Uso de la metodología de fluorescencia de fase frontal para la determinación de oxidación inducida por luz en leche en polvo
Publicado: 4 de noviembre de 2013
Por: Adriana Maria Descalzo, Luciana Rossetti, Sergio Anibal Rizzo, Roxana Beatriz Paez, Luciana maria Costabel y Miguel Angel Taverna. INTA.
Resumen
La incorporación de antioxidantes naturales a la leche bovina está relacionada con la dieta de las vacas lecheras. Las dietas pastoriles favorecen una mayor concentración de alfa tocoferol, beta caroteno y retinol en la leche cruda. Estos compuestos de origen natural son percibidos positivamente por los consumidores preocupados por el cuidado de la salud. El objetivo de este trabajo fue diferenciar la leche en polvo obtenida a través de la alimentación de vacas lecheras con diferentes proporciones de pastura de alfalfa en la dieta: 0% (A0); 35% (A35) y 70% (A70) respectivamente en cuanto al contenido de antioxidantes naturales; y si la metodología de fluorescencia de fase frontal podía servir para determinar la oxidación inducida por luz en dichas muestras.
Para el ensayo se tomaron pooles de leche de vacas alimentadas con dietas A0, A35 y A70 (8 vacas/pool) fueron destinados a la elaboración de leche entera en polvo por secado spray a escala piloto. La leche de cada tratamiento fue envasada en bolsas de polietileno bilaminado con atmósfera de nitrógeno y conservada a 20ºC durante 3 meses (n=4). Las vitaminas fueron determinadas por HPLC; la oxidación por TBARS; y la actividad antioxidante por el método de FRAP (Rossetti y col., 2010). La oxidación fue inducida a 2000 lux durante 2 hs. La fluorescencia se determinó usando un espectrofotómetro de luminiscencia PE-LS55 con un adaptador para microplacas.
Los antioxidantes de la leche cruda se conservaron en la leche en polvo elaborada a escala piloto: alfa-tocoferol: 2.57; 4.84; 4.76; gama-tocoferol: 0.56, 0.42, 0.41; betacaroteno: 0.20, 0.96, 0.90; retinol:7.41, 16.33, 16.43 y vitamina D3: 0.94; 0.93; 0.95 (microg/g) para A0, A35 y A70 respectivamente. Los resultados de las medidas de oxidación y actividad antioxidante no arrojaron diferencias significativas entre los diferentes tratamientos: TBARS: 1479.07, 1623.09, 1443.17 (ppb) y FRAP: 410.32, 357.32, 365.85 (microM Fe +2) para A0, A35 y A70 respectivamente.
Al inducir oxidación lumínica (2000 lux durante 2 hs.) se observó que las leches de A70 mostraron protección ante la producción de pigmentos fluorescentes correspondientes a peróxidos lipídicos y formación de ditirosina (oxidación proteica), inducidos por la autooxidación de la riboflavina.
Se concluye que la dieta pastoril favoreció la incorporación diferencial de antioxidantes naturales a la leche y el perfil se mantuvo en la leche entera en polvo, la cual además fue protegida de la oxidación inducida por luz fluorescente. Además la metodología de fluorescencia de fase frontal resultó una técnica no destructiva, útil para medir oxidación en leche entera en polvo.
INTRODUCCIÓN
Los procesos oxidativos son responsables del deterioro no microbiológico de los alimentos. Estos no sólo producen alteraciones en la calidad nutricional de la leche y sus derivados, sino que también inducen la formación de flavors desagradables, los cuales son rechazados por los consumidores.
El flavor (sensación de aroma y sabor) es una de las cualidades más importantes para determinar la aceptabilidad de la leche. Aún cuando las propiedades nutritivas de la misma sean altamente reconocidas, los consumidores no la aceptarán si encuentran aromas y sabores extraños. De este modo deberán evitarse las condiciones que puedan favorecer la oxidación, desde la obtención de la materia prima y luego durante cada etapa del procesamiento. Los puntos más críticos para el desarrollo de oxidación son el tiempo de almacenamiento de la leche y la distancia desde los tambos hasta el punto de procesamiento, y luego las condiciones de procesamiento y almacenamiento de la misma. La vida útil de la leche y los productos lácteos resulta entonces altamente dependiente de su composición química, esencialmente desde el punto de vista del balance de los compuestos químicos prooxidantes y antioxidantes presentes en la misma.
