Aplicación de la serología para el diagnóstico y control de las enfermedades del "Complejo Respiratorio Porcino"

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I. ANTECEDENTES
El cerdo con la excepción de las aves, es la única especie que ha sido objeto de transformaciones biológicas, resultado de los avances en la ingeniería genética y en la medicina veterinaria, y a pesar de que los parámetros como el tiempo de gestación no han podido alterarse. El cerdo ofrece ventajas comparado con el bovino de engorda, por ejemplo el período de engorda y el peso al mercado: los cerdos son sacrificados con un peso promedio de 100 kg entre los 4.5 y 6 meses de edad, mientras que los vacunos requieren entre 28 y 30 meses para alcanzar los 400 kg requeridos para el mercado. Respecto al rendimiento en canal, para el cerdo este parámetro es del casi 100%, el mas alto de las especies ganaderas.

La clave en el éxito de la porcicultura moderna radica en aumentar los índices de ganancia diaria de peso (GDP) y disminuir la conversión alimenticia (CA). Estos parámetros se observan seriamente afectados por las enfermedades crónicas especialmente las NEUMÓNICAS. En este aspecto las neumonías juegan un papel importante, debido al tipo de explotación intensiva que es sometido el ganado porcino.



II. INTRODUCCIÓN
La leche esta disponible en las glándulas mamarias desde el inicio del parto y así cada lechón puede hacer su camino directamente a la mama, encontrar el pezón y mamar. La pauta de lactancia en el cerdo y la interrelación entre la cerda y lechón, son particularmente fascinantes.

La primera leche, no es meramente la única fuerza de vida conteniendo alimentos para el lechón ya que, incluso, contiene un alto nivel de anticuerpos o inmunoglobulinas (principalmente la IgG y en menor grado la IgM y la IgA). Estos y otras macromoléculas son capaces, en las primeras pocas horas de vida, de evitar la digestión y pasar intactos através de la pared intestinal, para procurar un grado de inmunidad frente a las enfermedades producidas por numerosos microorganismos patógenos que acechan a los lechones en las primeras semanas de vida, esto es de suma importancia ya que los lechones nacen desprovistos de la inmunidad pasiva natural debido a el tipo de placentación epitelio - corial, debido a que tiene 6 capas de tejido entre la sangre fetal y la sangre materna. Otro tipo de anticuerpos (IgA secretora) es secretado continuamente con la leche durante toda la lactancia, estos no son absorbidos, pero actúan en los intestinos del lechón como defensa contra infecciones bacterianas de los mismos.



III. INMUNIDAD NEONATAL
La inmunidad de la marrana la transfiere a sus lechones a través del calostro y la leche. El calostro es el alimento que ingieren los lechones durante las primeras 24 a 36 horas de nacidos y ayudan a proteger a los lechones en las primeras semanas de vida mientras desarrollan su propia respuesta inmune. El calostro esta compuesto de anticuerpos o inmunoglobulinas (Ig´s): del 68 al 87% es IgG; del 8 al 22% de IgA y del 5 al 9% de IgM. El intestino del lechón durante las primeras horas de haber nacido, tiene un epitelio de absorción con células fetales altamente pinocíticas y que son las que transportan a las Ig´s del intestino a la circulación sanguinea. Posteriormente (de las 36 horas), las células fetales empiezan a ser reemplazadas por células epiteliales y ya no permiten el paso de los anticuerpos intactos a la sangre.

La IgA se incrementa en la leche después de parto. La absorción de la IgA y de la IgM no están eficiente como la IgG, sin embargo, in situ en la mucosa provee buena protección. La concentración de las inmunoglobulinas empieza a declinar a una relación del 3.4%/h. durante las primeras 24 horas después del parto. La vida media de las Ig´s en los lechones es variable: la IgG va de 6.5 a 22 días; la IgM de 2.5 a 3 días y la IgA de 2 a 3 días. Entre la 3ª. y 4ª. semana de edad, en el lechón se encuentra la mínima concentración de Ig´s, ya que fueron degradadas y ya se inicia la síntesis de las Ig´s propias del lechón. Aproximadamente, después de 7 a 10 días de la primera exposición a cualquier patógeno, los lechones neonatos inician una primera respuesta inmune.

Además de la interferencia humana, la cerda y el lechón iniciaran su compañía algún tiempo después. Debido a que los cerdos no pueden ser seleccionados mientras están lactando, la eficacia de la producción necesita de un destete precoz, debido a esto y a que los lechones pueden ser destetados a cualquier edad, aunque es mas frecuentemente entre las 3 y 5 semanas. La edad del destete depende mucho de la sofisticación de la dieta, alojamiento, control de las enfermedades y adecuación del manejo utilizado. La eliminación en el nacimiento o antes (por histerectomía), es utilizada para producir unos valores base para libres de patógenos específicos (S.P.F.); lotes mínimamente enfermos, que han de ser por garantía cerdos libres de patógenos específicos, de los que el lechón normalmente, se contagiara tan pronto como fuera expuesto al medio ambiente natural; por ejemplo, los microorganismos asociados a trastornos crónicos pulmonares.

El destete es mucho menos traumático para la madre que para el lechón; el lechón lactante tiene un pequeño problema en reabsorber la leche deglutida. Cuando el lechón es separado de la madre, la regresión glandular empezara casi inmediatamente y estará terminada, esencialmente, tres días después del destete. Esto en conjunto, no es sorprendente, que a mitad del primer día el tejido mamario tendrá registrado un equivalente a 12 pérdidas mamarias (de leche). No se precisa mas, que rápidamente, un destete brusco, sin necesidad de retirar también el alimento o el agua de bebida de la madre en ese momento. Es mas fácil que existan problemas en el estado del aparato reproductor materno después de un destete precoz.

Los órganos necesitan una recuperación después del esfuerzo que representa el parto y la crianza; la lactancia ayuda en este proceso; y en cualquier caso es incompleto hasta tres semanas después del parto. Como la lactancia esta preparada para ser progresivamente menor, a las tres semanas el útero es correspondientemente menos receptivo a la implantación del embrión y existe una aumentada probabilidad de retardar el celo y reducir el tamaño de la camada.

