Microorganismos con control sobre Fusarium en maíz

En este trabajo se presenta la metodología seguida para generar una colección de 10 mil microorganismos nativos de suelos sembrados con maíz en Sinaloa, así como el establecimiento de un laboratorio automatizado que permita evaluarlos rápidamente para localizar a aquellos que muestren capacidad de frenar el crecimiento y proliferación de Fusarium en maíz.

El texto que se presenta en estas páginas es el resultado del proyecto Obtención y evaluación de un banco de germoplasma² de microorganismos nativos de Sinaloa asociados a maíz para desarrollar bioprotectores para el control de Fusarium, apoyado por Fundación Produce Sinaloa, A. C., a través de su Consejo Consultivo zona norte en 2008-2009.

Perspectivas del proyecto

Este proyecto prevé contar para 2012 con un paquete tecnológico para el uso de un producto a base de microorganismos nativos de Sinaloa contra Fusarium en maíz.
El principio del producto se basará en aumentar en número las poblaciones de microorganismos del suelo que puedan controlar el crecimiento y proliferación de Fusarium en maíz.
A continuación se presenta el esquema global del desarrollo de la investigación.

Figura 1. Esquema global del proyecto.

Existen experiencias en donde diferentes cultivos han tenido que ser eliminados de algunas regiones del país por la llegada y establecimiento de una nueva enfermedad, éste es el caso del frijol soya en Sinaloa, el cual ha sido prácticamente erradicado de las tierras de cultivo del estado por el efecto de la virosis.

Lo anterior pudiera ser evitado si se contara con tecnología que permitiera responder oportunamente a la presencia de enfermedades que llegan y se establecen en una región, como pudiera ser el caso de Fusarium en maíz.
Actualmente existen diversos esfuerzos en el país por aislar microorganismos nativos para su uso agrícola, pero éstos se ven limitados por la cantidad de horas-hombre que se requieren para realizar los escrutinios en los ensayos de antagonismo tradicionales, y por lo general se evalúan de decenas a cientos de microorganismos con magros resultados.

El equipo automatizado que se adquirió en el presente proyecto permite inventariar el banco de microorganismos realizando la identificación a nivel especie de los especímenes, así como masificar el escrutinio y detección de miles de probables organismos antagonistas de enfermedades.

Lo anterior revestiría un esfuerzo único en el estado (y en el país) para el combate de enfermedades en los cultivos, y contribuiría a que en el futuro Sinaloa se coloque no sólo a la vanguardia en producción agrícola primaria sino también en empleo de herramientas biotecnológicas que apoyen la sustentabilidad de la producción.
Al llegar a su conclusión (2012), el proyecto deberá brindar una herramienta que permita la rápida evaluación de microorganismos nativos de Sinaloa que funcionen como bioprotectores ante patógenos³ del cultivo de maíz.

Figura 2. Aislado de Fusarium sp. patogénico de maíz (cortesía del Dr. Rubén Félix Gastélum).

Interacción microbiana en el suelo

Los diferentes microorganismos que habitan en el suelo interaccionan de diferente forma con hongos patógenos y, en general, controlan su crecimiento. Cuando se presenta una enfermedad en el suelo es porque el patógeno aumenta su población con respecto a otros microorganismos con los que convive.

La agricultura intensiva causa desbalances en estas interacciones microbianas y en ocasiones los hongos patógenos pueden aumentar en población, esporular⁴ y permanecer como una amenaza latente en
los suelos agrícolas.

Estudios en Sinaloa han permitido identifi car morfológicamente como Fusarium spp. al fi topatógeno causante de enfermedades en suelos regionales. Actualmente se trabaja para determinar de forma molecular al organismo causal de la sintomatología que se presenta en la fusariosis del maíz.

Los fitopatógenos que se empleen en este estudio para el escrutinio masivo de antagonismo en etapas posteriores son aislados que están siendo caracterizados actualmente a nivel morfológico, molecular y de patogenicidad en maíz.

