El Reactivo de California y su elaboración en un laboratorio de primer nivel
Publicado: 21 de agosto de 2019
Por: Antonio Hernández Beltrán, Patricia Cervantes Acosta, Belisario Domínguez Mancera, Federico Gómez Boucrin.
INTRODUCCIÓN
La prueba de California para el diagnóstico subclínico de la mastitis ha sido ampliamente utilizada para el desarrollo de programas de medicina veterinaria preventiva relacionados con lo que se reconoce como la enfermedad más común y la que más pérdidas económicas genera a la ganadería lechera (Escobar y Ponce, 2001).
La mastitis es una enfermedad propia de las hembras en lactación, por lo que la prueba ha sido utilizada para el diagnóstico de mastitis en, ovinos, caprinos, llamas y camellos, en estas últimas se utilizado junto con conteo de células somáticas, donde los resultados muestran un valor similar entre ambas pruebas (p<0.05), para predecir el estado que gurda la infección de la ubre (Abdurahman, 1996). Estos resultados son semejantes a los obtenidos en trabajos similares realizados en otras especies.
La prueba de California de mastitis conocida como California Mastitis Test (CMT) es, de acuerdo con Mellenberg (2001), un examen sencillo que con exactitud predice el conteo de células somáticas ya sea, a partir de cada cuarto o en muestras de leche. La exactitud del CMT se fundamenta en tres principios:
- El número de leucocitos (células blancas) incrementa enormemente en número cuando una lesión o una infección afectan el tejido mamario.
- Los leucocitos, especialmente los polimorfonucleares tienen un núcleo extenso con material nuclear (ADN) comparadas con otras células o bacterias de la leche.
- Las paredes de los leucocitos son principalmente lípidos (grasa).
¿Cómo es que funciona el reactivo CMT?
El reactivo CMT es un detergente con un indicador de pH añadido, razón del color púrpura, cuando la leche y el reactivo se mezclan en igual cantidad, el reactivo de CMT, disuelve o rompe las paredes celulares externas y las nucleares de cualquier leucocito, constituidas principalmente de grasa (el detergente disuelve la grasa), el ADN ahora se libera desde el núcleo. El ADN se gelifica formando una masa fibrosa; debido a que el número de leucocitos se incrementa en los cuartos afectados, la cantidad de gel formado se incrementará en una forma lineal, además, la formación puede ser clasificada en función al resultado del conteo de células somáticas, (Cuadro 1):
Las lecturas de 1, 2 y 3 son positivos sin duda; una lectura Traza, indica una posible infección. Cuando los cuatro cuartos indican trazas no es signo de infección, sin embargo, si dos cuartos tienen indicativo de traza la infección es posible, una lectura negativa indica no infección.
La idea de desarrollar un reactivo químico de la mastitis, semejante a CMT, ha prosperado en diversos laboratorios que ofrecen servicios de diagnóstico en las IES del país y del extranjero.
En el presente trabajo se reportan datos sobre la utilización de un reactivo similar a CMT elaborado en el Laboratorio de Alteraciones Funcionales (LAF) de la Unidad de Diagnóstico (UD) “Augusto R. Mancisidor Ahuja” localizado en las instalaciones de la Posta Zootécnica “Torreón del Molino”, instancias académicas de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Veracruzana (UV), en Veracruz, México.
ANTECEDENTES
La necesidad del LAF de contar con la oportunidad de ofrecer un reactivo similar a CMT, surge a medidos de la década de los años noventa (1995), a partir del reporte de una drástica reducción en el empleo de la prueba de mastitis por parte los productores de lechería tropical del sistema bovino de doble propósito (SBDP) integrados como Grupos Ganaderos de Validación y Transferencia de Tecnología, también conocidos como GGAVATS, en donde el uso de CMT, esta considerada como un práctica estratégica para el desarrollo y consolidación de dichos grupos de productores, y la disminución de su empleo entre los mismos se asociaba a los altos costos que representaba su utilización, dada la fuerte crisis económica que afecto de una manera significativa a las empresas pecuarias por aquellos años, por lo que las IES involucradas, entre ellos la UV, generaron acciones para que las metas propuestas para el desarrollo del programa de innovación tecnológica no fueran afectadas.
Por lo que se consideró la posibilidad de remplazar el para el diagnóstico de CMT por un reactivo preparado con base a detergentes aniónicos y colorantes indicadores del pH existentes en el mercado local, con un costo menor al reactivo CMT que se ofrecía de una manera comercial a los productores.
MATERIALES Y METODOS
MATERIAL DE LABORATORIO
Matraz Erlen – Meyer de 500 ml.
Probetas graduadas de 100 ml.
Pipetas automáticas 10 – 100 y 100 – 1000 µ L.
Agitador magnético con imán para agitación.
Balanza y papel glacine.
Envases plásticos de 1 L.
REACTIVOS
Jabón líquido obtenido en el comercio local: Agua, tensoactivo no iónico, tensoactivo aniónico, agente humectante y perfume, (ALEN, INC. USA).
Agua purificada libre de sodio, obtenida en el mercado local, (Coca – Cola Company. USA).
Colorante purpura de bromocreasol, (SIGMA).
MATERIAL DE CAMPO.
Paleta de plástico para el diagnóstico de mastitis.