Aunque algunos porcicultores pueden tener éxito en el destete precoz, como de tres semanas para un período limitado de tiempo, solo algunas excepciones en unidades o lotes, pueden hacerlo durante un número consecutivo de años. Como observación general, es difícil encontrar evidencias de cualquier mejoramiento real en el número de lechones producidos, por hembra reproductora y año, en un destete mucho menor a 25 días de edad o 5 kg. de peso vivo.



V. SALUD DEL HATO
Algunas enfermedades como la disentería porcina y la Gasteroenteritis transmisible son desastrosas mientras estén activas. Pero otras como las neumonías y la rinitis atrófica, pueden fijarse en una explotación para causar una continua e insidiosa pérdida de las ganancias. Las enfermedades mas comunes y que mas gastos erogan de las explotaciones porcinas son las que afectan al aparato respiratorio y al sistema nervioso.

Las enfermedades respiratorias del cerdo, hoy en día están consideradas como uno de los problemas de salud animal mas importantes en la producción porcina (Amass, 1998; Loeffen, 1999). En neumonía enzoótica (NE) Mycoplasma hyopneumoniae es considerado como el agente bacteriano primario más importante (Piffer y Ross, 1984; Ross, 1999) seguido de Actinobacillus pleuropneumoniae que causa pleuroneumonía contagiosa porcina (Sebunya y Saunders, 1983; Ciprián et al., 1988).

El agente secundario que con mayor frecuencia se aisla es Pasteurella multocida una vez que las defensas de pulmón han sido alteradas, agravándose el problema en una pasteurelosis pulmonar (PP) (Morrison et al., 1985). La interacción entre M. hyopneumoniae y P. multocida después de una infección secuencial ya ha sido demostrado (Smith et al., 1973; Ciprián et al., 1988; Amass, 1994).

El caso ideal seria tener una explotación completamente libre de todas las enfermedades. La estrategia a tomar va a depender del ó de los problemas existentes en cada granja y de tener un diagnóstico anatomopatológico, serológico y microbiológico completo y veraz. La vacunación de las madres, en forma ideal preveniría la colonización totalmente, ó puede reducir la colonización específica virulenta, pero puede ser contraproducente.

En general la vacunación en los lechones solo funciona en colonizadores tardíos como los micoplasmas (¿tardios?) o puede interferir con la inmunidad materna (como en Pleuroneumonía Contagiosa Porcina). Hay casos en el sistema de destete precoz separado (SEW) donde no se elimina el Mycoplasma hyopneumoniae y se presentan problemas de neumonía enzootica alrededor de las 20 semanas de edad y esto es debido a una colonización tardía (Whittemore, 1988; Amass, 1998; Ciprián, 1999).

En granjas de 3 sitios el punto de ataque principal son las madres, mientras que en granjas que no tienen los 3 sitios el punto de ataque primordialmente son los lechones.

Como podemos darnos cuenta el llevar a cabo un destete precoz separado (SEW), sin tomar las precauciones de manejo e instalaciones, así como la capacitación adecuada al personal nos puede causar mas problemas que beneficios, debido a un sin número de agentes que anteriormente eran denominados como patógenos de baja incidencia y que están o ya tomaron importancia como agentes causales de enfermedad, así como sus posibles interacciones o sinergias y los efectos que estos causen por un inadecuado manejo y que permita la entrada de agentes secundarios los cuales van a causar mas perdidas de producción y por lo tanto perdidas económicas.

Por lo que hoy mas que nunca, el diagnóstico integral certero y veraz toma un papel de suma importancia en la producción porcina. En la actualidad se ha puesto de moda hablar de agentes colonizadores tempranos o tardíos, esto dependiendo de si ellos son capaces de estar infectando la mucosa del aparato respiratorio en alguna de sus porciones, en los primeros 15 días de vida o posteriores a los 15 días de vida de los lechones.

Existen un sin número de trabajos sobre el efecto de la edad del destete, para remover los patógenos de la granja. Sin embargo, cada MVZ, responsable de cada granja se preguntaría: ¿A que edad tendría que destetar para eliminar tal o cual enfermedad? (Amass, 1998).

No existe una edad universal de destete para eliminar un patógeno en especial, de ahí que sea indispensable conocer él o los patógenos específicos que afectan a la granja, para estimar la edad del destete y así poder eliminarlos:



PROBABLE EDAD DE DESTETE PARA ELIMINAR LOS PRINCIPALES PATOGENOS RESPIRATORIOS.

MICROORGANISMO
PROBABLE EDAD DE DESTETE
Actinobacillus pleuropneumoniae

Biovariedad 1, NAD dependiente
a) A 10 días o menores: si el hato tiene baja o variable inmunidad: eliminado en todos los casos hasta en un 90%.

b) A 16 días: oportunidad de eliminación del 50%.

c) De 18 a 20 días: oportunidad de eliminación del 5%. Será necesario tener una inmunidad de hato alta.
Mycoplasma hyopneumoniae A 17 días
Haemophilus parasuis A < 7 días
Pasteurella multocida A < 7 días
Actinobacillus suis A < 2 días
Streptococcus suis Solo con cesarea


Modificado Amass, 1998.



VI. EL COMPLEJO RESPIRATORIO PORCINO
Las enfermedades vírales son importantes en las infecciones secundarias bacterianas, sobretodo en las involucradas con el aparato respiratorio; tales afecciones están bien documentadas tanto en el hombre como en los animales domésticos. La idea de que pudiera existir una cooperación entre virus y bacterias en las neumonías fue conceptuada a raíz de las pandemias de influenza humana, ocurridas durante el siglo pasado. Aún hoy en día, la neumonía por agentes bacterianos secundarios es una de las complicaciones en los procesos neumónicos del cerdo.