La utilización de microorganismos antagonistas a fi topatógenos representa una alternativa al uso de agroquímicos, los cuales son nocivos para la salud humana, además de que contaminan el suelo y el agua.
El valor de una colección de esta naturaleza residiría en contar con un conjunto de microorganismos ya aislados e identificados para ser probados contra patógenos que adquirieran importancia en la agricultura regional.

Un beneficio adicional es que dentro de la colección se encontrarían también organismos nativos benéficos, como fijadores de nitrógeno yfósforo en raíces de plantas, que pudieran ser empleados como biofertilizantes⁵, en la industria alimentaria, elaboración de fármacos o como compuestos con propiedades benéficas para la salud y en la producción de bioenergéticos⁶.

Figura 3. Banco de microorganismos criopreservados a -70º C.

Figura 4. Laboratorio de Robótica Molecular del CIIDIR-Sinaloa.

A pesar de la importancia que reviste la producción de grano de maíz en México, con más de 8 millones de hectáreas sembradas y un valor de producción de 54 mil 418 millones de pesos anuales, el aprovechamiento de la diversidad de microorganismos como fuente de cepas⁷ que puedan controlar a los patógenos causantes de enfermedades en plantas (fi topatógenos) es un área poco explorada en México, en parte porque no existen colecciones de especímenes establecidas para este propósito y porque no se han desarrollado las metodologías requeridas.

En 2007 las pérdidas en la superfi cie sembrada con maíz en nuestro país fueron de más de 784 mil hectáreas; si se considera que de 10 a 20% se debieron a enfermedades, se estaría hablando de que de 78 mil 400 a 115 mil 680 hectáreas fueronabatidas por esta causa, lo que justifi caría la creación de herramientas tecnológicas que pudieran ser empleadas para la protección de un sistema producto tan importante para México, como es el maíz.

Aunque actualmente se emplean agentes bioprotectores, en muchos casos su aplicación para el control de enfermedades en cultivos como el maíz no resulta exitosa, una de las principales razones es porque los microorganismos que se emplean no son nativos de la región donde se aplican.

Importancia del maíz en Sinaloa

Para Sinaloa, el maíz representa una superficie cultivada de 590 mil 715.91 hectáreas, y un valor de producción de 12 mil 20.6 millones de pesos anuales.

Por su importancia de extensión, económica y por el número de empleos que de él derivan es de capital importancia defi nir oportunamente esquemas que protejan este cultivo en el estado.

La generación de un banco de microorganismos presentes en suelos de Sinaloa permitiría contar con una colección masiva con la posibilidad de que fuese analizada para seleccionar enemigos nativos de fitopatógenos de importancia económica para el estado, en este caso Fusarium en maíz.

Los microorganismos aislados del suelo o rizósfera⁸ asociados a un cultivo específi co están mejor adaptados a ese cultivo y puedenproveer un mejor control biológico de enfermedades, en comparación

Figura 5. Importancia económica del maíz en Sinaloa.con organismos aislados de otras especies vegetales; además, si son nativos de Sinaloa estarán adecuados a las condiciones climatológicas y del suelo de la entidad.

 

METODOLOGÍA

Actividades realizadas durante 2008-2009 para la obtención de microorganismos en suelos cultivados con maíz en Sinaloa.
Muestreo de suelos de cinco lotes con cultivo de maíz donde se presentó fusariosis en el ciclo 2008-2009 en el norte de Sinaloa. La estrategia seguida para el procedimiento de muestreo en el proyecto se señala a continuación:

1. Muestreo. Se realizaron muestreos en cinco lotes de maíz, en los que se presumía presencia de Fusarium spp.
El primer muestreo se efectuó el 18 de febrero de 2009 en El Serrano, municipio de Salvador Alvarado, y dos en Angostura (en Alhuey y 18 de Diciembre). El 20 de marzo de 2009 se muestrearon otras dos parcelas en Guasave (en Casa Blanca y La Trinidad).