La oxidación inducida por luz fluorescente tiene efectos adversos sobre el flavor de la leche y sus productos derivados. El mecanismo de oxidación comienza mediante la fotosensibilización de la riboflavina (Vitamina B2), la cual genera radicales libres que inducen la oxidación lipídica y protéica. Esta vitamina, a diferencia de las vitaminas antioxidantes, se encuentra en la fracción hidrosoluble de la leche en contacto con las proteínas del suero posibilitando la oxidación de las mismas.
Tradicionalmente la fluorescencia ha sido aplicada a muestras claras en las cuales el haz de luz de excitación incide con un ángulo de 90 grados y se mide la emisión reflejada. Cuando los fluorósforos se encuentran en altas concentraciones o las muestras presentan turbidez, este tipo de medición no es posible y entonces se puede aplicar la espectroscopia de fluorescencia de fase sólida frontal, la cual mide la fluorescencia emitida sólo por la superficie de la muestra. Algunos investigadores como Andersen y Mortensen (2008) y Gatellier y colaboradores (2007) describieron la aplicación de esta técnica con el uso de distintos pares de longitudes de onda para describir la fluorescencia de compuestos como lipoperóxidos, riboflavina, vitamina E, ditirosina y triptófano. Mediante el uso de esta técnica se ha logrado diferenciar leche entera en polvo fresca de oxidada (Descalzo y col., 2010).
El objetivo de este trabajo fue diferenciar la leche en polvo obtenida a través de la alimentación de vacas lecheras con diferentes proporciones de pastura de alfalfa en la dieta: 0% (A0); 35% (A35) y 70% (A70) respectivamente en cuanto al contenida de antioxidantes naturales; y si la metodología de fluorescencia de fase frontal podía servir para determinar la oxidación inducida por luz en dichas muestras.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se evaluaron tres tratamientos alimenticios, los cuales se diferenciaron en la proporción de alfalfa fresca contenida en la dieta ofrecida: 0 cero alfalfa (A0), 35% de alfalfa sobre base seca (A35) y 70% de alfalfa en la dieta sobre base seca (A70). El resto de los ingredientes fueron incluidos para mantener el balance de energía y proteína bruta las dietas ofrecidas. Para cada tratamiento se utilizaron 8 vacas lecheras y se obtuvieron pooles de leche de los diferentes tratamientos (tabla 1). A partir de dichos pooles se elaboró leche entera en polvo (LEP) a escala piloto por la metodología de secado spray.
Cuatro muestras correspondientes a cada tratamiento (100g) fueron envasadas en forma individual en bolsas de polietileno bilaminado y bajo atmósfera de nitrógeno. Las muestras de LEP se conservaron durante tres meses a 20ºC.
Las vitaminas se determinaron por cromatografía HPLC previa extracción con hexano y un paso de saponificación. Se utilizó y un equipo TSP (USA) con bomba cuaternaria, automuestreador y detectores de arreglo de diodos: 265 nm para vitD3, 325 nm para retinol y 445 nm para beta caroteno y detector de fluorescencia (296-330 nm) para los tocoferoles.
La oxidación se determinó por la técnica de TBARs y la actividad antioxidante total por el método de FRAP (Rossetti y col., 2010). Las concentraciones de todos los analitos se determinaron en base a curvas de calibración con estándares (SIGMA-ALDRICH, Arg.).Para la determinación de fluorescencia de fase frontal se utilizó un espectrofotómetro de Luminiscencia Pelkin Elmer modelo LS55 con accesorio para lectura de placas en superficie.
Se aplicó el análisis de ANOVA a un factor o dos factores (se indica la significación de la interacción) para comparar los resultados según cada caso (INFOSTAT®).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 1: Composición de las dietas de vacas lecheras.
En la tabla 1 se muestra la composición de las dietas de las vacas lecheras. La incorporación de alfalfa favoreció el enriquecimiento de la leche cruda con antioxidantes naturales. Como se observa en la tabla 2, las concentraciones de alfa tocoferol, betacaroteno y retinol fueron significativamente más elevadas en las leches en polvo de los tratamientos procedentes de las dietas conteniendo pastura de alfalfa (A35 y A70). En cambio para el gama tocoferol se observó la tendencia inversa, indicando mayor incorporación en la dieta de silo.
Tabla 2: Parámetros antioxidantes y medición de oxidación en LEP para los diferentes tratamientos.
El beta caroteno y el retinol mostraron concentraciones mayores en las LEP procedentes de dietas conteniendo pastura de alfalfa, mientras que las concentraciones de vitamina D3 fueron similares para este ensayo entre los diferentes tratamientos.