El problema respiratorio porcino, hoy en día se le conoce como el Complejo Respiratorio Porcino (CRP), y se le considera así, por la gran variedad de agentes infecciosos que se involucran en el proceso neumónico. Sin embargo, existen una serie de trabajos clásicos, realizados por nuestro grupo que han demostrado la participación de virus con virus, de virus con bacterias, de micoplasmas con bacterias y de bacterias con bacterias, en donde actúan en forma sinérgica o interactuan en ellos. De igual manera sabemos que existen agentes patógenos primarios (agentes colonizadores tempranos) y secundarios u oportunistas (agentes colonizadores tardios), de reciente aparición, por los sistemas de producción porcina (cerdos en explotaciones de alta salud en varios sitios) que han complicado el problema neumónico aparentemente resuelto (en cerdos de explotaciones convencionales), de ahí la necesidad de seguir trabajando en las interacciones o sinergias entre diversos agentes infecciosos (Amass, 1998; Ciprián, 1999).



VII. FENÓMENOS DE INTERACCIONES Y SINERGIAS ENTRE VIRUS Y BACTERIAS
La primera comprobación de una bacteria, que per se no provoca daño alguno y que interactua con un virus en el proceso neumónico del cerdo fue realizado en la FFES-Cuautitlán UNAM, donde se demostró una marcada sinergía entre el virus vacunal de la Fiebre Porcina Clásica (antes Cólera Porcino) y Pasteurella multocida (Pijoan y Ochoa 1978; Pijoan et al., 1980).

A partir de este hallazgo, hemos venido realizando y comprobando desde hace mas de 15 años, la acción de patógenos primarios y la invasión de agentes oportunistas en el fenómeno de interacción y sinergia que ocurre entre virus y bacterias y bacterias con bacterias en el Complejo Respiratorio Porcino, lo que ha permitido entender mejor el problema, y así dar soluciones a la industria porcina.

1. Fiebre Porcina Clásica Actinobacillus pleuropneumoniae.- Hemos encontrado por evidencias clínicas y aislamiento de la bacteria, que la PCP se exacerba cuando se importan cerdas de reemplazo de EU, y que vienen como portadores de Actinobacillus pleuropneumoniae, pero libres de Fiebre Porcina Clásica (FPC), y ya en destino final que es la granja , cuando se vacunaron contra la FPC, ocurrieron brotes de PCP agudo, en donde el serotipo de Actinobacillus pleuropneumoniae predominante fue el 1 (datos no publicados 1998).

2. Virus de la Enfermedad de Aujeszky (VEA) - Pasteurella multocida. - En un estudio de rastro, de los casos neumónicos en un 67% se observó serología positiva al VEA, mientras que en los casos normales sólo en un 32%. De los pulmones neumónicos, en un 51% se aisló algún tipo de Pasteurella; de los normales solo en un 9%. Con base en estos trabajos se desarrolló un experimento con cerdos convencionales, previamente vacunados con una cepa inactivada del virus de la enfermedad de Aujeszky, considerando como parámetro principal la remoción pulmonar de P. multocida a diferentes días posdesafío con una cepa virulenta del virus de la enfermedad de Aujeszky. Se encontró que el virus afecta la remoción pulmonar de la bacteria a partir del día 7 al 15 posinfección. Estos resultados apoyaron la hipótesis de que el virus de la enfermedad de Aujeszky está involucrado como agente primario en la pasteurelosis pulmonar del cerdo (Badiola y Pujols, 1984; Caballero, 1885).

3. Virus de la Enfermedad de Aujeszky (VEA) - Actinobacillus pleuropneumoniae.- También hemos demostrado que el VEA interactua con la PCP. Las evidencias encontradas muestran que la vacunación contra el VEA no fue capaz de prevenir la multiplicación del virus en el tracto respiratorio, ya que una dosis mínima de Actinobacillus pleuropneumoniae serotipo 1 fue suficiente para colonizar y matar a todos los cerdos del experimento, por lo que consideramos que existió una sinergia entre el VEA y el actinobacilo. Probablemente este sucediendo lo mismo en el campo, dado que después de presentarse la enfermedad de Aujeszky, aparece la PCP en forma epizoótica (Falcón et al., 1987; Tenorio et al., 1987)

4. Virus del Paramyxovirus porcino - Actinobacillus pleuropneumoniae.- Por otro lado, no se pudo demostrar la interacción o sinergía entre el virus del Paramyxovirus porcino y Pasteurella multocida, así como con Actinobacillus pleuropneumoniae serotipo 1, en cerdos convencionales y en condiciones controladas (García et al., 1988; Torres et al., 1996).



VIII. FENÓMENOS DE INTERACCIONES Y SINERGIAS ENTRE BACTERIAS Y BACTERIAS
5. Mycoplasma hyopneumoniae y Pasteurella multocida : Infección experimental de cerdos convencionales.- En esta investigación realizada por nuestro grupo se valoró esta infección de la siguiente manera : Se formaron cuatro grupos de cuatro cerdos cada uno: I testigo, II inoculado solamente con M. hyopneumoniae, III inoculado solamente con P. multocida y IV inoculado primero con M. hyopneumoniae y después con P. multocida. En los cerdos del grupo IV inoculado con ambos agentes se agravó y se prolongó la hipertermia, presentaron tos y disnea de mayor severidad y con signos de agravamiento, las lesiones macroscópicas abarcaron del 22 al 26% y fueron de tipo exudativo, se recuperó M. hyopneumoniae de todos los pulmones y solo se recuperó en tres animales P. multocida, 13 días después de inoculada, cuyos pulmones estaban previamente infectados con el micoplasma y no fueron capaces de eliminar a Pasteurella. Los grupos mostraron índices de crecimiento similares en la ganancia diaria de peso, sin embargo en el grupo inoculado con ambos agentes el consumo de alimento fue mayor (Ciprián et al., 1988).

