nueve extracciones).

Con el propósito de conocer la capacidad de detección de la técnica de RT-PCR en tiempo real utilizada, se incluyó además la cepa vacunal lapinizada procedente de LABIOFAM en el estudio de sensibilidad. Se realizaron diluciones seriadas en base 10 partiendo del material puro para cada cepa vírica e introduciéndose en el ensayo las cepas puras y cada una de ellas diluidas desde la dilución 10 -1 a 10 -6. Se intercalaron además los respectivos controles negativos del ensayo y de extracción de RNA, realizándose un análisis de la sensibilidad de la técnica en las condiciones de normalización y con los virus utilizados en este estudio. 

Con la finalidad de conocer la interferencia en el diagnóstico del ARN del virus vacunal con la técnica molecular validada para el diagnóstico de VPPC, se desarrolló la técnica de RT-PCR en tiempo real según Hoffman et al., 2005. 

MIX(1X) ((TaqMan One Step RT-PCR de Applied Biosystem)
Master Mix ---------   12.5 ul
Enzima RT -----    0.625ul
Oligo Reverso: CSF-192R a 20 uM -- 0.75ul
Oligo Directo: CSF-100F a 20 uM    -- 0.75ul
Sonda CSF-probe1 a 10uM --    0.25ul
Agua ---- 5.125ul

Marcador FAM -TAMRA
Termo perfil
50ºC ----------- 30min
95ºC ----------- 15 min

94ºC ----------- 15 seg
57ºC ---------   30 seg*           42 ciclos
68ºC ---------   30 seg

*(paso de lectura de la fluorescencia) 

Se analizó la respuesta humoral de anticuerpos totales conferida tras la vacunación con la vacuna cubana contra la PPC y para ello, se procesaron los sueros colectados mediante la técnica de ELISA para la detección de anticuerpos totales frente a la E2 del VPPC siguiendo las instrucciones del kit comercial: IDEXX, referencia: 99-43220, 304000, Lote: Z571, caducidad: abril 2013).

Protocolo realizado según el manual de la OIE. Para evaluar la capacidad de inducción de anticuerpos neutralizantes al VPPC (anticuerpos implicados directamente en la protección virológica) tras la vacunación con la vacuna cubana, se realizó la técnica de suero neutralización asociada a la técnica enzimática de inmunoperoxidasa para el revelado (NPLA) en muestras de sueros colectados a: 0, 1, 4, 8, 12, 16, 22, 26 y 30 días post vacunación. 

El procedimiento de esta técnica se ejecutó según se describe a continuación y siguiendo las normas de las buenas prácticas de laboratorio. Se emplearon los siguientes virus para la detección de anticuerpos: 

- Cepa de referencia de VPPC: Alfort 187 (CSF 0902)
- Cepa Margarita de VPPC.

Se manipularon monocapas de cultivos celulares preformadas en placas de 96 pocillos con 72 horas y con un mínimo de 90% de confluencia, utilizando la línea celular de riñón de cerdo (PK-15) (ATCC Ref. CCL-33-USA). Se tomaron las diferentes muestras de sueros obtenidos en cada etapa de muestreo, antes de la vacunación y días posteriores a esta, los cuales se inactivaron a 56°C con sueros controles positivos y negativos de referencia por 30 minutos a baño maría para inactivar el complemento. 

Se prepararon las diluciones de los sueros 1:25 y 1:50 en tubos de 0.5 y 1 mL en medio MEM más solución de antibióticos y posteriormente se descongeló una alícuota de virus de referencia Margarita previamente titulado y conservado a -70°C. Se preparó en medio MEM- E (GIBCO®-USA) la dilución viral correspondiente a las 100 dosis infectiva media en cultivo de tejido (DICT50) a partir del virus con un título viral de 105.9 DICT50. 

Para efectuar la neutralización se tomó 50 µl de sueros a investigar en diluciones 1:25 y 1:50 en cada pocillo por duplicado. De igual forma, se incluyeron sueros controles positivos negativos y control de células. Luego se adicionó 50 µl de la dilución viral correspondiente a las 100 DICT50 a todos los pocillos dejando libre los controles de células y se incubó la placa de mezcla suero-virus a 37°C en 5% CO2 por 60 minutos. Pasado ese tiempo se procedió a sacar las placas y se adicionó 50 µl de la suspensión celular en una concentración de 500.000 células/mL en todos los pocillos y se incubó a 37°C con 5% CO2 por 48 horas. Una vez transitado ese tiempo de incubación se lavaron las placas dos veces con 200 µl de PBS diluido en 1:2 en agua desmineralizada y se secaron durante dos horas a 40°C. Seguidamente se procedió a revelar las placas realizando la inmunoperoxidasa, para lo cual se preparó el conjugado anti VPPC/proteína A peroxidasa, el cual se dispensó 50 µl en cada pocillo y finalmente se incubó una hora a 37°C en cámara húmeda, lavando posteriormente con PBS-Tween.

Para realizar el revelado de la placa se preparó la solución ABC la cual se adicionó 50 µl en cada pocillo para una posterior incubación por 15-30 minutos, hasta que se observó color pardo o marrón en los pocillos control con las 100 dosis virales. Se agregó 200 µl de PBS diluido a todos los pocillos y se realizó la lectura con el microscopio de luz invertido. 