En cada uno de los lotes se tomaron 10 plantas completas (cinco enfermas y cinco asintomáticas⁹) y suelo próximo a ellas. Se muestreó con pala el sistema radical (a una profundidad de cero a 30 centímetros), cada punto de muestreo, inclusive dentro del mismo lote, fue georreferenciado¹⁰ con un GPS E-Trex¹¹.
Cada muestra fue etiquetada con datos de su origen para su procesamiento en laboratorio.

Una vez en el laboratorio, en un tubo Falcon de 50 mililitros se tomaron 40 gramos de suelo, lo más cercano posible a las raíces, para ponerlo a secar. Una vez secas, las muestras fueron tamizadas¹² por separado para remover las partículas gruesas del suelo, así como los restos de vegetales.

Se formaron dos muestras compuestas de cada uno de los cinco puntos (plantas) de muestreo (condición sana y condición enferma), al mezclar 3 gramos de cada una de las muestras individuales, lo que dio como resultado un total de 10 muestras compuestas (representando 50 plantas), con lo que se obtuvo un número de muestras deseable y fácil de trabajar.

La confirmación de fusariosis se realizó visualmente, por sintomatología y con asesoría del Dr. Miguel Apodaca Sánchez¹³, en los sitios muestreados. En tres de los cinco sitios (El Serrano, Alhuey y 18 de Diciembre) se tomaron muestras que fueron llevadas al laboratorio de Apodaca Sánchez para la confirmación (por cultivo y observación) de sus características morfológicas.

Figura 6. Cultivo de maíz afectado por fusariosis.

Figura 7. Comparación de una planta sana con una que presenta fusariosis.

Figura 8. Lote de maíz afectado por fusariosis en la comunidad de El Serrano. Observe la falta de uniformidad de crecimiento entre plantas enfermas y asintomáticas.

Figura 9. Toma de una muestra de planta sana.

Figura 10. Planta de maíz dañada presuntivamente por Fusarium sp.

Los resultados serán monitoreados en 2009-2010 en el laboratorio del Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR), unidad Sinaloa, con pruebas de identifi cación molecular en los aislados, por medio de la "secuenciación" (‘de secuenciar: determinar el orden exacto en que se encuentran dispuestos las bases químicas del ácido desoxirribonucleico. El orden de los pares de bases de una cuerda de ADN determina qué proteínas son producidas, y por consiguiente la función de una célula determinada') de regiones del ácido desoxirribonucleico (ADN) de Fusarium (ITS rDNA), que se emplean como huellas genómicas¹⁴ de ADN para estudios de identificación a nivel especie.

Aislamiento de mil microorganismos de las 10 muestras compuestas de rizósfera de maíz para conformar el banco con 10 mil bacterias.

Para la obtención de los microorganismos del banco de germoplasma se realizaron diluciones¹⁵ seriales (-1, -2, -3, -4, -5, -6 y -7) de cada uno de los puntos de muestreo para las dos condiciones (plantas sanas y enfermas).
Se tomaron 100 microlitros de cada dilución y se colocaron en los siguientes medios selectivos para distintos grupos de bacterias que han sido reportados como agentes de control de Fusarium (las cajas de petri se incubaron a 25º C):

1. Medio nutritivo general para la obtención de organismos del género Bacillus sp. (caldo de cultivo denominado Luria Bertolini).
2. Medio para bacterias ácido-lácticas (medio de Man, Rogosa y Sharpe).
3. Agar¹⁶ para el aislamiento de actinomicetales (Actinomycete Isolation Agar).
4. Medio de cultivo denominado B de King para aislamiento de Pseudomonadales. 

Figura 11. Preparación de diluciones seriales en condiciones de esterilidad, en campana de flujo laminar.

Figura 12. Plaqueo de diluciones seriales en medio B de King, en condiciones de esterilidad, para la obtención de aislados.

