Optimización de la producción in vitro de embriones bovinos compatible con la edición génica

La edición génica (EG) basada en CRISPR/Cas9 es una biotecnología que permite acelerar el mejoramiento genético animal produciendo razas con caracteres deseados en plazos reducidos y que ha sido aplicada con éxito en distintos animales de cría, incluido el bovino (Jinek et al., 2012; Menchaca et al., 2020). La EG de cigotos bovinos producidos in vitro genera embriones con mosaicismo genético y su frecuencia varía en función de la nucleasa utilizada, las propiedades intrínsecas del locus, el método de administración de la ribonucleoproteína y el momento de la EG con relación al desarrollo embrionario (LamasToranzo et al., 2019).

El objetivo de este trabajo fue evaluar tiempos reducidos de fecundación in vitro sobre las tasas de clivaje y de blastocistos en embriones bovinos, para ser utilizados en ensayos de edición génica.

Los complejos cúmulus-ovocito (COCs) se recuperaron por aspiración de líquido folicular de ovarios procedentes de un frigorífico local. Los COCs con al menos tres capas compactas de células sin expandir se colocaron en medio de maduración libre de suero (TCM-199 suplementado con hormona folículo estimulante, factor de crecimiento epidérmico, ácido hialurónico, y seroalbúmina). La maduración in vitro se realizó en grupos de 40 COCs en incubadora a 38,5 °C con 5% de CO₂ en aire y máxima humedad durante 22 horas. La fecundación in vitro (FIV) se llevó a cabo colocando los COCs maduros en medio de fecundación con 2.000.000 de espermatozoides por mililitro e incubando a 38,5 °C en atmósfera con 5% de CO₂ en aire y máxima humedad, durante 24, 8 y 6 horas (grupo control, grupos 1 y 2, respectivamente). Luego de la FIV, las células del cúmulus se removieron mecánicamente. Los presuntos cigotos se colocaron en medio de cultivo y se incubaron a 38,5 °C en atmósfera con 5% de CO₂, 5% de O₂, 90% de N₂ y máxima humedad. A las 48 horas de la FIV, se evaluó la cantidad de cigotos divididos y se calculó la tasa de clivaje de cada grupo. A los 8 días de la FIV, se observó el desarrollo embrionario y se calculó la tasa de blastocistos para cada grupo.

Se hicieron al menos tres repeticiones independientes para cada grupo. Finalmente, se determinó la existencia o no de independencia entre el tiempo de fecundación respecto de la tasa de clivaje y la tasa de blastocistos entre los grupos, mediante una prueba no paramétrica de chi cuadrado.

No se evidenciaron diferencias estadísticamente significativas en la tasa de clivaje y la tasa de blastocistos para los diferentes tiempos de incubación de FIV (P> 0,05) (Tabla 1).

Se concluye que los diferentes tiempos de incubación de FIV de 24, 8 y 6 horas no influenciaron las tasas de clivaje y de blastocistos en embriones bovinos.

Este resultado tiene implicaciones importantes en el campo de la EG de embriones bovinos, ya que la maquinaria de edición génica puede introducirse antes de la primera duplicación del genoma y, así, reducir la frecuencia de mosaicismo genético en los embriones editados producidos. De esta manera, se facilitarían los programas de mejoramiento genético bovino.

Se agradece el financiamiento de FONTAGRO, PROCISUR, Asociación de Cooperativas Argentinas, e INTA (2023-PD-L01- I112) que permitieron la realización de este trabajo.