Diagnóstico de pérdida embrionaria y detección muy temprana de vacas no gestantes mediante ecografía Doppler

Introducción

Actualmente el foco de muchas investigaciones en el campo de la reproducción bovina busca diagnosticar preñeces de la manera más precoz posible debido a la necesidad de aumentar la presión de servicio, mejorar las tasas de preñez y acortar el intervalo parto-concepción. Los métodos de diagnóstico se focalizan en encontrar a la vaca vacía (que falla en la concepción) prontamente para poder re-inseminarla y que su intervalo entre partos sea lo más corto posible [1-3] .

La incorporación de nuevas tecnologías al uso cotidiano en tambos, como la USG Doppler, permite una visión más detallada del útero, de los folículos ováricos y del CL permitiendo mejorar sustancialmente la detección temprana de las vacas vacías próximas al estro natural alrededor del día 21 post servicio [3, 4] . La mayor practicidad y velocidad diagnóstica de esta técnica a diferencia de otros métodos más complejos, concede la posibilidad de utilizarla de manera rutinaria en los tambos y mejorar sustancialmente la detección de las vacas a inseminar. Por otro lado, no todas las vacas que logran concebir llegan a parir, es por eso, que las pérdidas de gestación en rodeos lecheros se han vuelto un campo de investigación muy extenso en la actualidad. La detección de muertes embrionarias en el ganado puede evaluarse utilizando diferentes herramientas de diagnóstico. La más utilizada en la práctica veterinaria es la USG en modo B transrectal que permite detectar falta del latido cardíaco fetal, membranas desprendidas o estructuras flotantes, incluyendo remanentes embrionarios y reducciones de tamaño fetal a partir de los 28 d post-IA [5, 6] . Otras herramientas de diagnóstico que se pueden utilizar son la medición de la concentración de P4 en la leche o en suero 20-24 días después de la IA y la evaluación de la perfusión sanguínea del CL (CL-FS) mediante ecografía Doppler [7] . Existe una correlación positiva entre la CL-FS y las concentraciones circulantes de P4 en vacas cíclicas y gestantes [8] . Finalmente, la expresión de genes estimulados por el interferón tau (ISG) ha sido también postulada como una técnica válida para detectar vacas gestantes a partir del día 18 post-IA [9] así como también para detectar vacas que padecen muerte embrionaria (ME) [10] . Finalmente, y teniendo en cuenta que todas estas técnicas mencionadas podrían generar beneficios económicos y facilitar prácticas de manejo, sería importante realizar nuevos estudios que determinen la precisión de las mismas para diagnosticar gestación muy temprana (d19-20) o incluso, muerte embrionaria.

Los objetivos de este estudio fueron validar el uso de la USG Doppler para la detección de vacas no gestantes a los 19-20 días post-IA y para la detección de muertes embrionarias 19-34 días post-IA en vacas de tambo bajo condiciones pastoriles de producción. Además, evaluamos si la ecotextura uterina mediante la evaluación de USG en modo B podría agregar información valiosa para mejorar la detección de vacas no preñadas a los 19-20 días post-A.

Materiales y métodos

Manejo reproductivo del rodeo

Este estudio se realizó en un tambo comercial con 400 vacas en ordeñe y con un rango de producción de leche de entre 6.000 y 12.000 kg en 305 días en lactancia, ubicado en la localidad de Brandsen, provincia de Buenos Aires (35° ”24’ S, 58° ”06’ O). El sistema de producción era de base pastoril con suplementación con silo de maíz y concentrado. Los partos ocurrían a lo largo de todo el año y el período de espera voluntaria (PEV) fue fijado en 45 días. Luego de transcurrido el PEV, se seleccionaron vacas cíclicas con flujo vaginal normal (sin pus) y se realizó un protocolo de IATF. Para esto, todas las vacas incluidas recibieron un dispositivo intravaginal que contenía 1,2 g de P4 (Diprogest 1200, Zoovet, Argentina) y 2,0 mg de benzoato de estradiol (Zoovet, Argentina) al inicio del protocolo. Al séptimo día del protocolo, se retiró el dispositivo de P4 y las vacas recibieron 0,150 mg de PGF2α (DCloprostenol, Ciclar Zoovet, Argentina), 2 mg de cipionato de estradiol (Zoovet, Argentina) y 450 UI de eCG (Novormon 5000, Syntex, Argentina). La IA se realizó 55-60 h después de retirar el dispositivo de P4.