Las bacterias que crecieron a las 24 y 48 horas (y en algunos casos después de una semana) fueron recuperadas y purifi cadas. De cada medio de cultivo se recuperaron 576 bacterias (288 de la condición enferma y 288 de la condición sana). Como son cuatro medios de cultivo por cada punto de muestreo, de cada lote se recuperaron mil 152 aislados, y como son cinco puntos de muestreo con dos muestras en cada punto, una de planta sana y una de planta enferma (10 muestras en total) se obtuvo un banco de germoplasma final de 11 mil 520 aislados.

Se considera 10% más de bacterias aisladas porque el procedimiento de congelación para preservarlas tiene una efi cacia de aproximadamente 90%, por lo que se espera finalizar con un banco de al menos 10 mil aislados bacterianos. 


Generación del banco de germoplasma criopreservado con los organismos puros.

Una vez obtenidas las colonias puras, para su crecimiento se colocaron en placas de formato de 96 cavidades, de 2 mililitros, que contenían 1 mililitro de medio líquido (igual al del medio del que Figura 13. Colección de microorganismos aislados de rizósfera de maíz, en placas de formato de 96, a -70 °C. fueron aisladas y purificadas).

Las placas fueron almacenadas a 25º C por 18 horas, en agitación a 250 repeticiones por millón; de cada placa se tomaron 98 microlitros de cada muestra y se transfirieron a placas de PCR de formato de 96 agujeros para riopreservar. Las placas poseían 42 microlitros de glicerol¹⁷, para un volumen fi nal de 140 microlitros.
Cada una de las bacterias aisladas (11 mil 520) se colocó por triplicado en diferentes placas. Dos réplicas se acomodaron en dos ultracongeladores en las instalaciones del CIIDIR, lo que evitará que se pierda el banco en caso de que uno de los ultracongeladores sufra algún desperfecto.

La tercera réplica del banco será utilizada para revivir las bacterias, realizando las pruebas de viabilidad de las mismas para saber si sobreviven al proceso de congelación. Las bacterias que sobrevivan se emplearán en la realización de pruebas de identifi cación molecular y de bioensayos¹⁸ de antagonismo.

Adecuación del espacio físico para el laboratorio de robótica y adquisición del equipo. Se acondicionó un área de laboratorio de 6 por 8 metros con instalaciones y mobiliario óptimos para el manejo de microorganismos y muestras de ADN.
Este laboratorio cuenta con 10 espacios de trabajo para el personal, y un área de campana de fl ujo laminar para el manejo estéril de los microorganismos y la generación del banco de germoplasma.

También posee equipos de refrigeración, congelación y ultracongelación, necesarios para generar y mantener el banco de microorganismos por largos periodos de tiempo (hasta décadas); una campana deextracción de humo para el manejo de reactivos¹⁹ de alto riesgo, como solventes o ácidos que generan vapor que resulta peligroso para los trabajadores; y cuenta con un área parcialmente aislada en donde se colocó el equipo de automatización masiva (robots).

Para esta área aislada se adquirió un conjunto doble de dos equipos de automatización de la marca Qiagen²⁰.

El conjunto incluye dos robots denominados Qiacube, que procesan por hora 12 muestras de bacterias para extraer su ADN (lo que da un total de 24 muestras por hora). Esto permite que en una jornada laboral de ocho horas se puedan trabajar hasta 192 muestras. Así es posible realizar en pocas semanas este procedimiento en todas las muestras del banco.

Figura 14. Exterior del laboratorio de robótica.

Figura 15. Equipo del laboratorio de robótica.


Figura 16. ista interna del laboratorio de robótica.


Figura 17. Área de robótica molecular. 


Figura 18. Equipo Qiacube de Qiagen. Robot extractor de ADN y proteínas. 

Los Qiacube también realizan procedimientos de purifi cación y limpieza de ácidos nucleicos y proteínas con paquetes de reactivos diseñados por Qiagen, con probada calidad y efectividad.

