Estudio preliminar cronofarmacocinético del fenobarbital en perros sanos.

El fenobarbital sódico es un barbitúrico utilizado, como agente anticonvulsivante. Presenta ciertos efectos colaterales como sedación, ataxia, polidipsia, poliuria, polifagia, que tienden a desaparecer en pocos días. La cronofarmacocinética, estudia las variaciones farmacocinéticas de los fármacos a lo largo de un ritmo biológico. Nuestro objetivo es establecer las posibles influencias de los ritmos biológicos en el comportamiento farmacocinético del fenobarbital en perros. Utilizamos 6 perros, adultos, mestizos, hembras, en anestro y en correcto estado sanitario. Fueron tratados con Fenobarbital sódico FADA (5%) a dosis de 5 mg/Kg vía endovenosa lenta. El régimen de luz fue natural propio de los meses abril y mayo, en Córdoba. Tres animales fueron tratados a las 11:30 horas y los otros tres a las 00:00hr invirtiéndolos al cavo de cuatro semanas. La sangre se extrajo a tiempo prefijado durante diez días y fue cuantificada con el método de inmunoensayo de fluorescencia polarizada. El análisis farmacocinético se realizó con el programa de ajuste farmacocinético lineal (PKSOLUTION) y el análisis estadístico mediante un test t-student. Existieron diferencias significativas en el aclaramiento (p=0,0244). A futuro sería necesario incrementar el “n” y disminuir el intervalo entre administraciones (cada 6 hr.), para definir más precisamente la curva de variación cronobiológica.
Palabras Claves: Cronofarmacología, Fenobarbital sódico.

El fenobarbital sódico es un barbitúrico de acción larga utilizado, fundamentalmente, como agente anticonvulsivante. Entre sus contraindicaciones se encuentran enfermedad hepática grave, nefritis o depresión respiratoria grave (Plumb, 2006). A su vez, se pueden nombrar ciertos efectos colaterales, al inicio del tratamiento, entre los que destacan sedación, ataxia, polidipsia, poliuria, polifagia; signos clínicos  que tienden a desaparecer a medida que la fármaco alcanza el estado estacionario (7 a 10 días de tratamiento). Tras la estabilización de los niveles plasmáticos comienzan a desaparecer la ataxia y sedación, pudiendo persistir los demás signos clínicos, principalmente la polifagia. Su uso sistemático produce inducción enzimática hepática, con autoinducción, por lo que sus niveles séricos deben ser controlados periódicamente (Pellegrino, F.C. 2003).

La homeostasis fue definida por Claude Bernard en 1878 (del griego homeo que significa «similar», y estasis, «estabilidad»), como la capacidad que tienen los organismos vivos de adaptarse a las características variables del medio ambiente, manteniendo prácticamente inalteradas, sus constantes biológicas (temperatura corporal, niveles hormonales, frecuencia cardíaca, etc.) (Díaz, 2001). Esto supone la aparición de mecanismos endógenos capaces modificar el llamado “medio interno”, con la finalidad de adaptarse constantemente a las variaciones ambientales (Betes de Toro, 1994).

El avance en las técnicas analíticas, ha demostrado que las constantes biológicas manifiestan fluctuaciones, que se ajustan a una periodicidad cíclica. Estos ciclos se repiten a intervalos prácticamente regulares dando origen a un ritmo biológico, que atendiendo al intervalo de tiempo se pueden manifestar cada pocas horas generando los ciclos ultradianios, cada 24 h dando lugar a los ritmos circadianos, cada semana, mes o estación del año siendo estos los ritmos infradianos. También existen ritmos plurianuales, en relación con el movimiento cíclico del cosmos (Betes de Toro, 1994). Desde un punto de vista clínico el más importante  es el ritmo circadiano, regulado por las horas de luz-oscuridad, o mejor dicho, por el ciclo vigilia-sueño. Entendemos como cronofarmacología la ciencia que estudia los conceptos o la influencia de los ritmos biológicos y los relaciona con los conocimientos propios de la farmacología. Son ramas de la cronofarmacología la cronocinética o cronofarmacocinética, que estudia las variaciones farmacocinéticas de los fármacos a lo largo de un ritmo biológico, la cronestesia, que estudia las variaciones cronobiológicas de los receptores o lugares de acción de los fármacos en función del momento del ritmo biológico y la cronérgia encargada de estudiar el efecto propio del fármaco producto de la interacción entre la cronocinética y la cronestésia (Betes de Toro, 1994).

Basado, entre otros aspectos, en que el fenobarbital presenta una unión a proteínas plasmáticas, principalmente a la albúmina, del 45% (Boothe, 2001), que existen variaciones circadianas en las concentraciones séricas  de albúmina en perro (Widenhorn, 2007) o que, según Díaz,  et al (2001) y Boggio,. et al , (2001a), en seres humanos y ratas el nivel de proteínas plasmáticas decrece durante el periodo de descanso (nocturno), modificando la biodisponibilidad del fármaco, podemos plantear como hipótesis la posible variación cronofarmacocinética del fenobarbital sódico en caninos. Otro indicio que reafirma la necesidad de elaborar esta hipótesis se basa en que existen variaciones circadianas en los parámetros farmacocinéticos tras la administración oral de hexobarbital en esta especie (Widenhom, et al 2002).