6. Haemophilus parasuis - Mycoplasma hyopneumoniae - Mycoplasma hyorhinis : Infección experimental de cerdos convencionales.-En cuanto a la interacción entre Mycoplasma hyopneumoniae y/o Mycoplasma hyorhinis y/o Haemophilus parasuis el grupo también realizó un estudio en cerdos convencionales, en donde se utilizaron lechones procedentes de una granja seronegativa a PRRSv, VEA, Enfermedad del Paramyxovirus porcino, Actinobacillus pleuropneumoniae, Mycoplasma hyopneumoniae y Haemophilus parasuis. Las lesiones encontradas a la necropsia fueron recopiladas para la realización de la planimetría (Ciprián et al., 1988). Por los datos obtenidos en este experimento en el que se determinó el grado de lesión pulmonar, análisis de los signos clínicos, lesiones macroscópicas, lesiones microscópicas, recuperación de los agentes inoculados, serología, las conclusiones sugieren altamente una interacción entre Mycoplasma hyorhinis y Haemophilus parasuis y no asi, con Mycoplasma hyopneumoniae y Haemophilus parasuis (Lara et al., 1996 a; Lara et al., 1996 b)



IX. AGENTES INFECCIOSOS DE RECIENTE APARICIÓN EN EL COMPLEJO RESPIRATORIO PORCINPRRSv - Streptococcus suis, Haemophilus parasuis y Pasteurella multocida.-

También otros grupos de investigación han trabajado en las diferentes interacciones y sinergias que se pueden presentar entre estos agentes, demostrando así que existe una interacción entre el virus de PRRSv y el Streptococcus suis, en donde en contraste con la interacción producida entre el Virus de la Enfermedad de Aujeszky, en el vPRRS, se observa una activación posfagocitica del macrófago por el PRRSv (Galina, et al., 1994 a; Galina et al., 1994 b).

Esto sugiere que el mecanismo de acción de este virus no es sobre células fagocíticas. Se debe a la destrucción del epitelio nasotraqueal, con la consiguiente respuesta inflamatoria y la migración de células fagocíticas al sitio. Esto resulta en la diseminación del Streptococcus suis, ya que se demostró que las cepas virulentas del Streptococcus suis pueden sobrevivir dentro de los macrófagos. Esta falta de inmunosupresión local aunada a una intensa inmunoestimulación sistémica, puede explicar en parte el por que no se ha podido demostrar la interacción in vivo entre PRRSv y Haemophilus parasuis y PRRSv y Pasteurella multocida.

Al igual que en Streptococcus suis la infección de macrófagos por PRRSv resulta en un aumento de su capacidad de digestión de Haemophilus parasuis fagocitados, resultando en una reducción de lesiones de poliserositis en animales previamente infectados con PRRSv (Galina, et al., 1994 a; Galina et al., 1994 b; Solano, et al., 1997).



X. IMPACTO DEL DIAGNOSTICO EN EL CONTROL DE LAS NEUMONIAS
Como hemos podido darnos cuenta la situación del Complejo Respiratorio Porcino en explotaciones con destete convencional es bastante compleja y esto se incrementa en aquellas explotaciones en las que se maneja el destete precoz separado (SEW) o el destete precoz medicado (MEW) ambas prácticas que van adquiriendo popularidad en nuestro país, razón por la cual debemos de tener claramente entendidos los problemas neumónicos con un buen diagnóstico, para tomar las medidas de prevención, y en el mejor de los casos determinar un buen tratamiento con medidas de manejo adecuadas, y así controlar y posiblemente eliminar el problema de nuestra explotación, por lo que es sumamente importante entender como y porque en las diversas granjas, los diferentes agentes infecciosos (tempranos y tardios) están interrelacionando entre ellos.

En un detete precoz separado SEW o en un destete precoz medicado MEW practicado a 10 días o menores, el hato con una baja o variable inmunidad, la eliminación de la PCP será en algunos casos hasta en un 90%. ¿y como saber el status inmune?, para esto, se tendrán que realizar estudios serológicos y microbiológicos de tipo horizontal y estratificado en la granja.

En un detete precoz separado SEW o en un destete precoz medicado MEW practicado a 16 días, la oportunidad de eliminacion de la PCP será del 50%. ¿Y como saber el status inmune?, para esto, se tendrán también que realizar estudios serológicos y microbiológicos de tipo horizontal y estratificado en la granja.

En un destete convencional, por mucho que se practique a los 18 a 20 días, la oportunidad de eliminación en el caso de la PCP sería del 5%. Aquí el diagnóstico serológico y microbiológico es valioso solo para determinar el status inmune de la granja, de ahí que sea necesario tener una inmunidad de hato alta con vacunación. La forma de controlar la PCP, la neumonía enzootica, pasteurelosis pulmonar o enfermedad de Glasser u otras es por medio del diagnóstico serológico y microbiológico, este sistema de diagnóstico detecta una respuesta inmunológica de los cerdos que han estado con una infección pasada (Whittemore, 1988; Amass, 1998).

En el caso de la Pleuroneumonía Contagiosa Porcina, esta no afecta por si sola una explotación porcina, el solo diagnóstico serológico/ microbiológico de ella sola no es suficiente, las otras enfermedades como Fiebre Porcina Clásica; Enfermedad de Aujeszky; PRRSv; Neumonia Enzoótica y Enfermedad de Glasser contribuyen y complican el control y/o erradicación de la PCP, lo mismo esta sucediendo con otros agentes infecciosos, ya sean primarios o secundarios (Ciprián, 1999).

Dentro de las principales enfermedades infecciosas que afectan a los cerdos, las afecciones respiratorias son las que causan mayor impacto y mayor dificultad para controlarlas y/o erradicarlas, a continuación se describen las características de los principales patógenos respiratorios:

Microorganismo
Edad inicial De detección
Duracion de la Inmunidad materna calostral (si/no: la inmunidad es protectiva)
Edad cuando los signos clínicos son observados
Incu bación
Reser- vorios
Forma de transmisión
Actinobacillus pleuro pneumoniae

Biovariedad 1, NAD dependiente
Con ELISA: 28 a 30 días

Con neutralización de hemolisina/ F.C.: 20 a 21 días

Con aglutinación: 20 a 26 días.

(Si: probablemente no contra todos los serotipos)Todas las edades en general: crecimiento/ finalizaciónHs. variableMoscas
Pajaros
RoedoresAerosoles

Contacto directo
Mycoplasma hyo pneumoniae 14 días 4 semanas (2 semanas) 6 semanas o mas.