Evaluaciones ecográficas

Un total de 131 vacas sanas y con presencia de cuerpo lúteo (CL) que se encontraban entre 19-20 días post-IA fueron incluidas en este estudio. Todos los CL fueron examinados por el modo de Power y por el modo Color de USG Doppler. Se utilizó un equipo ESAOTE MyLab OneVET (Génova, Italia) equipado con un transductor transrectal lineal de 2,2 a 12 MHz. Las configuraciones de los Modos de USG Doppler utilizadas fueron fijadas y no modificadas a lo largo de los exámenes para minimizar las variaciones entre las vacas. El mismo investigador realizó todas las evaluaciones de ultrasonido. En la evaluación se consideró la cantidad de área coloreada dentro del tejido lúteo como un indicador de la funcionalidad de CL [11, 12] . Se seleccionó la vista más coloreada para el mayor diámetro de cada CL. Al momento de la evaluación, en el tambo, cada cuadrante se clasificó de acuerdo al grado aparente de perfusión sanguínea del CL (escala 0-4; 0: área con 0% de vascularización, 1: 1-25 %, 2: 26-50%, 3: 51-75% y 4: 76-100%). Se almacenaron dos videoclips por vaca que contenían la sección transversal completa del CL en los modos Power y Doppler color para su posterior análisis. Los clips fueron analizados a ciegas por un segundo evaluador de forma independiente. Al igual que en la evaluación visual de CL-FS en el tambo, el CL se dividió en cuatro cuadrantes iguales. El porcentaje de áreas coloreadas en cada cuadrante se determinó mediante el software de procesamiento de imágenes ImageJ 1.42q (Instituto Nacional de Salud, Bethesda, MD, EE. UU. [13] . Se examinaron tres imágenes de cada CL para calcular el área coloreada. La imagen más vascularizada de las tres imágenes fue seleccionada y utilizada para el análisis estadístico final. La escala de clasificación fue la misma que se había utilizado en el tambo al momento de la evaluación ecográfica. El CL-FS se consideró negativo cuando los cuatro cuadrantes se calificaron como ≤1 (escala 0-4) o cuando la evaluación del software indicó < 25% de CL-FS [14] (Figura 1 y 2). Durante la misma visita, 19-20 días después de la IA, se realizó un examen adicional con USG en modo B (ESAOTE MyLab OneVET, Génova, Italia) para evaluar la ecotextura uterina. Se determinó la proporción de grosor entre el endometrio y el miometrio en la bifurcación de los cuernos uterinos (EN: MI) y se clasificó como 1:1, 2:1 y 3:1. También se evaluó la presencia (SI/NO) de la luz uterina y del estrato vascular.

El diagnóstico de preñez mediante identificación visual de la vesícula embrionaria y el latido del corazón se realizó a los 33-34 días después de la IA mediante USG en modo B (Mindray DP 30 Vet). Las vacas diagnosticadas por USG Doppler con un CL-FS positivo a los 19-20 d que no estaban preñadas a los 33-34 d por el USG en modo B se denominaron POS-VACIA. Las vacas diagnosticadas por USG Doppler con un CL-FS negativo a los 19- 20 d y diagnosticadas como preñadas a los 33-34 d se denominaron NEG-PREÑADA. Las vacas que fueron diagnosticadas positivas en ambos exámenes estadounidenses se denominaron POSPREÑADA. Finalmente, las vacas diagnosticadas con un CL negativo a los 19-20 d y no preñadas a los 33-34 d se denominaron NEG-VACIA.

Figura 1. Línea de tiempo del diseño del estudio y las técnicas de diagnóstico utilizadas.

Figura 2. Cuerpo lúteo dividido en cuadrantes para la evaluación de la perfusión sanguínea.