Dentro de los parámetros que se utilizan para evaluar la eficacia de las vacunas frente a la infección por el VPPC, se encuentra la capacidad de las mismas en inducir una potente respuesta de interferón gamma. Con este fin, se realizó la técnica de ELISPOT para evaluar la inducción de células productoras de interferón gamma específicas a la respuesta frente al VPPC en los cerdos tras la vacunación. La sangre recolectada en EDTA (5 mM) se utilizó para obtener las células mononucleares de sangre periféricas (PBMC) mediante centrifugación en gradiente de densidad con Histopaque 1077 (Sigma). 

Las PBMC que se recuperaron fueron contadas mediante tinción con azul de Tripán. Las células se cultivaron en medio RPMI (Gibco) al 10% de suero fetal bovino (libre de pestivirus) más 1 mM de ácidos aminoácidos no esenciales (Invitrogen), piruvato de sodio a un mM (Invitrogen), cinco mM de 2-mercaptoetanol (Sigma), 50 000 IU de penicilina l-1 (Invitrogen), 50 estreptomicina mg l-1 (Invitrogen) y 50 mg de Gentamicina l-1 (Sigma). Se utilizaron placas de ELISA (Costar 3590, Corning), se tapizaron durante la noche con 5 g / mL de anticuerpo de captura de IFN-gamma (P2G10, Pharmigen). Para la detección se utilizó el anticuerpo biotinilado (P2C11, Pharmigen). Se sembraron 5 × 105 PBMC vivas / pocillo (por triplicado) y se estimularon a 0,02 de multiplicidad de infección de la cepa CSFV Margarita, vacuna de LABIOFAM (esta última en una dilución de 1:50). Como controles, se incubaron las PBMC por triplicado en ausencia de virus (control negativo), o con fitohemaglutinina (PHA) (10 g / ml) (control positivo). 

Para ello se utilizaron tres lotes de la vacuna a los cuales se les aumentó la concentración de virus vacunal hasta llegar a 103 ARN del virus vacunal con un CT de 39.36 y resultados de los controles de calidad realizados al producto terminado fueron satisfactorios (humedad residual, esterilidad, características organolépticas, Inocuidad y Potencia).

Animales utilizados en el ensayo: Se utilizaron 32 cerdos con edades comprendidas entre seis a ocho semanas, con una distribución homogénea de sexos, en óptimas condiciones de salud provenientes de la unidad Cordovanal, que no vacuna contra la PPC y a los que se demostró que no tenían anticuerpos contra pestivirus.

Vacunación: Los animales se separaron en tres grupos experimentales de 10 cerdos por cada uno de los lotes en ensayo, libres de anticuerpos contra pestivirus. A cada lechón se le suministró por la vía intramuscular profunda en la cara interna del muslo, una dosis de la vacuna (dos mL). Otro grupo experimental de 6 cerdos no fue vacunado y se utilizaron como controles. A los seis meses post vacunación se trasladaron al área de desafío donde fueron desafiados los animales vacunados y los controles no vacunados con 105 DIC50 de la cepa virulenta Margarita siendo observados diariamente durante 14 días postvacunación, tres días antes del desafío y los 21 días postdesafio. Concluido este tiempo se sacrificaron y se realizaron estudios anatomopatologicos de los animales vacunados y los controles no vacunados. 

Se recolectaron muestras de sangre sin anticoagulante a los 0, 16, 35 y todos los meses después de la vacunación hasta los 6 meses, antes del traslado para el desafío y a los 7, 14 y 21 días post desafío para la investigación de anticuerpos totales contra pestivirus por ELISA y título de anticuerpos neutralizantes por NPLA.

Se preparó la dilución del conjugado (30X) 1:30 en diluyente de conjugado. Se agregó 20ul de diluente de muestra a cada pocillo de una placa de 96 y posteriormente se agregó 80 ul de control negativo a los pocillos A1 y B1, 80 ul de control positivo débil a los pocillos C1 y D1 y 80 ul de control positivo a los pocillos E1 y F1. Seguidamente se agregó 80 ul de muestra a dos pocillos adyacentes de la placa. Se sellaron las placas y se agitó con suavidad incubándolas posteriormente a 370C por una hora. Pasado ese tiempo se vaciaron las placas y se lavaron con 300ul de solución de lavado golpeándolas bien de manera invertida después del último ciclo de lavado. Se agregaron 100ul del conjugado diluido a cada pocillo, se sellaron nuevamente las placas y se incubaron a 370C por 30 minutos. Una vez terminado ese tiempo se vaciaron las placas y se lavaron seis veces con 300ul de solución de lavado diluido por pocillo, golpeándolas bien después del último ciclo de lavado. Se agregó 100ul de solución de sustrato cromógeno a cada pocillo y se incubaron las placas a 220C por 20 minutos y consecutivamente se agregó 100ul de solución de frenado a cada pocillo y se mescló el contenido de los pocillos.

