Efecto del uso de etilenglicol y plasma seminal ovino en base tris-fructosa-yema de huevo, en dos diluyentes de conservación de esperma recuperado en epididimos de toros posmortem, sobre los parámetros espermáticos

INTRODUCCIÓN

En general se considera que las células espermáticas maduran a su paso por el epidídimo, como se indica por el paso de la gota citoplasmática de la región del cuello, por debajo de la pieza intermedia y cola de la que se pierde antes de la eyaculación. Spz eliminados de la cola del epidídimo fueron de 2 a 10 veces más fértiles que los espermatozoides de la cápita al parecer debido a anomalías en la locomoción de los espermatozoides de la cabeza del epidídimo (Cole y Cupps, 1977), citados por (Saavedra, y otros, 2012).

El sitio principal de almacenamiento de esperma en el tracto reproductivo del macho es la porción caudal de cola del epidídimo. Esta parte de la zona tiene una luz relativamente amplia en la que las altas concentraciones de espermatozoides se almacenan (Amann & Graham, Spermatozoal function, 1993). Un trastorno funcional del epidídimo puede resultar en la composición anormal del plasma del epidídimo, disminución de motilidad de los espermatozoides anormales y cuadros clínicos de los espermatozoides (Oyeyemi Ubiogoro, 2005).

Este trabajo de investigación se basó en la obtención de esperma de los epidídimos de toros posmortem, separados por grupos raciales (taurinas, índicas, criollas y mestizas); se hicieron alícuotas heterospérmicas por razas, resuspendidas en plasma seminal ovino (PSO), conservadas en tres tratamientos (diluyente comercial, ETG 3 y 6% en base Tris-Fructosa-Yema de huevo (TFYh) con tres repeticiones y congeladas en pajillas de 0,25 ml con una concentración de 25 x 106 Spz, con el fin de evaluar sus parámetros espermáticos poscongelación.

MATERIAL Y MÉTODOS

El trabajo de investigación se realizó con la colaboración de tres frigoríficos (Armenia, Pereira y Manizales) que proporcionaron los testículos de los toros después del sacrificio, los cuales fueron procesados en los laboratorios de UNISARC.

Los tres frigoríficos permitieron clasificar los testículos provenientes de toros de razas taurinas (Holstein y Normando), índicas (cebú), criollas (BON) y mestizas (diversos cruces).

Una vez seleccionados los testículos por razas, se procedió a separar los epidídimos debidamente marcados, para luego empezar con la disección en la porción de la cola; una vez descubierto el septum epididimario se canalizó el conducto deferente mediante un advocath número 18, seguidamente se aplicó presión de aire con una jeringa desechable de 50 ml, para recoger el esperma en un tubo eppendorf de 1,8 ml; se colectaron en un mismo tubo el esperma epididimario de tres toros por raza, resuspendidos en 2,0 ml de PSO.

Tratamientos

T0 Esperma + PSO + Diluyente comercial (Steridyl®)

T1 Esperma + PSO + D1 (Etilenglicol 3% + TFYh)

T2 Esperma + PSO + D2 (Etilenglicol 6% + TFYh)

Duración

Las colectas, centrifugación y congelación de plasma seminal de los ovinos se hicieron un mes antes, con el fin de tener suficiente cantidad para proceder con los protocolos de conservación del esperma epididimario.

Las colectas epididimarias y evaluación del esperma se realizaron durante tres semanas consecutivas, una vez por semana por cada raza. La investigación tuvo entonces una duración considerada como trabajo de campo de dieciséis semanas.

La evaluación de los parámetros espermáticos poscongelación, se hicieron para cada repetición una semana después de la congelación de cada una de ellas.

Unidades experimentales y colectas

Esta investigación se realizó con 4 grupos raciales (Taurinos, Índicus, Criollos y Mestizos); por cada grupo racial se hicieron alícuotas heterospérmicas, por medio de vaciado de epidídimos mediante presión de aire y restitución en PSO en iguales condiciones de temperatura.

Evaluación del semen fresco

Después de la obtención heterospérmica se procedió a la evaluación en el laboratorio de los parámetros tanto macroscópicos como microscópicos; se tenía preparado el baño termostático atemperado a 37ºC con tubos de citrato de Na, la tinción de eosina-Nigrosina, glutaraldehído al 2%, PBS, solución hipoosmótica a 100 mOsm/l, solución salina formolada al 0,3%, platina térmica del microscopio conectada y portaobjetos atemperados.