Obtención y procesamiento de muestras sanguíneas

A todas las vacas, al momento de la realización de la USG Doppler (19-20 d post IA), se les tomó una muestra de sangre (9 ml) en tubos conteniendo EDTA. Las muestras fueron procesadas para la obtención de plasma y de la fracción leucocitaria. El plasma fue utilizado para la medición de las concentraciones de progesterona sérica mediante quimioluminiscencia (Immunoanalyzer Elecsys and Cobas e, Roche®, Mannheim, Alemania) utilizando como controles internos, muestras conocidas con concentraciones altas (7 ng/ml) y bajas (1 ng/ml) de progesterona al comienzo y al final de las determinaciones. Las vacas que tenían una concentración plasmática de P4 ≥1,0 ng/mL se clasificaron como con CL funcional, y aquellas con concentraciones de P4 < 1,0 ng/mL se clasificaron como con CL no funcional. Se consideró CL activo cuando CL-FS se clasificó como positivo a USG Doppler y funcional a la medición de P4.

Figura 3. Evaluación de la perfusión sanguínea del cuerpo lúteo por ultrasonografía Doppler en modo Color. Cuerpo lúteo de una vaca vacía clasificado como negativo (izquierda). Cuerpo lúteo clasificado con perfusión positiva en una vaca preñada (derecha).

Por otro lado, para la obtención de la fracción leucocitaria, se siguieron los pasos de la técnica descripta por Gifford y col. [9] y se almacenaron a −80 °C. Posteriormente se realizó la extracción de ARN, cuantificación, validación de la calidad del ARN, retrotranscripción y PCR en tiempo real [15] . Se procesaron un total de 59 muestras para la determinación de la expresión de los genes estimulados por el interferón tau. Los cebadores utilizados para este fin fueron específicamente diseñados utilizando el software Primer 3 [16] . La expresión de los genes de interés fue normalizada usando como referencia 3 genes específicos y el software geNorm [17] .

Análisis estadístico

El grado de acuerdo entre la perfusión del CL diagnosticado por USG Doppler a campo y el diagnóstico posterior de las imágenes por el software (ImageJ 1.42q) se evaluó mediante la estimación del coeficiente kappa. La capacidad predictiva del diagnóstico de no-preñez a los 19-20 días post-IA del USG Doppler color modo se evaluó estimando la sensibilidad (SE), especificidad (SP), Valor Predictivo Positivo (VPP) y valor predictivo negativo (VPN) utilizando Proc FREQ (SAS 9.4).

La concordancia entre el diagnóstico CL-FS Doppler a los 19-20 días, el diagnóstico de preñez por USG en modo B a los 33-34 días y la ecoestructura uterina a los 19-20 días (luz uterina, estrato vascular y espesor relativo EN: MI) se evaluaron ajustando modelos de regresión logística (Proc GLIMMIX, SAS 9.4) y SE, SP, PPV y NPV se estimaron mediante Proc FREQ (SAS 9.4).

Los ISG se utilizaron como método de referencia para la detección de preñez en vacas con un CL activo a los 19-20 días post-IA. Se utilizaron curvas ROC para determinar los valores de corte críticos para los genes de interés que proporcionaron evidencia de la presencia de un embrión a los 19-20 días posteriores a la IA (Proc LOGISTIC, SAS 9.4). Para mejorar la capacidad predictiva, los genes que se seleccionaron como biomarcadores de preñez (área bajo la curva > 80%) se utilizaron de varias formas combinadas (pruebas en paralelo y en serie) [18] para el diagnóstico de preñez (Proc FREQ, SAS 9.4). Una vez que se determinaron valores de corte de los ISG, todas las vacas POS-NONPREG fueron reclasificadas de acuerdo con sus valores de expresión de ARNm en vacas con muerte embrionaria (ME; vacas positivas a ISG y CL activo) o vacas con diagnóstico de Doppler-falso positivo (vacas negativas a ISG o sin Cl activo). La pérdida potencial de preñez se calculó como el número de vacas clasificadas como ME dividido por el número de vacas diagnosticadas preñadas a los 33-34 días mediante visualización de embriones más las vacas ME.

La concordancia entre el diagnóstico CL-FS por USG Doppler, el diagnóstico de preñez por USG en modo B, los valores de expresión de ARNm y la concentración de P4 se evaluó estimando los coeficientes kappa (Proc FREQ, SAS 9.4). La significación estadística se fijó en P < 0,05 y la tendencia de significación se fijó en P < 0,10.