Estos equipos serán empleados para realizar la identifi cación a nivel especie de cada una de las bacterias del banco en la siguiente etapa del proyecto.
Los otros dos robots que incluye el conjunto adquirido se denominan Qiagility. Cada Qiagility puede manipular la colocación de muestras de PCR o de cualquier procedimiento sencillo para dispensar líquidos en placas de 96 pozos en 27 minutos, lo que permite colocar por equipo 192 reacciones por hora, o mil 536 muestras en una jornada laboral de ocho horas.

Este equipo permitirá realizar todo el procedimiento automatizado para desarrollar ensayos de antagonismo en medio líquido para enfrentar a todas las bacterias del banco con Fusarium, repetir el procedimiento para verificar las observaciones iniciales y seleccionar aquellos microorganismos que muestren capacidad de inhibir el desarrollo y crecimiento del hongo fitopatógeno.

Los Qiagility se complementan con equipo ya existente en el CIIDIR, como termocicladores²¹ para amplificar por PCR las regiones genómicas de ADN de cada bacteria, lo que permite identifi carlas a nivel de género y especie, y en casos específi cos a discernir entre razas de organismos fitopatogénicos.

Estas plataformas robóticas que emplean formatos de 96 pozos se pueden acoplar a cualquier equipo que utilice este mismo formato. Así,el bioensayo requerirá del uso de una centrífuga²² de velocidad intermedia con rotores23 para este tipo de placas de 96 lugares, y un equipo que lea fluorescencia24, procedimiento que se empleará para realizar el bioensayo de antagonismo en formato de 96.

Los equipos de la marca Qiagen permiten realizar (con el empleo de paquetes) los procedimientos requeridos para la identifi cación molecular por organismo; con un costo muy bajo y con alta pureza y eficacia.

El conjunto doble asegura que será posible procesar un gran número de muestras de manera rápida y eficaz, y automatizará el proceso del bioensayo de antagonismo a Fusarium "in vitro" (‘técnica para realizar un determinado experimento en un tubo de ensayo') para miles de muestras en corto tiempo, para después poder cumplir con las siguientes etapas propuestas para el proyecto, incluyendo la identificación molecular para obtener la colección de bacterias debidamente inventariada, designando con nombre de género y especie a cada uno de los microorganismos que conformen el banco.

Figura 19. Acercamiento del equipo Qiacube.

Figura 20. Equipo Qiagility, de Qiagen. Robot manipulador de muestras líquidas.

Figura 21. Equipo de PCR en tiempo real, de Qiagen.  

Una vez estandarizada la metodología, ésta puede ser transferida para la identificación molecular de los microorganismos aislados en el banco de germoplasma.

Estos pasos deberán conducir a la obtención de herramientas de control de fusariosis en maíz y a desarrollar agentes de biocontrol de forma más rápida.

Figura 22. Aislados patogénicos de Fusarium (cortesía del Dr. Miguel Apodaca).

Toma de muestras, aislamiento y pruebas de patogenicidad para la obtención de los aislados de Fusarium más patogénicos para maíz, a ser probados en los bioensayos automatizados. De las muestras de plantas con signos de fusariosis para la creación del banco se tomaron pedazos de material vegetal (raíces y tallos), en los que se verificó la presencia de Fusarium, se aisló el hongo y se motivó su crecimiento.

De forma adicional, en los laboratorios de Miguel Apodaca Sánchez y Rubén Félix Gastélum²⁵ se evalúan algunos aislados de muestras desde un punto de vista morfológico, muestras que fueron recolectadas en las Juntas Locales de Sanidad de Ahome y en Juan José Ríos.

