Biotecnología reproductiva: vitrificación de ovocitos bovinos

La vitrificación es una herramienta valiosa para la conservación de material genético femenino. El agregado de ácido linoleico (AL) al medio de maduración in vitro y la modulación de colesterol (Col) pueden modificar la composición lipídica de los ovocitos disminuyendo así el impacto de los daños por la criopreservación y mejorando la criotolerancia de la gameta. Los objetivos de este trabajo fueron: determinar el estatus apoptótico en ovocitos madurados en presencia de dos concentraciones de AL y en presencia de Col en relación con su lipotoxicidad y analizar la localización subcelular del factor de transcripción Oct4, un factor clave en el mantenimiento de la pluripotencia en el embrión, y por lo tanto considerado marcador de calidad ovocitaria (Zuccotti et al., 2012).

La maduración in vitro se llevó a cabo a partir de ovocitos obtenidos de ovarios de frigorífico colocados en medio de maduración suplementado con AL a 43 y 100 μM (Carro et al., 2013) y en medio sin AL. Por otro lado, en el grupo experimental Col se cargó colesterol en los ovocitos previo a la vitrificación (últimos 45 min de maduración) con 15 mM metil-β-ciclodextrina/colesterol y se removió luego del calentamiento con 4.5 mM metil-β-ciclodextrina por 45 min (Buschiazzo et al., 2017). La vitrificación y la detección de caspasas activas se llevó a cabo según Buschiazzo et al., 2017. La presencia y distribución del marcador de calidad ovocitaria Oct4 se evaluó por inmunofluorescencia. El porcentaje de ovocitos con caspasas activas se analizó por ANOVA con análisis en bloque, la probabilidad de distribución de patrones de la señal de fluorescencia de Oct4 de los ovocitos frescos y vitrificados se analizó por regresión logística y Chi-cuadrado (test de independencia), utilizando el paquete estadístico R.

La maduración en presencia de 100 μM de AL provocó un aumento en el porcentaje de ovocitos caspasa + (P< 0,05) (Figura 1). Mientras que no se encontraron diferencias significativas entre los ovocitos vitrificados madurados en presencia de 43 μM de AL, Col y los vitrificados controles. La marcada activación de caspasas en los ovocitos madurados en 100 µM de AL y vitrificados, sugiere un efecto sinérgico de la lipotoxicidad de los ácidos grasos libres y la criopreservación. En el caso del AL se continuó trabajando con la condición 43 μM. Con respecto a Oct4, se analizó y cuantificó su patrón de localización (Figura 2). Se analizó la probabilidad de presentar una señal perimetafásica o difusa en ovocitos vitrificados respecto de los frescos en las distintas condiciones experimentales. La probabilidad que los ovocitos presenten un patrón de distribución de señal perimetafásica es mayor en los ovocitos frescos que en los vitrificados independientemente del agregado de AL o Col. Esta localización podría relacionarse con su rol como factor de transcripción. Sin embargo, postvitrificación, los ovocitos tienen mayor probabilidad de presentar un patrón de Oct4 difuso salvo los incubados con Col que mantuvieron una distribución de los patrones similar a los ovocitos del control fresco.

Figura 1. Activación de caspasas en ovocitos madurados in vitro en presencia de AL o Col y vitrificados. Los resultados se expresan como porcentaje de ovocitos caspasa positivos (media ± SEM). Grupos experimentales: Control vitrificado (V), n= 41; Vitrificado AL 43µM, n= 48; Vitrificado AL 100µM, n=46 y Vitrificado cargados con Col, n=43. Letras diferentes (a-b) indican diferencias significativas (p < 0.05) entre condiciones experimentales.

Figura 2. Distribución de los porcentajes de ovocitos respecto a los patrones de localización de Oct4 en ovocitos bovinos madurados in vitro en presencia de 43 µM de AL o cargados con 15 mM de metil-βciclodextrina/colesterol y vitrificados. Los resultados se expresan en porcentaje de ovocitos para cada patrón de Oct4 para todas las condiciones. Grupos experimentales: ovocitos frescos control (CTR) n= 31; con AL (AL) n= 25 y cargados con Col (Col) n= 24, ovocitos vitrificados control (CTR) n= 36; con AL (AL) n= 21 y cargados con Col (Col) n=37.

El agregado de 43 µM de AL o de Col no modifica el estatus apoptótico de los ovocitos bovinos madurados in vitro post-vitrificación. La concentración 100 µM provoca un aumento significativo de la apoptosis.

El factor de transcripción Oct4 en los ovocitos bovinos madurados in vitro presenta dos patrones de localización subcelular, perimetafásico y difuso, con una distribución pareja entre patrones. La vitrificación modifica la distribución entre los patrones de Oct4 generando una mayor proporción de ovocitos con señal difusa tanto en los ovocitos controles como en los madurados con AL. Sin embargo, la modulación con Col preserva la calidad ovocitaria medida en términos de este factor de transcripción.