Gral. 3 a 6 meses de edad
10 a 16 días   Contacto directo

Aerosoles
Haemophilus parasuis 7 días 2 a 4 semanas (si) 2 semanas a 4 meses     Contacto directo Aerosoles

Heces fecales
Pasteurella multocida 20 días

21 días

7 a 10
(Probable mente) Variable: dependiendo de la afección Va riable Conejos, perros, gatos, bovinos, aves, pavos, cabras, ovejas Contacto directo

Aerosoles
Actino bacillussuis 2 días ???????? Todas las edades. Gral. Lactancia y recien destetados Días ??????? Cerdos portadores
Sterpto coccus suis Día 0 (no) Lactancia a finalización Gral: recien destetados Hs. Roedores moscas Contacto directo Durante el nacimiento


Modificado Amass, 1998.



Las pruebas serológicas y microbiológicas por lo tanto deben de poseer una buena sensibilidad y especificidad, ya que en las granjas no se observa ningún problema que pueda hacer pensar que la PCP o la neumonía enzootica, o la pasteurelosis pulmonar o enfermedad de Glasser estan presentes. La serología por ejemplo debería de utilizarse por lo tanto, entre otras, en las siguientes situaciones:

1. Confirmación de una infección crónica, previa evaluación de las lesiones pulmonares típicas.

2. Estudio de la cinética de anticuerpos en una granja infectada, para establecer programas de vacunación y/o medicación por vía oral (alimento/agua).

3. Identificación de maternidades infectadas en el caso de la compra de lechones para sistemas de tipo todo dentro, todo afuera. Este punto es importante, para la decisión de muestrear madres, se debe tener en cuenta que hay baja prevalencia, con títulos de anticuerpos bajos y por lo tanto se dificulta la interpretación (aquí la PCP deberá tratarse como una enfermedad de tipo individual, y muestrear a todas las marranas). En el caso de los lechones se deberan de muestrear antes y después del destete a partir de las 8 semanas de edad (dependiendo del sistema de SEW o MEW o convencional).

4. Verificación de la respuesta de anticuerpos frente a una vacunación (se debera de tomar en cuenta que tipo de inmunógeno se esta aplicando para interpretar los resultados serológicos con los diversos antígenos).

5. Estudios serológicos tendientes a un programa de erradicación (Gottschalk, 1998)



XI. SELECCIÓN DE LA MEJOR PRUEBA DIAGNOSTICA
Existen numerosos criterios que determinan cual es la mejor prueba de diagnóstico para una situación dada e incluyen: COSTO, SENSIBILIDAD, ESPECIFICIDAD, RAPIDEZ y DISPONIBILIDAD. Todos esos criterios pueden ser correlacionados a la situación específica. (Zeman, 1997).

Los laboratorios dedicados al servicio de la industria porcina, que cuentan con una buena infraestructura diagnóstica, como son los laboratorios de diagnostico de los Estados Unidos (Zeman, 1997) y probablemente algunos de Salud Animal de México (Valdivia et al, 1997) están enfocados básicamente entre otros, a estos objetivos:

a) A identificar la causa precisa del brote agudo de la enfermedad (desde el diagnóstico de la enfermedad hasta la elaboración de seroperfiles), lo cual permite precisar los métodos de control, para ser rápidamente implementados; permite colectar datos de la enfermedad, para establecer las estrategias de los cambios de manejo, que permitirán prevenir el mismo problema, en el siguiente ciclo de producción

b) A Identificar y eliminar a los animales expuestos conocidos (aplicando la serología ampliamente) para erradicar ciertas enfermedades reguladas por el Gobierno Federal (como es el caso de la Brucelosis)

Las reglas de oro para el Dr. Zeman (1997) y que muchos patólogos y microbiólogos compartimos para el diagnóstico de una enfermedad clínica es:

1º. Identificar las lesiones patológicas que expliquen la aparición de los signos clínicos.

2º. Identificar los patógenos o factores (traumas, toxinas, medio ambiente entre otros) que son conocidos y que están produciendo estas lesiones.

La identificación en ambos casos es crítica, ya que actúan en forma sinérgica para producir un diagnóstico definitivo. La investigación de las enfermedades infecciosas, con solo la observación de las lesiones sin el soporte microbiológico, restringe considerablemente las posibilidades del diagnóstico, así un diagnóstico definitivo por solo las lesiones no puede ser posible.

EJEMPLO: Meningitis purulenta en cerdos de 2 semanas de edad: Meningitis bacteriana. Para el diagnóstico definitivo es necesario realizar cultivos para identificar a: Streptococcus suis, Haemophilus parasuis, Escherichia coli y otros patógenos. Si fuera al contrario, la identificación de estos agentes (aún aplicando las técnicas de PCR) y que no correspondieran a las lesiones patológicas encontradas, es solo la identificación de potenciales patógenos que son ubicuos en la piara y en las instalaciones (Zeman, 1997).

Si la razón de la prueba de diagnóstico es algo (herramienta diagnóstica) para el diagnóstico clínico, muchas veces es muy importante clarificar la meta precisa de la prueba. Si se desea determinar el ambiente limpio de una enfermedad dada, varios factores deben ser considerados en la prueba diagnóstica, como serían: SENSIBILIDAD, ESPECIFICIDAD, NIVEL DE PREVALENCIA ESPERADA y NIVEL DE CONFIANZA SATISFACTORIA.

a) Sensibilidad: Es la habilidad de una prueba para detectar a TODOS los verdaderos positivos.

b) Especificidad: Es la habilidad de una prueba para detectar SOLO a los verdaderos positivos.

Si la prueba es 100% sensible no presentaría falsos negativos (no falla para detectar a los verdaderos positivos); si la prueba es 100% específica no presentaría falsos positivos (no falla para detectar a los verdaderos negativos). Sin embargo, la sensibilidad y la especificidad van de la mano, es decir cuando se afecta uno también el otro. El efecto esperado es cuando aumenta la sensibilidad, puede disminuir la especificidad o bien cuando aumenta la especificidad, puede disminuir la sensibilidad. Si fuera 100% sensible y 100% específica se estaría frente a una prueba perfecta. Desafortunadamente existen pocas pruebas perfectas en el mundo, y se tiene que determinar un cierto nivel de aceptabilidad, como ocurre con el PCR.