Posteriormente se midió la densidad óptica (DO) de los pocillos a 450 nm dentro de los 15 minutos siguientes a la finalización del desarrollo del color y se calculó la DO media del control negativo (pocillos A1 y B1), este es el valor máximo de la DO y se calculó el porciento de inhibición (IP) del control positivo débil, del control positivo y de las muestras según la fórmula siguiente:

Criterios de validación:

La DO media del control negativo debe ser > 1.0
La IP del control positivo débil debe ser > 50%
La IP del control positivo debe ser > 80%
La interpretación de la IP:
< 40% se considera negativo y la muestra no contiene anticuerpos específicos para el virus de PPC
≥ 40% se considera positivo y la muestra contiene anticuerpos específicos para el virus de PPC.

Se siguió el mismo procedimiento descrito previamente.

Con el propósito de comparar la sensibilidad de ambas técnicas de RT PCR en tiempo real, se ejecutó un análisis estadístico empleando el Programa GraphPad Prism (versión 5) y se realizó una estadística descriptiva, calculando la media y desviación estándar de los datos obtenidos. 

El RT PCR en tiempo real es el método de elección en muchos laboratorios con aplicaciones en el diagnóstico. Esta tecnología adopta los aspectos químicos de la reacción en cadena de la polimerasa con el uso de moléculas fluorescentes para monitorear la amplificación de los productos en cada ciclo de reacción. Su combinación brinda una excelente sensibilidad y especificidad, posibilidad de reproducibilidad de los datos, bajo riesgo de contaminación y así mismo reduce el tiempo de reacción. 

Los ensayos de RT PCR en tiempo real han sido aplicados en la Medicina Veterinaria para la detección de ARN de varios virus teniendo en cuenta que es una técnica muy sensible y específica. El ensayo con sonda Taqman utilizado para la detección de virus vacunales con cepa china lapinizada, tiene una alta sensibilidad, pudiendo detectar un mínimo de 10 copias del genoma por reacción (G. Risatti et al. 2005, Liu C. et al. 2007, Liu et al. 2011). 

El ARN viral de la vacuna cubana contra la PPC elaborada en LABIOFAM fue detectado con la técnica antes descrita pero con un nivel muy bajo, llegando hasta la dilución 10-2 con un CT de 33.99, sugiriendo una baja carga de virus vacunal si se compara con los valores obtenidos en la cepa Pestiffa (control positivo) (Tabla 1). 

Tabla 1. Resultados de la sensibilidad y especificidad de la RT-PCR en tiempo real para la detección del ARN de las cepas lapinizadas de VPPC (Liu et al., 2011) con los virus utilizados en este estudio. 

A1-A7 cepa Margarita (virus de desafío) de la cepa sin diluir a la última dilución. A8 control negativo. B1-B7 cepa Pestiffa (Merial), control positivo del ensayo, de la cepa sin diluir a la última dilución. B8 control negativo. C1-C7 vacuna lapinizada, (objeto de este estudio), de la cepa sin diluir a la última dilución. C8 control negativo extracción. C9-C10 controles negativos de la reacción.

Como ensayo secundario se secuenció la zona del genoma que amplifica esta reacción de la vacuna cubana cepa China lapinizada, evidenciándose que tiene un alto porcentaje de homología nucleotídica (99%) con la cepa Harbin, (código AY805221 del Gene Bank, datos no mostrados).

Para poder comparar resultados posteriores y entender el diagnóstico en las muestras utilizadas en los ensayos (diferenciación de virus vacunal de virus de campo), se realizó una prueba de la sensibilidad de la técnica de Hoffman et al., 2005 con las diluciones del virus (Cepa “C”) de referencia y un control positivo de la técnica de Liu et al., 2011 así como la vacuna cubana contra la PPC, evidenciándose que se pierden entre uno y dos logaritmos en la detección del ARN vacunal. (Gráfico 1).

 

Gráfico 1. Prueba de sensibilidad sobre el ARN de las cepas vacunales lapinizadas.

Los cerdos vacunados quedaron protegidos de los síntomas clínicos de la PPC tras el desafío viral con la cepa virulenta Margarita (Gráfico 2), sin embargo los cerdos contacto no vacunados del grupo 2 y el grupo 3 desarrollaron: fiebre, anorexia, incoordinación de los movimientos, caída del tren posterior, conjuntivitis, diarreas, estreñimiento, prolapso rectal, trastornos nerviosos de leves a graves, incluyendo convulsiones muy fuertes y postración. Se practicó la eutanasia a dos cerdos (de cada uno de estos grupos) por cuestiones éticas, teniendo en cuenta la gravedad de los síntomas de PPC desarrollados. Estos datos también confirman que no existió transmisión del virus vacunal de animales vacunados a los contactos, pues en el grupo contacto no se observó una reducción de los síntomas clínicos con respecto al grupo control no vacunado- control de infección.

Grafico 2. Media por grupo y por día de la valoración clínica tras el desafío con la cepa Margarita del VPPC. Los valores se analizaron según la valoración descrita previamente para la cepa Margarita. 

Al analizar las muestras de suero de los tres grupos de cerdos, se pudo evidenciar que los animales vacunados resultaron positivos a partir de los 4 días postvacunación, sin embargo los contactos no vacunados resultaron negativos durante todo el periodo de estudio, demostrando que el virus vacunal no se transmite a los contactos no vacunados.