Preparación de los medios dilución

Para cada tratamiento se utilizaron los diluyentes divididos en tres fracciones, la solución base (pH 6,65 y osmolaridad 288 mOsm); la fracción I, un medio de enfriamiento para el descenso dela temperatura de 37 a 5ºC (pH 6,80 con osmolaridad 348 mOsm), y la fracción II un medio de equilibrado a 5ºC (pH 6,80 con osmolaridad 1360 y 2800 mOsm) durante 1,5 horas antes de la congelación.

Se prepararon dos diluyentes utilizando el etilenglicol a dos concentraciones (3 y 6% v:v para el diluyente 1 D1 y 2 D2 respectivamente (fracción II).

Restitución del PSO

Al paquete espermático de los epidídimos se les resuspendió en PSO debidamente atemperados, y luego se les adicionó la solución base y la fracción I del diluyente para empezar a bajar la temperatura de 37 a 5ºC (temperatura crítica), a razón de 0,5ºC por cada minuto.

Dilución y congelación

Al final del periodo de temperatura crítica, el semen fue diluido nuevamente con la fracción II (diluyente preparado para cada tratamiento con etilenglicol al 3 y al 6%) y se procedió al equilibrado de la solución durante 1,5 horas tiempo en el cual el crioprotector entra en la célula para proceder con el proceso de llenado de pajillas.

Una vez llenado todas las pajillas por tratamiento, se distribuyeron en las rampas de congelación para ser llevadas a vapores de nitrógeno líquido (-80ºC) durante 10 minutos, ya congeladas se procedió a ser almacenadas en el propio nitrógeno líquido a -196ºC.

Evaluación de pajillas poscongelación

Una semana después de la congelación de las muestras por cada tratamiento, se escogieron varias pajillas al azar por cada uno, se les aplicó el mismo protocolo de evaluación que en fresco para así determinar el efecto de los niveles de etilenglicol v:v después de congelado.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La comparación de los tres tratamientos (esperma resuspendido con PSO en diluyente comercial T0 DC, esperma resuspendido + PSO con 3% de ETG T1 D1 y esperma resuspendido + PSO con 6% de ETG T2 D2); muestran los mejores resultados cuando se conservan con un crioprotector; todos los valores del esperma congelado descongelado de las variables están por encima del 50%, por tanto se puede afirmar que el ETG fue una buena alternativa como diluyente de congelación, comparado con el esperma fresco, (Figura 1).

Para la mayoría de las variables evaluadas, se puede observar que presentó mejores valores de integridad celular, el semen que fue congelado con el D2 correspondiente al T2, la integridad de la membrana juega un papel muy importante en los procesos de fecundación como lo han demostrado los estudios hechos por (Januskauskas & Rodríguez, 2003).

Figura 1 Valor medio para las variables dependientes por tratamiento

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Descripción de las variables

En la tabla 1 se pueden observar las medias y el error estándar (EE) de las variables motilidad individual progresiva MIP, vitalidad VyM, acrosomas normales An y Endosmosis End presentaron diferencias altamente significativas (p< 0,0001 con valores de F= 100,53; 74,71; 65,76 y 70,54) respectivamente por el efecto tratamiento a favor del D2 con ETG al 6%; en primera medida estos resultados pueden deberse a la eficacia del ETG por el efecto osmótico marcado, pero transitorio, que produce rápidos cambios en el volumen celular, lo cual no parece perjudicar la función del espermatozoide. Estos datos están acordes con los estudios realizados por (Leboeuf, 2000), con resultados óptimos para la congelación de esperma cuando se utiliza el ETG en una concentración entre un 4 y un 7%.

Igualmente, sobre el uso de crioprotectores permeables con buenos resultados se aprecian en las publicaciones realizadas por (Aisen, Álvarez, Venturino, & Garde, 2000), en la que recomiendan un nivel máximo de 16% de yema de huevo y 6% de ETG, respectivamente, y el uso concomitante en un diluyente en base Tris.

Los parámetros espermáticos de los eyaculados muestran valores por encima del 50%; sin embargo, el error estándar muestra que el macho A con el tratamiento 4 T4 (6% de ETG CT), presenta diferencias significativas altamente (p< 0,0001) para la motilidad individual progresiva MIP; para la endosmosis End, el macho B con el T4 (6% de ETG CT), presentó diferencias significativas (p< 0,05).