Establecer las posibles influencias de los ritmos biológicos en la caracterización del comportamiento farmacocinético del fenobarbital en perros sanos.

- Sentar las bases para posteriores estudios cronofarmacocinéticos del fenobarbital en animales en distintos estados fisiológicos y bajo distintas situaciones ambientales.
- Valorar la posible utilización de los resultados obtenidos, para establecer regímenes terapéuticos en perros que presenten distintos síndromes epilépticos, optimizando su uso y disminuyendo la aparición de reacciones adversas.

Animales: Se utilizaron 6 perros mestizos hembras, pertenecientes a los caniles de la Universidad Católica de Córdoba. Su edad osciló entre los 3 y 4 años de edad y con un peso de entre 14 y 19 Kg .Se aseguró el correcto estado sanitario de los animales estudiados corroborando la ausencia de signos clínicos de enfermedad infecciosa o parasitaria y realizando chequeos clínicos y análisis bioquímicos (hemograma completo, perfil renal de urea y creatinina, perfil hepático con GOT, GPT, FA, albúmina y bilirrubina (BD, BI, BT). Dicho control general se realizó 7 días antes de iniciar la experiencia. Los animales fueron alimentados con pienso comercial administrado, dos veces al día  (125 - 175 g) y agua ad libitum. El régimen de luz fue el natural y se correspondía con la distribución luz-oscuridad propia de los meses abril y mayo, en Córdoba. Para dicho trabajo se cumplió con todas las normas establecidas por el centro de Bioética de la Universidad Católica de Córdoba.

Fenobarbital sódico inyectable FADA (5%). La dosis seleccionada fue de 5 mg/Kg por vía IV lenta.

Se utilizó un diseño cruzado en el que los animales fueron enumerados y divididos aleatoriamente en dos grupos de 3 animales cada uno (A y B), a los cuales, previo ayuno de 12 h, se les administro el fenobarbital a la dosis elegida en la vena yugular derecha,  en horas contrapuestas: 11:30 h para el grupo A y 00:00 h para el grupo  B. Tras un periodo de descanso de 4 semanas se invirtieron los grupos designándole al grupo B el horario diurno (12:00 h) y al grupo  A el horario nocturno (00:00 h).

Se extrajeron con jeringas desechables 5 ml de sangre de las venas cefálicas antebraquiales y como última alternativa, de la vena yugular opuesta a la de la administración. Los tiempos de extracción post-administración fueron: 0; 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 8; 12; 24; 36; 48; 72; 96; 120; 168 y 240 horas. Inmediatamente después de la extracción, la sangre se traspasó a tubos de ensayo rotulados, se dejó coagular y luego se separó el suero mediante centrifugación. Dicho proceso fue realizado a 3500 rpm durante 10 min. Las muestras se dividieron en dos alícuotas en tubos eppendorf. Una de ellas se congeló a -20ºC y la otra se mantuvo en refrigeración hasta su envío al laboratorio de análisis, manteniendo en todo momento la cadena de frío.

Previamente a comenzar la segunda etapa del estudio, se realizó una nueva toma de muestra, para comprobar el nivel cero de fenobarbital en sangre de cada animal. Durante este periodo, por razones de bienestar animal, se tuvo que apartar un animal, lo que obligó a realizar el análisis estadístico con cinco animales (n=5) en vez de seis (n=6) como se había planteado inicialmente.

Para la cuantificación del fármaco en sangre, se utilizó inmunoensayo de fluorescencia polarizada (FPIA) utilizando reactivos y autoanalizador TDx de la firma Abbott. Las muestras se procesaron por triplicado informándose el promedio de las tres lecturas. Los resultados fueron corroborados por cromatografía líquida de alta resolución con detección ultravioleta (HPLC-UV) (datos no publicados).

Los valores de las concentraciones plasmáticas obtenidos de cada animal se ajustaron a un modelo no compartimental mediante el programa de ajuste farmacocinético lineal (PKSOLUTION).

Las medias aritméticas de los valores de los parámetros farmacocinéticos principales, para cada grupo, se compararon mediante métodos paramétricos con un test t-student, con la ayuda del programa informático Infostat® (Balzarini, et al., 2004).

Los parámetros farmacocinéticos obtenidos y la representación gráfica de las concentraciones plasmáticas frente al tiempo, mañana vs noche, quedan reflejados en la  en la tabla 1 y gráfico 1, respectivamente.