En el primer grupo se observó una baja carga de ARN del virus vacunal a los 4, 8 y 12 días post vacunación (dpv). En el segundo grupo se observó una baja carga de ARN del virus vacunal a los 8 dpv (todos los animales vacunados), 16 dpv (tres animales vacunados) y a los ocho días post infección (dpi) (dos animales vacunados y desafiados). El resto de los animales vacunados y desafiados, así como sus contactos no vacunados, resultaron negativos. En el tercer grupo todos los animales fueron negativos. En estos dos grupos (segundo y tercero) en los animales no vacunados se desarrolló la PPC, por lo tanto, la técnica aplicada no interfirió con el diagnóstico del virus de desafío. (Tabla 2).

Tabla 2. Resultados de la técnica de RT PCR en tiempo real utilizando sonda Taqman, en muestras de sueros de cerdos vacunados con la vacuna con cepa china lapinizada contra la PPC y desafiados a 16 dpv.

Leyenda: DPV: días postvacunación, DPI: días postinfecciòn, No vac.: no vacunados, Neg: negativos, C/No vac.: Contactos no vacunados.

Jamerzi Lorena y colab. 2001, detectaron muestras de sangre positivas en animales vacunados con dos vacunas con cepa China, obtenida en conejos y en células MPK respectivamente, hasta los 16 dpv, utilizando la técnica de Nested RT PCR, siendo corroborado por Kaden V. y colab., 2001.

Blome Sandra y colab., 2012, al utilizar la técnica de RT qPCR observaron resultados positivos en dos animales con 7 días de inmunizados con una vacuna viva atenuada (C strain “Riems”) a los que se le detectaron valores de CT de 37.7 y 37.9, manteniéndose un cerdo con esa positividad a los 14 y 21 dpv. 

Las muestras de hisopos nasales, bucales y rectales de los animales vacunados y desafiados, utilizando la técnica de Liu et al., 2011, resultaron negativas, excepto tres cerdos del primer grupo en los que se detectó en hisopos nasales una baja carga de ARN viral a los 8, 12 y 16 dpv (Tabla 3).

Tabla 3. Resultados de la técnica de RT PCR en tiempo real utilizando sonda Taqman en muestras de hisopos nasales, bucales y rectales de animales vacunados y los controles no vacunados.

Leyenda: dpv: días postvacunación, dpi: días postinfecciòn, No vac.: no vacunados, Neg: negativos, C/No vac.: Contactos no vacunados.

En los órganos de los animales vacunados y/o desafiados al utilizar la misma técnica de RT PCR se evidenció:

1. Entre alta y moderada carga de ARN viral en tonsilas entre los cuatro y 30 dpv en el 1er grupo, a los 16 dpv, 8 dpi y 13 dpi en los animales vacunados y desafiados del 2do grupo. 

2. De moderada a baja entre 4 y 8 dpv en linfonodos pre escapular y pulmón en tres animales del primer grupo, a los 13 dpi en linfonodo de un animal en el segundo grupo y a los 16 dpv y 13 dpi en riñón de dos animales del segundo grupo. 

3. Los animales contactos no vacunados y desafiados y el 3er grupo resultaron negativos (Tabla 4). 

Tabla 4. Resultados de la técnica de RT PCR en tiempo real utilizando sonda Taqman en muestras de órganos de cerdos vacunados y los controles no vacunados.

Leyenda: dpv: días postvacunación, dpi: días postinfecciòn, No vac.: no vacunados, NEG: negativos, C/No vac.: Contactos no vacunados.

Desde la década del 70 se ha reportado que el virus vacunal se replica en tonsilas hasta 2 y 3 semanas postvacunaciòn. En Colombia la primera investigación que se realizó sobre la evaluación de la vacuna de PPC fue ejecutada por Villamil y colab., en 1998, quienes desarrollaron varios experimentos cuyo objetivo fue evaluar la calidad de tres biológicos, mediante pruebas de inocuidad y potencia. Dentro de los hallazgos importantes de ese estudio, se encontró la persistencia del virus vacunal a nivel de las tonsilas hasta los 35 dpv mediante la prueba de IFD para el total de las vacunas evaluadas. No se pudo determinar con exactitud en qué momento desaparecía el antígeno vacunal de las tonsilas ya que el experimento se realizó hasta los 35 dpv. En el año 2011, en pruebas realizadas en este mismo país con dos vacunas contra PPC con cepa China, detectaron la presencia del ácido nucleico del virus vacunal en hisopos nasales y rectales en dos animales vacunados. 

G. Chenut et al. 1999, llevaron a cabo siete experimentos para evaluar la eficacia, seguridad y transmisión de la vacuna con cepa china del virus de la Fiebre Porcina Clásica (VFPC) administrada por vía oral en 47 cerdos, además de otras especies y en los resultados evidenciaron que a las 3 semanas después de la vacunación oral, ocurrió una clara seroconversión en los cerdos y seis semanas post vacunación, los cerdos estaban totalmente protegidos contra un desafío virulento. La cepa China no se aisló de las amígdalas, bazo, nódulos linfáticos, timo, saliva, orina y heces dentro de los 4 días posteriores a la inmunización oral. A su vez en el experimento, se colocaron cerdos susceptibles en contacto directo con los animales vacunados y ninguno de los cerdos contacto-expuestos se volvió serológicamente positivo concluyendo que la cepa China induce protección en los cerdos cuando es administrada por vía oral y no se transmite a otros cerdos.