Resultados

La tasa de no-preñez a los 19-20 días diagnosticada por USG Doppler fue del 38,9 % (51/131), mientras que el 62,6 % (82/131) fueron diagnosticadas como no gestantes a los 33-34 días por la ecografía en modo B basada en la falta de visualización del embrión.

Las mediciones del área CL-FS realizadas a los 19-20 días posteriores a la IA mediante el software de procesamiento de imágenes tuvieron una mayor concordancia con el modo Color que con el modo Power (Kappa = 0,70 vs. 0,42). La presencia de un CL-FS considerable se consideró un signo positivo de un CL activo, mientras que su ausencia o cantidades pequeñas (cuatro cuartas partes del CL puntuadas como ≤1, escala 0-4) denotaron una falta de actividad del CL y, por lo tanto, se consideró como un signo de no-preñez. El modo Color mostró alta precisión para detectar posible preñez al pie de la vaca por simple visualización (74,8%) al usar la categoría ≥2 en cualquier cuadrante. Asimismo, el USG Doppler, al igual que el diagnóstico ISG, mostró un alto SE y VPN cuando se comparaban con el diagnostico tradicional con la USG en modo B (método de oro) y una concordancia sustancial con P4 en plasma.

La presencia de una capa endometrial gruesa (ME:MI de 3:1) a los 19-20 días se correlacionó con el diagnóstico de no-preñez por Doppler y también por ecografía en modo B a los 33-34 días (p< 0,001). Además, la visualización del estrato vascular uterino a los 19-20 d (OR= 2.79 95% IC 1.31- 5.93 P< 0.01) también se correlacionó con vacas no gestantes en el diagnóstico modo B a los 33-34 d.

De todos los genes evaluados, ISG15, MX2 y OAS1 fueron seleccionados como posibles biomarcadores para detectar ME. Posteriormente se determinó que para detectar el 100% de vacas preñadas, se deberían utilizar como valores de corte los niveles de expresión de solo dos de los posibles biomarcadores (ISG15/MX2 en interpretación paralela). De esta manera, si la expresión de una vaca era mayor a uno u ambos de los valores de corte de estos genes, se la diagnosticaba como potencialmente preñada (100% SE y 70,5 % de SP). Como consecuencia, las vacas que habían sido clasificadas como POS-NONPREG se reclasificaron según su concentración de P4 y los valores de ISG (interpretación paralela de ISG15/MX2). Encontramos que el 47,4% (9/19) de las vacas POS-NONPREG tuvieron evidencia de presencia embrionaria (valor de expresión por encima del punto de corte para ISG15 o MX2) y presentaron concentración de P4 > 1,0 ng/mL (SE, 100%), por lo que fueron clasificadas como ME. El 5,2% (1/19) presentó P4 bajo y el 47,4% (9/19) presentó ISG15/MX2 bajo, por lo que fueron clasificados como Doppler falso positivo. Con base en las vacas clasificadas con ME (n=9) y aquellas diagnosticadas preñadas a los 33-34 d (n=23), estimamos que el 28.1% (9/23+9) de las vacas pudo haber presentado una potencial pérdida de preñez.

Todas las vacas que tenían un CL no funcional (P4 < 1.0 ng/mL) a los 19-20 días fueron diagnosticadas como no preñadas a los 33-34 días por USG en modo B (SE 100%, 13/13), mientras que la mitad de las vacas con concentración de P4 ≥1.0 ng/mL a los 19-20 tuvieron un embrión detectado a los 33-34 días por USG en modo B (SP 50%, 23/46).

Discusión

El USG Doppler color ha sido descripta como una herramienta valiosa para evaluar la perfusión sanguínea en el tracto reproductivo de grandes animales [14] . Además, el modo Color ha demostrado ser más eficaz que el modo Power para detectar el flujo sanguíneo en los vasos pequeños del centro del CL [19] . Por ello, y en concordancia con estudios previos, elegimos la evaluación USG Doppler color para este estudio [11, 20] . Sin embargo, es importante tener en cuenta que solo la evaluación visual al pie del animal puede considerarse apropiada en la práctica lechera ya que la evaluación de las imágenes por medio del software de procesamiento de imágenes requiere tiempo para su evaluación por lo que no permite tomar decisiones en el momento.