El nivel de ETG con los mejores resultados para el estudio realizado puede se acerca a las publicaciones realizadas por (Aisen, Álvarez, Venturino, & Garde, 2000), en la que recomiendan un nivel máximo de 16% de yema de huevo y 6% de etilenglicol con los mejores resultados, respectivamente, y el uso concomitante en un diluyente en base Tris.

Prueba del rango múltiple de Duncan

En el procedimiento GLM, la prueba del rango múltiple de Duncan, muestran los resultados de las variables analizadas para el efecto raza, y tratamiento.

Para el efecto raza, al análisis de las variables VyM, y An con esperma fresco y para las Cn con esperma descongelado, presentaron diferencias altamente significativas (p< 0,0001) a favor la raza taurina, estando intermedias las criollas y mestizas, y en menos favorecidas las índicas, (tablas 2, 3 y 4).

El efecto tratamiento (diluyente comercial, ETG 3 y 6%) para las variables MIP, VyM, An y End, presentaron diferencias altamente significativas (p< 0,0001 con valores de F= 250,95; 182,98; 161,20 y 175,29) a favor del tratamiento T2 D2 con 6% de ETG; siendo el tratamiento T1 ligeramente superior al tratamiento T0 de esperma fresco con diluyente comercial, (tablas 5; 6; 7 y 8).

La variable Cn, presentó diferencias significativas (p< 0,05 con valor de F= 3,69) a favor del tratamiento T2 D2 con 6% de ETG; siendo el tratamiento T1 casi igual al tratamiento T0 de esperma fresco con diluyente comercial, (tabla 9).

Todos los resultados a favor del T2 se pueden explicar por los estudios realizados demuestran un mejor efecto protector del ETG en comparación con el glicerol (GL), en otras especies como humanos (Deppe y col., 2003), equinos (Ball y Vo, 2001), bovinos (Guthrie y col., 2002) y chinchillas (Carrascosa y col., 2001); además del uso concomitante en el diluyente con base Tris, que se refleja en una mejor motilidad poscongelación (Saavedra, 2018)

Coeficientes de correlación Pearson

Finalmente, en el análisis del coeficiente de correlación de Pearson (tabla 10) se encontró correlación altamente significativa (p< 0,0001) de la variable MIP con VyM, An y End con valores de (r= 0,93359; 0,93235; y 0,94926) respectivamente.

La vitalidad presentó correlación altamente positiva con An y End (p< 0,0001 con valores de r= 0,92042 y 0,92185 en su orden respectivo).

La variable células normales Cn correlacionó positivamente diferencias significativas, con con las variables MIP, An y End (p< 0,05 con valores de r= 0,38974; 0,43654 y 0,371579) respectivamente.

Los An tuvieron correlaciones positivas de alta significancia (p< 0,0001 con la End r= 0,89729).

Las correlaciones positivas indican que las variables son aditivas, por tanto, el efecto de los tratamientos, conservación y macho cabrío, no se afectan por tanto si una de ellas tiene valores altos, las demás también tienen unos valores significativos.

CONCLUSIONES

El esperma epididimario obtenido de testículos de toros posmortem, es una forma de obtener germoplasma de animales de alto valor genético debido a que es posible conservar su viabilidad poscongelación.

Las alícuotas heterospérmicas restituidas en PSO de las razas taurinas presentaron los mejores parámetros espermáticos poscongelación en un diluyente con ETG al 6% en base TFYh.

El esperma epididimario adicionado con PSO y congelado con un diluyente cuyo crioprotector permeable fue el ETG, presentó variables espermáticas con valores superiores al 50%, por tanto, son ideales para la inseminación artificial IA.

La concentración ideal de ETG en el diluyente de congelación para esta investigación fue correspondiente (T2D2).

Es posible que independiente del crioprotector, el efecto del PSO, tienen la capacidad de retener las proteínas BSP del plasma, evitando la pérdida del colesterol y fosfolípidos de las membranas plasmáticas, favoreciendo su integridad después de la congelación, tal como lo demostró (Bergeron & Manjunath, 2006).

Efecto del uso de etilenglicol y plasma seminal ovino en base tris-fructosa-yema de huevo, en dos diluyentes de conservación de esperma recuperado en epididimos de toros posmortem, sobre los parámetros espermáticos

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