Paton D. y colab. 2003, demostraron de que el virus vacunal puede descubrirse en órganos (tonsila, nódulos linfoides mandibulares y bazo), hasta 8 dpv en cerdos domésticos y únicamente en tonsila hasta 9 dpv en cerdos salvajes y Leifer Immanuel y colab., 2009, a su vez evidenciaron que la replicación de la cepa China está limitada al tejido linfoide y ocasionalmente en otros tejidos como riñón, pero excede su permanencia a tres semanas en la tonsila.

P.L. Eble y colab., 2013, en investigaciones realizadas sobre la eficacia de pestivirus quiméricos como candidatos vacunales, utilizando una vacuna con cepa C. como control, comprobaron en los resultados de PCR en exudados orofaríngeos, que las muestras de casi todos cerdos inoculados y contactos, vacunados con dos vacunas quiméricas y la cepa C, fueron positivas antes de que los animales fueran desafiados, debido a la presencia del virus de la vacuna. Después del desafío, algunos cerdos seguían siendo PCR positivo hasta 28 dpi. En estos casos, los resultados positivos pudieron ser causados por el virus de la vacuna o virus del desafío. Al evaluar los resultados de PCR específico para una cepa virulenta (Koslov) en las mismas muestras observaron que en los grupos vacunados con cepa C y una quimérica, 2 de los 10 cerdos inoculados, resultaron positivos para 1 o 2 muestras seguidas respectivamente y ninguno de los cerdos contactos resultaron positivos. No obstante estos investigadores refieren que aunque la transmisión no se bloquea completamente, también la vacunación con estas vacunas pudieran reducir la transmisión en una población vacunada.

Al utilizar esta técnica molecular para detectar el ARN del VPPC, no hubo detección en ninguna de las muestras de suero de los cerdos vacunados a 8 ni 16 dpv, permaneciendo este grupo protegido de la presencia del virus de desafío (protección esterilizante en el suero), ya que las muestras de suero fueron positivas solo en los animales no vacunados y desafiados del segundo y tercer grupo (Tabla 5). Los valores de CT para el ARN del virus vacunal a 8 y 16 dpv se encontraban por encima de 35 y esos resultados sugieren que la técnica de Hoffman pudiera detectar el ARN del virus vacunal (como interferencia) en muestras cuyos valores de CT estén solo por debajo de 35 con la técnica de Liu et al., (2011). Por el contrario, los valores de CT obtenidos en los grupos de cerdos no vacunados-contacto y cerdos no vacunados-control de infección, confirman la presencia del ARN del VPPC y su relación con el desarrollo de los síntomas clínicos de la enfermedad.  

Tabla 5. Resultados de la técnica de RT PCR en tiempo real utilizando sonda TaqMan en muestras de sueros de cerdos vacunados con la vacuna con cepa china lapinizada contra la PPC y desafiados a 16 dpv.

Leyenda: dpv: días postvacunación, dpi: días postinfecciòn, No vac.: no vacunados, NEG: negativos, C/No vac.: Contactos no vacunados.

En las muestras de hisopos nasales, bucales y rectales, un animal vacunado y desafiado del segundo grupo y todos los animales no vacunados y desafiados del segundo y tercer grupo (Tabla 6), fueron positivos.

Tabla 6. Resultados de la técnica de RT PCR en tiempo real utilizando sonda Taqman según Hoffman et al., 2005, en muestras de hisopos nasales, bucales y rectales de animales vacunados y los controles no vacunados.

Leyenda: dpv: días postvacunación, dpi: días postinfecciòn, No vac.: no vacunados, Neg: negativos, C/No vac.: Contactos no vacunados

En las muestras de órganos de los tres grupos de animales, se evidenció que en el primer grupo todos los animales resultaron positivos entre los 4 y 30 dpv en tonsila y 3 animales en linfonodo, mientras en pulmón se evidenció entre 4 y 8 dpv, siendo negativos en riñón. En el segundo grupo todos los animales resultaron positivos a 16 dpv y 13 dpi en tonsilas, 2 animales a 13 dpi en linfonodo, un animal a 13 dpi en pulmón y tres animales a 13 dpi en riñón. En el tercer grupo todos los animales resultaron positivos en todas las muestras de órganos evaluadas (Tabla 7). 

Tabla 7. Resultados de la técnica de RT PCR en tiempo real utilizando sonda TaqMan según Hoffman et al., 2005, en muestras de órganos de cerdos vacunados y los controles no vacunados.

A su vez todos los cerdos resultaron positivos en tonsila, siendo los animales vacunados lo que obtuvieron valores de CT más altos. A pesar de esto, los valores de CT obtenidos para los cerdos vacunados fueron inferiores a 35. En las muestras de linfonodo, pulmón y riñón, no se observó co-detección de los dos ARN víricos en el 100% de los casos, ya que se detectaron cerdos vacunados como positivos a VPPC que previamente resultaron negativos a la detección del virus vacunal. Estos resultados sugieren que el virus de desafío pudiera quedar retenido en la tonsila de los cerdos vacunados y desafiados (además del virus vacunal) a muy baja concentración de ARN, como remanente en órganos como riñón, linfonodos y pulmón. 

