Análisis y tipificación de carne de Búfalo mediante la amplificación por qPCR

La carne, es una de las principales fuentes de nutrientes en la alimentación humana, por su aporte de proteína de alto valor biológico. En los últimos años, los consumidores han presentado interés en fuentes alternativas a la de carne bovina (avestruz, buey de Kobe, búfalo, etc.), tanto para el consumo a nivel nacional como internacional (Huerta Leidenz, 2016). En este sentido, la producción de carne de búfalo (Bubalus bubalis), se encuentra en desarrollo en Argentina, y proporciona una alternativa a la producción de carne en regiones que no son adecuadas para el ganado vacuno, especialmente en el noreste de Argentina y en los humedales (Delta del Paraná), además de atender la demanda de consumidores que requieren carnes de fuentes exóticas. Cabe mencionar que esta carne presenta mayor contenido de minerales, como hierro y menor porcentaje de grasa y calorías, respecto a la vacuna (Bos taurus) (Chamorro et al., 2022). Teniendo en cuenta que ambas especies se faenan, procesan y comercializan en los mismos canales, resulta de interés poder diferenciar objetiva y analíticamente la procedencia de las carnes, como herramienta de calidad y trazabilidad.

El objetivo del presente trabajo fue evaluar la aptitud de la metodología de PCR en tiempo real (qPCR), para diferenciar ambas especies (vacuna y bubalina) utilizando los primers diseñados para la especie Bos taurus.

Se extrajo ADN (por duplicado) a partir de 25 mg de muestras de carne bovina (vaca y búfalo), mediante metodología de resina grado biología molecular. Se cuantificó el ADN por fluorimetría con Qubit™ 2.0 (dsDNA BR Kit; Thermofisher Scientific). Se utilizaron primers específicos, diseñados para la amplificación de la región conservada de Bos taurus obtenido mediante análisis in silico con diferentes softwares (GenBank, BlastN, PrimerExpress, PrimerMap y NetPrimer). La amplificación de ADN por qPCR se llevó a cabo con 1x de Sso Fast EvaGreen Supermix (Bio-Rad) y 300 nM de los primers. La Mix consistió en 2 μl (10-20 ng) de ADN por muestra, en 10 μl vol. final en las siguientes condiciones: 3’ a 98 °C, 40 ciclos a 98 °C por 5’’ y 30’’ a 60 °C y posterior curva de melting (disociación) de los productos de amplificación. Se realizaron amplificaciones (por triplicado), utilizando material genético puro de ambas especies en el equipo Step One Plus (ThermoFisher Inc.). El trabajo se llevó a cabo en Laboratorio de Biología Molecular del ITA (INTA).

La Figura 1 muestra la curva de amplificación de las diferentes muestras analizadas. La curva violeta (izquierda), corresponde a ADN obtenido de tejido de vacuno, mientras que la curva en celeste (derecha) corresponde a ADN extraído de muestra pura de búfalo.

La temperatura a la cual se alcanza la disociación del producto de PCR, se define como temperatura de melting (Tm). Dicha temperatura es específica del producto PCR, y depende de su longitud y del contenido de bases CG. Para la muestra de ADN vacuno pura, la Tm fue de 78.6 °C con un Ct = 21.5, mientras que para búfalo fue de Tm= 79.9 °C y un Ct = 27.25, de este modo se pudo diferenciar ambas carnes mediante la amplificación por qPCR.

Los resultados obtenidos en el presente trabajo permitieron determinar que los primers diseñados para Bos Taurus, fueron capaces de amplificar diferencialmente muestras de ADN puras de vacuno y bubalino. Si bien existe similitud de secuencias que presentan ambas especies de la subfamilia bovina, se logró, a partir de las Tm de ambas muestras puras diferenciar ambos tipos de carne, de manera analítica.

Financiamiento INTA, Cartera Proyectos 2019-2022. Fuska SA.