El nivel de aceptabilidad esta relacionado a la pregunta especifica que se intenta responder. Si la decisión a tomar es la erradicación de una enfermedad dada, la Normas Oficiales indican que la prueba debe de tener una alta sensibilidad, para identificar a los infectados en forma individual. La prueba mas sensible sería preferida, si la especificidad estuviera insignificantemente comprometida, ya que durante la erradicación un falso positivo raro (verdaderamente negativo) sería mejor para el proceso del mismo, que un falso negativo raro (verdaderamente positivo), ya que estos animales falsos negativos estarían diseminando la enfermedad en la demás población, y afectaría seriamente el proceso de erradicación (Zeman, 1997).

En general, la SENSIBILIDAD de una prueba es de suma importancia, cuando los animales probados y resultaron positivos fueron los que produjeron la enfermedad en la piara sana y limpia, y fueron los que causaron el brote. Así. la ESPECIFICIDAD se convierte de suma importancia, cuando hay interés que un falso positivo no ponga fin a la utilidad de un animal valioso (Zeman, 1997).

El costo de las pruebas de laboratorio en medicina veterinaria (sobretodo en la producción animal: cerdos) es siempre un problema, en algunas ocasiones el costo de $10.00 dólares por prueba, puede ser útil, sin embargo, el costo de $25.00 dólares por prueba, afectaría seriamente la economía de la producción animal. En otras ocasiones el costo de $50.00 dólares por prueba, puede ser de gran utilidad por la prevención de pérdidas económicas.

Ahí es donde se tiene que tener muy claro, que pregunta específica se quiere contestar con la prueba a utilizar y que a la vez sea económica. La popularidad de la prueba afecta también el precio, una demanda de la prueba hace que el laboratorio, se equipe y adquiera los reactivos necesarios para llevarla a cabo y la hace menos cara. De ahí, que los laboratorios estén considerando el costo de las nuevas pruebas y las estén comparando con el costo de las viejas pruebas, y a la vez estén analizando las ventajas y desventajas de las mismas (Valdivia et al., 1997; Zeman, 1997).



XII. TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADAS AL DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO DE LAS ENFERMEDADES RESPIRATORIAS
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica usada para amplificar regiones específicas del ADN. Los principios de esta técnica fueron descritos primeramente en 1971 pero no fue hasta los años 80s que la tecnica fue adaptada y desarrollada completamente. En aquella época esta técnica constituyó una señal muy importante de avance en la biología molecular ya que permitió la gran producción de segmentos específicos del ADN. Esta técnica se basa en el hecho de que ciertas secuencias de una región dada de la molécula del ADN son conocidas (Gingold, 1990).

Por lo tanto PCR se utiliza para amplificar la región entre dos secuencias conocidas. El producto amplificado se puede detectar por diferentes métodos, variando en sensibilidad, exactitud y viabilidad para el diagnostico de laboratorio, como son: el corrimiento en gel de agarosa, Southern Blot, microtítulo en microplacas y la detección directa de tiempo real de los productos en el tubo de PCR visualizado por fluorescencia (Mathew, 1990. Higushi et al., 1993).

La técnica de PCR se puede utilizar para identificar microorganismos causantes de enfermedad y de suma importancia en medicina en donde es necesario un diagnostico rápido. Hoy en dia el PCR no se puede considerar como substituto de la bacteriología clásica. PCR es de inferior sensibilidad a los métodos clásicos cuando las bacterias tienen crecimiento rápido, no obstante tiene muchas ventajas al detectar microorganismos de crecimiento lento o cuando la detección se lleva a cabo en muestras contaminadas. Una de las ventajas más evidentes de la técnica de PCR es la rapidez de los resultados y de que se pueden trabajar muchas muestras. Con la bacteriología tradicional se necesita un mínimo de 2 días para alcanzar una diagnostico rápido. Pero en el caso del PCR, solamente algunas horas son necesarias. Por lo tanto las bacterias de lento crecimiento, o bacterias no cultivables, virus, así como hongos, son los mejores candidatos para ser detectados por PCR (Calsamiglia. 1999; Calsamiglia et al., 1999).

Como ventajas del PCR es la variedad de aplicaciones, y tradicionalmente se ha utilizado como una herramienta de díagnóstico para detectar ciertos microorganismos especificos en muestras clínicas. El PCR también puede utilizarse para realizar estudios epidemiológicos y llevar a cabo una vigilancia epidemiologica en las granjas animales. Otra importante aportacion del PCR es que permite la deteccion de los animales que son portadores de cierta enfermedad (Calsamiglia, 1999; Mendoza et al., 1999) .

Como desventajas del PCR. La detección de falsos negativos: Si los iniciadores no son específicos, si la concentración de los componentes no estan estandarizados y las condiciones de la reacción no estan claras podrían obtenerse resultados falsos negativos. Con respecto a los resultados falsos positivos: Si los iniciadores son homólogos a las secuencias pero no al gen blanco o si los productos y soluciones estan contaminadas con reacciones anteriores, entonces se podrian presentarse falsos positivos (Calsamiglia, 1999). Por lo que el PCR detecta ADN pero no la distingue entre los microorganismos vivos y muertos, ni tampoco detecta sensibilidad a antibióticos.

Muchas técnicas basadas en PCR han sido descritas y se han aplicado en la medicina veterinaría. El diagnostico rutinario para algunos laboratorios de enfocan a los siguientes microorganismos. Pasteurella multocida se detecta toxina positiva DNT (+); Mycoplasma hyopneumoniae (nested-PCR); Streptococcus suis y Haemophilus parasuis (rep-PCR) y PRRSv (Taqman). Éstos son los agentes principalmente implicados en el Complejo de la Enfermedad Respiratoria de los Porcinos (PRDC). Este síndrome es cada vez mas importante la causa de una baja productividad de los cerdos, caracterizado por un crecimiento lento, la baja eficacia alimenticia, anorexia, tos y el disnea, donde están implicados los microorganismos antes de mencionados (Calsamiglia, 1999; Calsamiglia et al., 1999; Dee, 1996; Lichtensteiger et al., 1996).