Los cerdos de los grupos no vacunados-contacto y no vacunados-control de infección, resultaron positivos, confirmando el desarrollo de la PPC en los mismos.

En el gráfico 3 se puede observar que los valores de CT obtenidos en ambos ensayos de RT PCR en tiempo real durante todos los días post vacunación evaluados son similares entre sí, lo que indica que a partir de los 4 y hasta los 30 días es posible detectar el ARN del virus vacunal en las muestras estudiadas. Si comparamos estos valores entre ambas técnicas, se puede notar que en el caso del RT PCR descrito por Liu et al. 2011, son menores, lo cual es indicativo de que la sensibilidad de este ensayo es mayor. Esto concuerda con lo esperado teniendo en cuenta que esta técnica es específica para la cepa vacunal evaluada (cepa china lapinizada), mientras el ensayo de Hoffman et al. 2005, está diseñado para detectar todas las cepas de PPC y por tanto su sensibilidad es menor. 

Gráfico 3. Comparación de los valores de CT obtenidos con las técnicas RT PCR en tiempo real utilizadas en el estudio de las tonsilas de los cerdos vacunados

En el grupo 1 solo se pudo detectar anticuerpos frente a la proteína E2 del VPPC, en 2 de los 7 cerdos vacunados a partir de 16 dpv (28,5 %), observándose un mayor número de animales positivos entre los 22 y 30 dpv. En el grupo 2 y 3 solo se detectan anticuerpos frente a la E2, en 2 de los 7 cerdos vacunados a partir de 16 dpv (28,5 %). Tras el desafío, se observa que el virus Margarita induce un efecto de amplificación de la respuesta de anticuerpos en los cerdos vacunados a 8 y 13 dpi (Figura 3), indicando la capacidad de la vacuna cubana elaborada en LABIOFAM de inducir una respuesta de anamnesis de los anticuerpos tras la infección (memoria inmunológica). 

Figura 3. ELISA de bloqueo para la detección de anticuerpos frente a la glicoproteína E2 de PPC. Los resultados se interpretan de la siguiente manera: % de Bloqueo de 0 a 30: sueros negativos. % de Bloqueo de 30-40: sueros dudosos. % de Bloqueo a partir de 40: sueros positivos.

Al evaluar los sueros de los animales vacunados con la vacuna cubana contra la PPC, se pudo evidenciar por la técnica de ELISA de bloqueo frente a la E2 del VPPC que los animales resultaron positivos entre los 22 y 30 dpv, con un % de bloqueo entre 70 y 80. Y después de desafiados la respuesta de anticuerpos en los cerdos vacunados fue entre 8 y 13 dpi. 

Algo importante de destacar en la prueba de ELISA es que pueden llegar a detectar anticuerpos de una forma más temprana que la NPLA, sin que estos sean neutralizantes como lo demostró Colijin y colab.; 1997. Estos investigadores compararon un ELISA Ceditest para PPC E2, encontrando que la concordancia con la NPLA fue del 95%, detectando una diferencia en solo 8 sueros de 152 evaluados, los cuales a los 17 y 21 días post-infección fueron negativos por NPLA y positivos por ELISA. Dos sueros colectados a los 17 dpi fueron sospechosos por la ELISA Ceditest, pero fueron positivos por NPLA. 

Koenig y colab., 2007, en su experimento evaluando una vacuna elaborada con la cepa China y una vacuna marcada, encontraron que los animales seroconvirtieron al día 11 postvacunaciòn, siendo medibles por una prueba comercial de ELISA (HerdCheck ® CSFV Ab) para las dos vacunas. Los anticuerpos neutralizantes fueron detectados a los nueve días postvacunaciòn en muestras de sueros de dos de cuatro animales inmunizados con la cepa C y a los ocho días postvacunaciòn en los cuatro animales inmunizados con la vacuna quimérica CP7_E2alf, con títulos máximos de 80 ND50 (en ingles 50%-neutralising doses) y títulos con un rango entre 60 and 320 ND50 para la CP7_E2alf.

M. Tignon y colab. 2010, en un estudio de la PPC, comparando dos vacunas: una convencional con cepa C y una marcadora CP7_ E2alf, después de inmunizar a cerdos domésticos oronasalmente, observaron una primera seroconversión el día 15 dpv en dos de 26 animales en el grupo inmunizado con la CP7_E2alf y al día 11 dpv en 19 de 28 animales en el grupo inmunizado con la vacuna convencional y los anticuerpos fueron disminuyendo paulatinamente hasta el día 91 dpv, siendo detectados los porcientos de bloqueo por debajo de 80, en el suero de uno de cuatro animales.

En un ensayo realizado en Colombia (Piñeros Duque 2011), donde se inmunizaron los cerdos con dos vacunas comerciales, COLERVEC (cepa China de origen francés) y PEST- VAC (cepa China de origen americano) se utilizó un ELISA-Ceditest®-CSFV competitivo para la detección de anticuerpos en los animales vacunados y los sueros de todos los cerdos mostraron seronegatividad al día 0 y comenzaron a presentar seroconversión positiva entre los 14 y 21 dpv, sin embargo a los 35 dpv, solo se detectó anticuerpos en el 50% de los animales evaluados. 