Actualmente, las pruebas de patogenicidad se realizan en el laboratorio del Dr. Félix Gastélum. La metodología consiste en esterilizar la semilla después de un tratamiento hidrotérmico con cloro, posteriormente se siembra la semilla en frascos con medio nutritivo (agua-agar) y enseguida se inocula con el aislado de Fusarium, empleando las esporas del hongo, y se observa por 15 días. Después de este lapso se analiza la agresividad del fitopatógeno en base a una tabla de índice de severidad previamente establecida (ver Cuadro 1). Estas pruebas se realizan en maíz blanco (híbrido Cebú, de Asgrow) y amarillo.

Cuadro 1. Escala para la evaluación de la severidad de los síntomas de la marchitez por Fusarium en plántulas de maíz.

De los ensayos realizados se han seleccionado tres cepas con probada patogenicidad a nivel de bioensayo en la planta, y se estudia la opción de enfrentar las cepas patogénicas de manera individual con las bacterias o con la mezcla de las tres distintas cepas de Fusarium en las siguientes etapas del proyecto.

RESULTADOS

1. Se posee un banco de 10 mil microorganismos nativos de suelos cultivados con maíz en Sinaloa, aislados, purifi cados y mantenidos en2. Se instaló y está en marcha un laboratorio de robótica en el CII-DIR-Sinaloa, destinado a la evaluación de los 10 mil microorganismos.

CONCLUSIONES

1. Se cuenta con un banco de microorganismos procariotas (bacterias) tomados de suelos asociados a maíz en Sinaloa, que consta de 10 mil especímenes aislados, purifi cados y mantenidos en criopreservación a -70 °C.

Es importante hacer notar que el banco no representa 10 mil diferentes especies de bacterias, sino que muestra redundancia, esto es:
una misma especie de microorganismos puede estar presente repetidas veces, lo que no limita los hallazgos ya que se ha reportado que diferentes aislados de la misma especie pueden comportarse como patógenos o como antagonistas de patógenos, o no producir ninguna criopreservación a -70 °C.

2. Se instaló y está en marcha un laboratorio de robótica en el CII-DIR-Sinaloa, destinado a la evaluación de los 10 mil microorganismos. 

Figura 23. La plataforma robótica se empleará para monitorear a antagonistas de enfermedades causadas por hongos en el suelo.

Figura 24. Los robots serán usados para la identifi cación molecular de los 10 mil microorganismos de la colección.respuesta frente a un patógeno.

La colección de microorganismos aislados de la rizósfera de maíz se encuentra depositada ofi cialmente, como colección científi ca registrada, en el Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR), unidad Sinaloa, del Instituto Politécnico Nacional.

2. Se instaló y está en marcha un laboratorio de robótica en el CII-DIR-Sinaloa, destinado a la evaluación de los microorganismos del banco de germoplasma, en cuanto a su capacidad bioprotectora contra el ataque de Fusarium in vitro y a nivel de planta.

El banco de bacterias y el laboratorio de robótica permitirán el desarrollo de productos basados en microorganismos nativos de Sinaloa que funcionen como antagonistas de Fusarium en maíz.

El mercado de productos agrobiológicos existe, sin embargo al utilizar productos que fueron desarrollados para otras regiones geográficas y condiciones climatológicas se corren dos riesgos.
1. Un riesgo es que los microorganismos en los que se basa el producto no se adapten a las condiciones del suelo y clima de la región donde se aplique, por lo que el tratamiento no funcionaría.
2. Otro riesgo es que los microorganismos desplacen no sólo a los patógenos, sino que tengan incidencia negativa en poblaciones de microorganismos benéfi cos para la planta, o que resultan necesarios para la supervivencia de toda la comunidad microbiana en el suelo; esto crearía un desbalance ecológico microbiano mayor del que existe actualmente en los suelos agrícolas.

Debido a lo anterior se plantea que los productos agrobiológicos se desarrollen con microorganismos nativos de las regiones en las que se va a aplicar.

El propósito del proyecto a largo plazo (2012) es contar con un paquete tecnológico para el uso de un producto a base de microorganismos nativos del suelo de Sinaloa para ser utilizado en cultivos de maíz afectados por Fusarium en el estado.

BIBLIOGRAFÍA

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