Nuestros resultados mostraron una alta concordancia con los informados por Siqueira y col. [4] en cruzas Holstein-Gir que encontraron alta SE y VPN (99% y 98.5%, respectivamente) para el diagnóstico por USG-Doppler Color a los 20 d usando como referencia el diagnóstico por USG en modo B a los 30 d. El alto VPN indica que la evaluación del CL-FS parece ser una herramienta de diagnóstico confiable para detectar vacas abiertas y reinseminarlas antes de lo que sería posible evaluando el retorno al estro [4] . Reducir el intervalo entre el parto y la concepción mediante un diagnóstico temprano y preciso de no-preñez puede tener una importancia económica significativa. Por otro lado, de acuerdo con estudios previos, encontramos que la evaluación CL-FS presentó resultados falsos positivos y una menor precisión como limitante [21, 22] . El diagnóstico incorrecto de preñez puede ocurrir en ciclos estrales con fases lúteas extendidas con un retraso en la regresión de CL y pérdidas embrionarias tempranas [23] .

Por otro lado, encontramos que un endometrio grueso (relación EN:MI de 3:1) y la visualización del estrato vascular a los 19-20 días se relacionaron con la no gestación. Esto está en concordancia con estudios previos que encontraron que el grosor de la pared uterina aumenta durante la regresión lútea con la disminución de P4 y el aumento de estradiol [24] . De manera similar, la visualización del estrato vascular se explica por el aumento en los diámetros de las arterias uterinas y el flujo sanguíneo como una influencia de las concentraciones crecientes de estradiol. Por lo tanto, incluir la evaluación del estrato vascular y el grosor del endometrio como una evaluación adicional puede mejorar el diagnóstico de las vacas no gestantes a los 19-20 días posteriores a la IA.

En este estudio, la estimación de la tasa de preñez en vacas lecheras lactantes en pastoreo a los 19-20 días post IA fue del 61,1 % utilizando solo USG Doppler, 62,7 % usando solo ISG y del 50,8 % si se combinaban las tres técnicas diagnósticas (P4 + USG Doppler + ISG). La pérdida de preñez aparente para el período de 19 a 34 días fue del 28,1 %. La ocurrencia de pérdidas de embriones que encontramos fue similar a otros estudios (25- 40,5%), utilizando también ISG como método de referencia para la detección temprana de preñez. Sin embargo, esos estudios presentaron diferencias metodológicas con nuestro estudio, tuvieron mayor número de resultados falsos negativos (FN) y se realizaron bajo un sistema confinado [25-27] . Además, es importante notar que en nuestro estudio, todas las vacas consideradas como candidatas para la pérdida de embriones tenían un CL activo en el día 19-20. Seleccionamos como estándar de oro para el diagnóstico de preñez a los 19-20 d para este estudio, la interpretación conjunta (en serie) de las tres técnicas diagnósticas (P4 + USG Doppler + ISG). Entendemos que esta es la mejor estimación que se puede obtener de las técnicas diagnósticas disponibles. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que informa la estimación de pérdidas de preñez en ganado lechero diagnosticado por ISG en condiciones de pastoreo; sin embargo, somos conscientes de que este estudio representa solo un tambo. Nuevos estudios que incluyan mayor número de establecimientos y animales podrían contribuir a comprender la mortalidad embrionaria en vacas lecheras en pastoreo.

Conclusión

Se demostró que USG Doppler es una buena opción para detectar rápidamente vacas no preñadas para que puedan volver a inseminarse antes, minimizando los días abiertos. Sin embargo, sugerimos evaluar el grosor del estrato vascular y del endometrio como una evaluación adicional para mejorar la detección de vacas no preñadas a los 19-20 días post-IA. En combinación con el diagnóstico de preñez mediante USG en modo B a los 33-34 días, podría ser una aplicación práctica y útil para los protocolos de resincronización en la práctica lechera veterinaria. Por último, evaluando en conjunto la detección de ISG, USG Doppler y P4, estimamos una pérdida potencial de embriones del 28,1 % entre los 19 y los 34 días posteriores a la IA.

Este artículo fue publicado originalmente en la Revista Taurus Año 24; N° 95: 18-25. Se reproduce con permiso del autor.