En el grupo 1 los animales vacunados comenzaron a presentar bajos niveles de anticuerpos al día 12 postvacunaciòn, que no llegaron a ser anticuerpos protectivos. Los mismos aparecen a partir de los 22 dpv hasta los 30 dpv, pero con mayor respuesta frente a la cepa Alfort. En el grupo 2 y 3 los anticuerpos neutralizantes son detectables a partir de 5 dpi con títulos mayores de 1:40 en 3 de los 6 cerdos vacunados (50%) y rápidamente entre 8 y 13 dpi, todos los cerdos presentan títulos de 1:40 a 1:1280 (Tabla 8). 

Precauste, 1983; Terpstra, 1990, Suradhat, 2007, han documentado evidencias sobre la respuesta inmune frente a las vacunas elaboradas con la cepa China, demostrando que la aparición de anticuerpos neutralizantes inducidos por la vacuna ocurre a las 2-3 semanas postvacunaciòn, aumentando hasta por lo menos 4-12 semanas, pudiendo persistir durante muchos años después de una sola vacunación, pero también parece desaparecer en algunos cerdos. 

Fonseca O. et al., 2013, en un estudio sobre la respuesta humoral a dos inmunógenos contra la PPC en condiciones de campo, realizado en Cuba, demostraron que la frecuencia de animales vacunados con la vacuna cubana convencional contra la PPC y el título de anticuerpos ≥1:50 tuvo una tendencia marcadamente decreciente y a los 105 (±3) días de edad el 40% de los animales tenían títulos <1:50, disminuyendo a menos del 50% en las etapas más avanzadas del ciclo tecnológico. Es necesario tener en cuenta que la vacunación contra la PPC está influenciada por varios factores críticos de campo, tales como la cadena de frío, el esquema de vacunación, la interacción con otros agentes, entre otros. En otro estudio sobre la respuesta humoral a diferentes esquemas de vacunación contra PPC, aplicados sucesivamente durante un foco activo de la enfermedad ejecutado por María Irian Percedo y colab., 2009, con la vacuna cubana convencional contra la PPC se evidenció la presencia de títulos de anticuerpos ≥1:50 en muestras de cerditos de tres días de edad, los cuales disminuían en un 80% (16/20) a sólo 28 días después de la primo-vacunación, demostrando que las cerdas que se vacunaban correctamente, transferían los anticuerpos a sus crías y estos anticuerpos pasivos neutralizaban el antígeno vacunal, cuando los mismos eran inmunizados con cinco días de edad, demostrando que la vacuna con cepa China es capaz de inducir protección completa si es aplicada en el momento correcto, cuando no puede interferirse con los anticuerpos del calostro. 

Según Sánchez Ramos, 2008, en su tesis de opción al grado científico de Doctor en Ciencias Biológicas sobre el Desarrollo y caracterización de un candidato vacunal recombinante contra la PPC basado en la glicoproteína E2 de la envoltura viral, al estudiar un grupo experimental de 15 cerdos que recibieron una simple inmunización con la vacuna convencional basada en la cepa China lapinizada y compararlos con un segundo grupo inmunizado con la formulación E2his-LC, emulsionada en Montanide 888, siendo ambos grupos a los seis meses posteriores de la primera inmunización (siete animales de cada grupo experimental) desafiados con 105 DL50 de la cepa Margarita del VPPC y el resto de los animales confrontados a los nueve meses post-vacunación, pudieron evidenciar que todos los cerdos inmunizados desarrollaron anticuerpos neutralizantes superiores a los títulos considerados como protectivos ≥1/50 desde la tercera semana postinmunizacion y hasta el final del experimento. Después de la confrontación, a los seis o nueve meses, ninguno de los cerdos vacunados mostro signos clínicos de PPC y tanto los cerdos vacunados con la vacuna viva atenuada como los inmunizados con la formulación basada en E2his-LC resistieron el reto con 105 DL50 sin cuadros febriles. Tampoco se pudo determinar la presencia de virus infectivos en las muestras de linfocitos de estos animales, ni a partir de los órganos colectados después del sacrificio.

Van Oirschot, 2003, Suradhat y colab., 2007; Franzoni y colab., 2013; evidenciaron en sus investigaciones que las vacunas vivas modificadas contra la PPC inducen anticuerpos neutralizantes a 12 dpv y una protección completa puede ser inducida a los cinco días en cerdos vacunados con la vacuna con cepa China, sin que haya viremia y excreción viral después del desafío con el virus virulento de PPC.

Tabla 8. Detección de anticuerpos neutralizantes por NPLA, en animales vacunados y/o desafiados contra la PPC.

En el presente estudio se utilizó un ensayo ELISPOT a través del cual se pudo comprobar que la vacuna cubana elaborada en LABIOFAM induce una potente respuesta de interferón gamma específica frente al VPPC a 16 dpv (en ausencia de anticuerpos totales y neutralizantes) (Figura 5). 

 

Figura 5. Respuesta de interferón gamma específica frente al VPPC en el momento del desafío viral (16 días post vacunación). 

 A 13 días post desafío, todos los cerdos vacunados presentaron de igual manera una fuerte respuesta de células productoras de interferón gamma, tanto frente a la fitohemaglutinina (PHA), como frente al estímulo viral utilizado en este tiempo (cepa Thiverval) (Figura 6). 