Para este trabajo se utilizó la vía de administración endovenosa, a tiempos que resultaron adecuados al fin previsto (Pedersoli, et al., 1987), con el objeto de analizar el comportamiento del fármaco sin las posibles interferencias que pudieran surgir tras su administración por otras vías, como consecuencia de los fenómenos de absorción, especialmente por la interacción del fármaco con la dieta. De esta manera, se podrían atribuir las posibles modificaciones en su comportamiento al factor “hora de administración” junto con las variaciones inter e intra individuales. Por esa razón se utilizó un diseño cruzado, de forma que se redujeran al máximo esos factores. De otro modo hubiera sido necesario un número más elevado de animales, que permitieran contrarrestar los efectos de variabilidad de otras vías de administración o un diseño en paralelo, efecto arrastre, etc. No obstante y a tenor de la variabilidad expresada en las desviaciones estándar (tabla 1) justificaría la realización de nuevas experiencias con “n” mayores. El “n” estimado para variables cuantitativas es de once (n=11), para lo cual se calculó el “n” de cada parámetro farmacocinético y en cada horario (mañana y noche), luego se calculo el promedio entre los valores diurnos y nocturno y se expreso en la tabla nº 1, como “n” promedio.

Se puede observar que sólo existen diferencias significativas en el aclaramiento (Cl) (p=0,0244), no observándose en el resto de los parámetros farmacocinéticas, pudiéndose atribuir este hecho al bajo tamaño muestral (n=5), como acabamos de comentar, si bien éste es un estudio preliminar.

El volumen de distribución (Vd), a pesar de no mostrar diferencias significativas entre los grupos de mañana y noche, como consecuencia de la DS del grupo de mañana, se vio, levemente, aumentado tras la administración matinal. Los dos factores que podrían influir serían la unión a proteínas y el pH. La unión a proteínas plasmáticas es mayor por la mañana  (Diaz, et al 2001), pero al ser relativamente baja su capacidad de unión (45%), la influencia no debería ser muy grande; por otro lado el pH sanguíneo en perros es menor en las horas nocturnas, y como el  fenobarbital es un base débil (pka=7,3) cuyo grado de ionización se modifica por el pH del medio en el que se encuentre, los valores mayores de pH en las horas matutinas permitirían que un porcentaje más alto del fármaco se encuentre en forma no ionizada, facilitando una mayor distribución hacia los tejidos en ese horario, y consecuentemente habría una menor concentración plasmática, que redundaría en un mayor Vd.

Los fármaco con un aclaramiento más intenso presentan un ABC menor (Boggio, et al 2001b; Adams R. 2008), como consecuencia del mayor grado de eliminación. La diferencia en el aclaramiento (Cl) coincide con los resultados publicados (Betes de Toro et al 1994), en el que el Cl es más intenso por la mañana, generando así un descenso diurno más pronunciado de los niveles plasmáticos del fármaco. Por vía renal se elimina hasta un 25% del fenobarbital, siendo este valor variable en función del pH urinario. Valores mayores de pH sanguíneo matinal (Widenhom et al. 2002) inducirían una alcalinización de la orina lo que llevaría a un mayor aclaramiento renal (Cl) del fármaco. Otro de los factores que afectan el aclaramiento renal, es el flujo sanguíneo renal y hepático, que al encontrarse disminuidos en la horas de descanso (noche), podría explicar por qué este parámetro es menor por la noche (Widenhorn, et al 2002), además de una actividad mas reducida de la capacidad metabólica del citocromo P-450.

Por otro lado es conocida la capacidad de inducción enzimática del fenobarbital sobre las isoformas que lo metabolizan (CYP2C9 y CYP 2C19), pudiendo aumentar la velocidad de aclaramiento, así como acelerar su propia tasa metabólica, pero este proceso no puede ser considerado en este trabajo ya que se realizó el estudio en dosis única, no pudiendo generar esa inducción. Para profundizar en el comportamiento cronofarmacocinético del fenobarbital sería necesaria la realización de estudios con una posología de dosis múltiples y a más largo plazo, teniendo en cuenta que con este tipo de intervención farmacológica nos acercaríamos a la concentración plasmática terapéutica, en el estado estacionario, deseada para la terapéutica anticonvulsivante (Pedersoli et al, 1987) (Plumb, 2006). También y con objeto de aproximarse más a la realidad clínica se usaría la vía oral, cuyos procesos de absorción se pueden ver más influenciados por las variaciones circadianas.

Existen diferencias en el aclaramiento (p=0,0244) en caninos sanos, tras la aplicación de fenobarbital sódico por vía IV, que justificarían la modificación posológica.

Debido a la gran variabilidad encontrada en los datos, es necesario incrementar el tamaño muestral.

De cara a futuros estudios, sería interesante conocer de forma mas precisa la curva de variación cronobiológica; el MESOR (Midline Estimating Statistic Of Rhythm), la amplitud y sobre todo la acrofase (momento de máximo valor del ritmo). Esto se logra disminuyendo el intervalo entre administraciones (por ejemplo: 6 horas), y estableciendo así el momento de máxima y mínima concentración en el organismo, pudiendo diseñar un régimen terapéutico más eficaz minimizando los efectos secundarios.

 

A la Universidad Católica de Córdoba, a la Universidad Complutense de Madrid, a los  Drs. Cristian Hansen y Andrés Suárez del Laboratorio de Toxicología LACE - Centro de Tomografía Computada Oulton, Córdoba-Argentina y a Royal Canin Argentina

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