Dentro de este complejo PRDC se encuentra mas frecuentemente diagnosticado al Mycoplasma hyopneumoniae (Dee, 1996). El estudio de la neumonía causada por Mycoplasma hyopneumoniae ha sido obstaculizada por métodos inadecuados de diagnóstico. Muchas de las pruebas actualmente disponibles son relativamente insensibles o no específicas, demasiado costosas o difícil para realizar un diagnóstico rutinario. El nested-PCR ha permitido un diagnóstico rápido y actualmente en la Universidad de Minnesota se lleva como diagnóstico de rutina. La extracción del DNA se lleva a cabo de los hisopos nasales que llegan de la muestra de los cerdos (Calsamiglia et al., 1999).

Por otro lado las cepas de Pasteurella multocida toxigénicas y no toxigenicas no pueden ser detectadas por la morfología o por las reacciones bioquímicas estándares. La viabilidad de usar PCR para la detección exacta y rápida de Pasteurella multocida toxigénica de hisopos nasales fue investigada pero los resultados no fueron concluyentes (Leinchtensteiger, et al., 1996). Sin embargo otro estudio en la Universidad de Minnesota mostro que de cultivos purificados, se podian detectar cepas de Pasteurella multocida DNT (+), esta técnica fue muy sensible y puede ser comparada con ELISA y con el cultivo celular (Amigot, et.al., 1998).

La infección de los lechones con el virus del Sindrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRSv) se asocia al aumento de las enfermedades respiratorias, con tasa de crecimiento bajo, y elevada mortalidad. El PRRS esta siendo apararentemente controlado con el uso de vacunas de vacunas vivas (MLV) o con manejo (Dee y Philips, 1997). Es importante determinar cuando la infección ocurre en la vida de los cerdos, por lo que que el PCR (Taqman) se ha utilizado como una prueba de díagnóstico para detectar el ácido nucleico viral del PRRS. Esta técnica se puede llevar a cabo en suero, semen, o tejido para detectar el RNA o la ADN viral (Molitor, 1997). En este estudio los resultados de la prueba de PCR indicaron que la serología no solamente puede ser adecuada para definir el status de PRRSv en un hato . Este caso sugiere que las técnicas moleculares puedan ser útiles conjuntamente con la serología. Observaciones de muestras clínicas, y el analisis de los datos de la producción determinaron correctamente el status de PRRSv en el hato y asi definir y establecer claramente el período en la vida del lechón durante la cual son infectados. Una vez que se recoja y se evalúe esta información, las estrategias óptimas de la intervención se pueden determinar para el hato (Dee y Philips, 1997, Zimmerman, et.al., 1998).

En el caso de Streptococcus suis. y de Haemophilus parasuis la técnica de rep-PCR ha mostrado resultados muy útiles para el estudio de la epidemiología en las piaras. La técnica rep-PCR identifica cepas individuales, aún del mismo serotipo (Torremorrell, 1999). Hemos demostrado que la mayoría de los brotes de la enfermedad en granjas son debidos a una sola cepa. También esta técnica nos ha permitido observar la transmisión de estas cepas entre granjas (Mendoza et al., 1999).



XIII. SISTEMA RÁPIDO PARA EL DIAGNOSTICO SEROLOGICO DE App- Hps-Pm-Mh DENOMINADO NEUMOTESTMR . (Marca Registrada UNAM). (Ciprián, et al. 1999)

1. METODOS DE DIAGNOSTICO DE LAS ENFERMEDADES RESPIRATORIAS BACTERIANAS EN MÉXICO.

El diagnóstico definitivo de las enfermedades respiratorias del cerdo, en las que se incluyen; Pleuroneumonía Contagiosa Porcina, PCP; Neumonía Enzoótica, NE; Pasteurelosis Pulmonar, PP y Enfermedad de Glasser, EG, deben ser oportunos y rápidos y es esencial para identificar a Mycoplasma hyopneumoniae y a los diferentes serotipos y tipos prevalentes de Actinobacillus pleuropneumoniae; Pasteurella multocida y Haemophilus parasuis prevalentes en las zahúrdas y en las granjas, así como en las diferentes zonas porcícolas del país, ya que permite utilizar y/ó elaborar los biológicos/reactivos adecuados para el diagnóstico, así como los biológicos para la inmunización de los animales susceptibles. En México, así como en los países latinoamericanos, el diagnóstico de las enfermedades respiratorias bacterinas lo llevan a cabo de la siguiente manera:

a) Observación de los signos clínicos en el cerdo y en los de la zahúrda, este método no es confiable, ya que solo los signos clínicos que se presentan en cursos agudos de las afecciones respiratorias, permiten identificar a la PCP, quizás a la EG, mientras que en los casos crónicos de la misma PCP y EG, además de la NE y PP pasan inadvertidos, y solo se reflejan en los parámetros de la Ganancia Diaria de Peso (GDP) y Conversión Alimenticia (CA).

b) Observación de las lesiones a la necropsia de los animales muertos de los casos agudos o durante la inspección de las canales, en los centros de abasto de los casos crónicos. Para el estudio patológico se requiere de los servicios de un Médico Veterinario especialista en Patología, y aunque algunas lesiones son propias de la PCP se pueden confundir con EG, no así con NE y PP, sin embargo no podemos identificar a los serotipos prevalentes en las zahúrdas de una misma granja.

c) Aislamiento, identificación y tipificación de los microorganismos presentes en los pulmones de los cerdos con problemas agudos o bien crónicos. Este proceso tarda de 48 a 72 horas en el mejor de los casos, como seria con Actinobacillus pleuropneumoniae y Pasteurella multocida; pero es lento en el caso de Haemophilus parasuis, y mas lento para Mycoplasma hyopneumoniae. Para realizar estas técnicas es necesario contar con un laboratorio bien establecido, en donde además de contar con los reactivos, medios de cultivo y antisueros conocidos, se requiere del personal calificado, y en México existen pocos laboratorios que brindan este servicio.

d) El diagnóstico serológico se lleva a cabo en los cerdos vivos de las granjas o en los cerdos en los centros de abasto. El método serológico es uno de los mas adecuados, ya que se puede realizar en los animales vivos con y sin signos clínicos, no requiere del sacrificio de los cerdos, es mas rápido y nos permite hacer perfiles de la enfermedad, identificando el punto de infección en la granja, además permite identificar los serotipos prevalentes. Para el diagnóstico serológico de la PCP, NE, se encuentran algunas pruebas tales como; aglutinación, aglutinación con partículas de latex, aglutinación lenta en tubo; aglutinación lenta en tubo con 2-mercaptoetanol, hemoaglutinación indirecta, fijación de complemento y ELISA entre otras. Pocas de estas pruebas se realizan en México, y las que se utilizan son mas para estudios de investigación que para diagnóstico, debido principalmente a la falta de infraestructura, equipo, y personal capacitado, que solo los laboratorios de las Universidades e Institutos cuentan (Ciprián et al., 1990).