 

Figura 6. Respuesta de interferón gamma específica frente al VPPC a 13 días post desafío.

El ensayo de ELISPOT para la determinación de la producción de interferón gamma específico contra el VPPC ha sido usado para valorar la inmunidad celular contra este virus por varios grupos de investigadores (Suradhat., 2001; Armengol y colab., 2002; Rau y colab., 2006).

QIU Hua-ji y colab.; 2006, en una revisión retrospectiva del uso en China de la vacuna lapinizada contra la PPC durante 20 años, mostraron que la presencia células secretoras de interferón gamma es indicativo de inmunidad celular, pudiendo ser detectado en las células polimorfonucleares de sangre periférica de los cerdos vacunados con cepa China a los seis dpv y en los cerdos que resisten el desafío con virus virulento aun cuando no son detectables los anticuerpos neutralizantes.

Adicionalmente Suradhat y colab., 2001, Graham y colab., 2012b y Franzoni y colab., 2013 constataron que las células de INF gamma secretadas contra el virus constituyen un marcador de protección mediada por células T (linfocitos CD4+CD8+) detectables entre seis y 140 dpv.

Todos los animales vacunados y desafiados a los seis meses no presentaron signos ni síntomas clínicos de la enfermedad o atribuibles a la vacuna, siendo la puntuación 0. Los controles enfermaron y murieron, obteniendo una puntuación de 3 y 4. Sin embargo los controles no vacunados presentaron síntomas de PPC a partir del 4 día dpi, muriendo un animal y otro tuvo que ser eutanasiado. Los resultados de la investigación cumplieron con el requisito establecido por el Manual Estándar de la Organización Internacional para la Salud Animal (OIE).

Todos los animales vacunados y desafiados presentaron porciento de inhibición (PI) por encima del 40%, indicando que las muestras evaluadas contienen anticuerpos específicos para el virus de la PPC, pudiéndose evidenciar que a los 6 meses de vacunados los animales (0 dpi) el porciento de PI promedio fue de 89,40. A los 7 dpi el porciento de PI fue de 91,49, a los 14 dpi fue de 91,50 y a los 21 dpi fue de 91,94 (Gráfico 4).

 

Gráfico 4. Resultados de los porcientos de inhibición (IP) de muestras de suero de animales vacunados y /o desafiados.

Todos los animales vacunados presentaron títulos protectivos de anticuerpos neutralizantes en los tiempos estudiados (Gráfico 5).

Leyenda: En el eje y el número 2 se refiere a un título de 1: 50 en NPLA; el número 5 se refiere a un título de 1:69 en NPLA y el número 12 se refiere a un título mayor que 1:100 en NPLA.

Gráfico 5. Resultados de NPLA en animales vacunados con la vacuna lapinizada contra la PPC.

La vacuna con cepa China induce una completa protección en los animales vacunados contra el desafío de varios genotipos del VPPC (Graham et al., 2012a, 2012b; Suradhat et al., 2007; Van Oirschot, 2003). Sin embargo es necesario considerar que en áreas endémicas (Cuba entre ellas), la eficacia de las vacunas vivas modificadas como la cepa China lapinizada, están influenciadas por numerosos factores, entre ellos la ruta y edad de la vacunación, la presentación de otros patógenos, el estado inmune del animal, alimentación, etc. (Suradhat et al., 2001, 2007; Van Oirschot, 2003).

- Con la técnica de RT-PCR en tiempo real para la detección del ARN de cepas China lapinizada frente a la PPC desarrollada por Liu et al., 2011, se pudo evidenciar la presencia del ARN del virus vacunal objeto de estudio, así como en las muestras de suero, hisopos, tonsilas, pulmón, linfonodo pre-escapular y riñón de los cerdos tras la vacunación.

- Se comprobó que la técnica de detección del ARN del VPPC reportada por Hoffman et al., 2005 y validada por el Laboratorio de Referencia de PPC de la Unión Europea, Hannover, Alemania, puede interferir en los resultados de la detección de virus vacunal y enmascarar el diagnóstico de la enfermedad.

- La vacuna cubana contra la PPC protege a los animales vacunados de la presentación de los síntomas clínicos, induce protección esterilizante (ausencia de RNA del VPPC, con la técnica de Hoffmann et al., 2005) en las muestras de suero e hisopos rectales y el virus vacunal no se transmite a los animales contactos.

- El biológico objeto de estudio confiere una respuesta mediada por células T (células productoras de interferón gamma) tras la vacunación. Esta respuesta celular se puede asociar con la protección clínica observada. 

- La vacuna cubana contra la PPC, utilizando la cepa China lapinizada con una concentración de ARN viral de 10 3 es capaz de proteger a los animales de los síntomas clínicos y levanta niveles de anticuerpos protectivos y neutralizantes hasta 6 meses postvacunación.

A. Prueba de sensibilidad sobre el ARN de las cepas vacunales lapinizadas. 

 

B. Desarrollo de fiebre tras el desafío viral en los cerdos de los boxes 2 y 3.

C. Respuesta de anticuerpos totales frente a la E2 detectados por ELISA de bloqueo en los cerdos tras la vacunación y tras el desafío viral.

D. Resultados de NPLA en animales vacunados con la vacuna lapinizada contra la PPC.