A pesar de las diferencias en las concentraciones de vitaminas antioxidantes, las mediciones de oxidación y capacidad antioxidante total no fueron diferentes en LEP envasada bajo atmósfera de nitrógeno, indicando que el envasado y el almacenamiento no indujeron alteraciones en forma diferencial (para los distintos tratamientos) a los tres meses post elaboración. En cuanto a la determinación de oxidación lipídica por la técnica de TBARS no resultó efectiva para medir el deterioro sufrido por la leche en polvo durante el almacenamiento. Liang (2000) describe en su trabajo que el nivel de peróxidos deja de ser detectable durante el transcurso del almacenamiento de la leche en polvo, y discute que estos compuestos serían inestables, se degradarían y por eso dejan de ser detectados por métodos químicos (valor peróxido o TBARS). De este modo ladeterminación de espectroscopía de fluorescencia y el incremento en la intensidad de la misma podría resultar un método más confiable que la determinación química que el valor peróxido y el TBARS para el seguimiento de la oxidación de leche en polvo.
La aplicación de luz fluorescente sobre la LEP indujo oxidación, la cual fue medida por fluorescencia de fase sólida. Para ello se determinaron las longitudes de onda correspondientes a la formación de peróxidos, formación de ditirosina y espectro de la riboflavina.
Al aplicar 2000 lux durante dos horas, se observó en todas las muestras un descenso en la señal de riboflavina (445-520 mn), indicando que la iluminación indujo la autooxidación de esta vitamina, la cual es un conocido factor de deterioro de los productos lácteos, cuya cinética de degradación por luz fluorescente es de primer orden (Mestdahg y col., 2011).
En el caso de la oxidación inducida por luz, la LEP del tratamiento A70 resistió en mejores condiciones a los efectos de deterioro medidos como peróxidos o determinación de ditirosina. Este resultado estaría indicando que la alimentación pastoril favorece la incorporación de compuestos a la leche, los cuales cumplen con una función protectora ante el deterioro oxidativo.
Tabla 3: Determinación de parámetros de oxidación inducida por luz fluorescente mediante la aplicación de la metodología de fluorescencia de fase frontal.
CONCLUSIONES
La dieta pastoril favoreció la incorporación diferencial de antioxidantes naturales a la leche y el perfil se mantuvo en la leche entera en polvo, la cual además fue protegida de la oxidación inducida por luz fluorescente. Además la metodología de fluorescencia de fase frontal resultó una técnica no destructiva, útil para medir oxidación en leche entera en polvo.
BIBLIOGRAFÍA
Andersen and Mortensen (2008). Fluoresecnce Spectroscopy: A rapid tool for analyzing Dairy products. J. Agric. Food Chem 56: 720-729.
Benzie, I. F. F., & Strain, J. J. (1999). Ferric reducing/Antioxidant power assay: direct measure of total antioxidant activity of biological fluids and modified version for simultaneous measurement of total antioxidant power and ascorbic acid concentration. Methods in Enzymology, 299, 15–27.
Descalzo, Adriana M., Rizzo, Sergio A. Rossetti, Luciana, Negri, Livia, Páez, Roxana B., Costabel, Luciana y Taverna, Miguel A. (2010) Uso de la técnica de espectroscopía de fluorescencia en fase sólida para la determinación de vida útil de leche en polvo. Revista Ingeniería Alimentaria.85: 54-60.
Gatellier,P., Gomez, S., Gigaud, V., Berri, C, Le Bihan-Duval, E. and Sante´-Lhoutellier, V. (2007). Use of a fluorescence front face technique for measurement of lipid oxidation during refrigerated storage of chicken meat. Meat Science 76: 543–547.
Havemose, M.S., Weisbjerg, M.R., Bredie, W.L.P. and Nielsen J.H. (2004), Influence of feeding different types of roughage on the oxidative stability of milk. Int. Dairy J. 14, 563- 570.
Liang, J.-H. (2000) Kinetics of fluorescence formation in whole milk powders during oxidation. Food Chem. 71: 459-463.
Mestdagh,F., Kerkaert, B., Cucu, T., De Meulenaer, B. (2011). Interaction between whey proteins and lipids during light-induced oxidation, Food Chemistry, 126(3): 1190-1197, ISSN 0308-8146, 10.1016/j.foodchem.2010.11.170.
Rossetti, L., Langman, L., Grigioni, G.M., Biolatto, A., Sancho, A.M., Comerón, E. and Descalzo. (2010) Antioxidant status and odor profile in milk from silage or alfalfa-fed cows. Australian Journal of Dairy Technology. 65 (1):3-9.
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Autores:
Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria - INTA
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