La problemática acerca de la PCP, PP, NE y EG expuesta anteriormente motivo a los autores (Ciprián et al., 1988; Colmenares et al., 1992; Mendoza et al., 1992 y Torres et al., 1992) de este trabajo al desarrollo de un paquete tecnológico diseñado para elaborar a nivel industrial KITS de diagnóstico serológico de la PCP, PP, NE y EG; empleando tecnología sencilla y de bajo costo; paquete tecnológico denominado NEUMOTESTmr App; -Pm; -Mh; -Hps (mr: marca registrada por la UNAM), que permitirá conocer la situación de la granja con respecto a la enfermedad, permitirá conocer mediante los perfiles serológicos los puntos de infección o las ventanas inmunológicas y así poder establecer las medidas de control necesarias.

2. RESUMEN DE LA INVENCION.
El paquete tecnológico NEUMOTESTmr App; -Pm; -Mh; -Hps (mr: marca registrada por la UNAM), consiste en un método rápido que no requiere equipo de laboratorio, se realiza en unos minutos y solo requiere de pocos mililitros de suero del animal a estudiar, por lo que no se necesita de personal calificado. El método rápido es un ensayo de diagnóstico serológico por medio de una prueba de aglutinación directa en placa, que ofrece la única oportunidad de distinguir directamente en la propia granja, si un cerdo ha sido infectado o si el cerdo está sano.

NEUMOTESTmr App; -Pm; -Mh; -Hps (mr: marca registrada por la UNAM), es una prueba de aglutinación en placa destinada a identificar directamente anticuerpos (de la clase IgG de alta afinidad) capsulares de Actinobacillus pleuropneumoniae (serotipos 1 al 12); anticuerpos (clase IgG) LPS de Pasteurella multocida y anticuerpos (clase IgG) capsulares de Haemophilus parasuis y anticuerpos IgG contra Mycoplasma hyopneumoniae presentes en el suero de cerdos de cualquier edad.

El paquete tecnológico consiste en un estuche portatil diseñado para diagnosticar cerdos infectados con Pasteurella multocida (Pasteurelosis Pulmonar, PP); Mycoplasma hyopneumoniae (Neumonía Enzoótica, NE); Actinobacillus pleuropneumoniae (Pleuroneumonía Contagiosa Porcina, PCP) y Haemophilus parasuis (Enfermedad de Glasser, EG). El sistema rápido de diagnóstico serológico se realiza mediante las pruebas de aglutinación o de aglutinación en latex que permite hacerlo en la misma explotación porcina y además de que distingue en los casos de Pasteurella multocida (Pasteurelosis Pulmonar, PP); Actinobacillus pleuropneumoniae (Pleuroneumonía Contagiosa Porcina, PCP) y Haemophilus parasuis (Enfermedad de Glasser, EG), si los cerdos están infectados y en el caso de Mycoplasma hyopneumoniae (Neumonía Enzoótica, NE) determinar los puntos de infección mediante el uso de perfiles serológicos.

El sistema de diagnótico serológico es un estuche que contiene los antígenos, para realización de las pruebas serológicas; estos antígenos varían desde de Pasteurella multocida (tipos capsulares A y D comunes); Actinobacillus pleuropneumoniae (serotipos capsulares: 1, 2, 3, 4,5a, 5b, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12); Haemophilus parasuis (serotipos capsulares: de alta virulencia ++: 1, 5, 10, 12, 13 y 14; o bien serotipos de relativa virulencia +: 2, 4 y 15); hasta el de Mycoplasma hyopneumoniae.

El método para diagnosticar la pasteurelosis pulmonar, la pleuroneumonia, la enfermedad de Glasser o la neumonía enzoótica comprende los pasos de preparar un reactivo de aglutinación o de aglutinación en latex; de estabilizar el reactivo utilizado, a temperatura ambiente en un tiempo corto; de depositar enseguida el suero de muestra en una de las celdas de la placa de prueba; incorporar el reactivo de aglutinación o de aglutinación en latex a la muestra y mezclar enseguida, enseguida se someten los resultados a un método comparativo de interpretación cualitativa, en donde la muestra celda de cerdos infectados presenta un aspecto grumoso, en tanto que la celda de cerdos sanos ó vacunados (siempre y cuando no sean recién vacunados, es decir después de 15 días posvacunación), aparecerán sin grumos.

Otro de los objetivos de la invención es proporcionar un equipo y método en donde los reactivos utilizados permiten que el diagnóstico de las enfermedades respiratorias bacterianas sea de fácil operación y eficiente por no presentar falsos negativos, permitiendo el manejo de los animales sanos de la granja cuando se utiliza como prueba tamiz de monitoreo. Otro mas de los objetivos de la invención es que solo se requiere de una mínima parte del suero para efectuar el diagnóstico y por lo mismo se pueda aplicar a una granja completa, lo que permite evaluar el status inmune de la granja valorando e interpretando los seroperfiles.


XIV. AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen al MVZ David Trujillo por la asesoría técnica en informática.


XV. REFERENCIAS

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Autor/es
Profesor de Carrera en el Posgrado de Producción y Salud Animal y de la licenciatura de M.V.Z. de la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, UNAM. En el área de microbiología veterinaria de porcinos y otras especies domesticas. Profesor definitivo en Virología Veterinaria.
 
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