Para la preparación del reactivo se empleo la formula propuesta por Jasper et al. (1972), modificada por el LAF, (Cuadro 2).
Para evaluar la viabilidad del reactivo preparado, se llevaron a cabo pruebas de CMT en veinte hatos del SBDP manejados de acuerdo al paquete tecnológico de los GGAVATT, de donde se obtuvieron muestras de leche al azar de 448 vacas, de las cuales se realizó la prueba en 1792 cuartos.
Para valoración de la prueba CMT se siguieron los criterios propuestos por Ávila, (1994), para la interpretación de la misma en vacas del SBDP; donde se consideraron negativas las muestras que presentaron una reacción sin evidencias o precipitación; trazas a las que solo reaccionaron de una manera leve.
Positiva 1, cuando no existió la formación de gel, y si una muestra espesa; positiva 2, aquellas muestras que presentaron una reacción espesa, más cierta formación de gel leve y positiva 3, cuando la reacción causa la formación de gel y esta muestra una forma convexa.
Las muestras se tomaron por duplicado, de las cuales una se utilizo para realizar la prueba con el reactivo comercial de CMT, que de una manera rutinaria se había utilizado para realización de las pruebas en el GGAVATT seleccionado y la otra para realizarla con el reactivo elaborado en el LAF.
Por medio de un examen estadístico entre las pruebas; el CMT comercial y el elaborado en LAF, se obtuvo el valor del índice de correlación ó r.
RESULTADOS
Los resultados estadísticos mostraron una estrecha correlación, (r = 0.99), entre las pruebas, donde la diferencias existentes se apreciaron en la reacciones calificadas como trazas.
El análisis de los costos, el cual considero el precio en el mercado del reactivo comercial, contra los costos por concepto de insumos reactivos, gastos de alquiler por hora del laboratorio y el pago por hora del profesional que realiza la prueba; arrojó una diferencia de 60.8%, siendo más económica la prueba del reactivo preparado en LAF que el reactivo CMT comercial.
En Cuba se desarrollo un reactivo químico de la mastitis que contiene un detergente anionico ramificado sintético, el cual presento una correlación del 99.5%, similar a la encontrada en el reactivo preparado en LAF (Escobar y Ponce, 2001).
Una vez determinada la validez de la prueba y su utilidad en el campo, por medio de la realización de un taller sobre la elaboración del reactivo se capacito a los técnicos responsables de los GGAVATT para que lo desarrollaran y lo emplearan en el programa de innovación tecnológica; a la fecha la práctica de preparación del reactivo similar a CMT del LAF, es usada con fines educativos en la preparación de los estudiantes que cursan la carrera de MVZ en FMVZ de la UV.
INSTRUCCIONES RÁPIDAS PARA PREPARAR EL REACTIVO PARA LA PRUEBA DE CALIFORNIA
Fundamentación
La Prueba de California para Mastitis consiste en la adición de un detergente a la leche (aquil-aril sulfonato de sodio), que causa la liberación de ADN de las células presentes y en combinación con agentes proteicos de la leche se forma un gel. A mayor presencia de células se libera una mayor concentración de ADN, por lo tanto mayor será la viscosidad del gel ; la lectura e interpretación del resultado indicará el grado de inflamación. La solución posee el indicador de pH Purpura de Bromocresol, (5',5-Dibromo-o-Cresolsulfonftaleína – C21H16Br2O5S -, Técnica Química(MR)), que muestra los cambios de pH que ocurren en la leche a causa de la inflamación (Saran y Chaffer, 2000). Cuando la glándula está inflamada por un proceso infeccioso, junto con la leche se eliminan cantidad de células, sobre todo neutrófilos, que son las responsables de proteger al órgano de las bacterias. Cuantas más células haya, mayor infección se ha de esperar que tenga la glándula.
Preparación del reactivo colorante
Reactivo Purpura de Bromocresol en polvo (Amarillo – Purpura) ; Indicador pH 5.2 – 6.8. (C21H16Br2O5S ; Nº CAS: 115-40-2)
Solución Madre : Pesar 1.5 gr de Purpura de Bromocresol y diluir en 100 ml de agua destilada (solución1.5% P/V).
Solución de trabajo : Guardar en un envase ambar, en un sitio fresco a temperatura ambiente
Preparación del reactivo CMT
Ingredientes necesarios para preparar un litro (1000 ml) de reactivo de CMT.
- Agua purificada 750 ml.
- Jabón lavatrastes 250ml (sin aditivos).
- Solución de trabajo del reactivo púrpura de Bromo Cresol 4 ml (0.4 % V/V).
- Mezclar suavemente y guardar en un recipiente plástico que sea útil para emplearse durante la prueba y mantener en un lugar fresco.
- Para la prueba, coloque preferentemente en una paleta de cuatro pozos, en volumen igual (1:1) de Reactivo CMT y de leche problema de la glándula correspondiente, mezcle suavemente en forma circular y espere al menos 20 segundos para su interpretación.
Referencias
Abdurahman, O.A.S., 1996. The detection of subclinical mastitis in the bactrian camel (Camelus bactrianus) by somatic cell count and California mastitis test. Veterinary Research Communications. 20: 9-14.
Ávila T.S., 1994. Procedimientos para el diagnóstico de la mastitis. Memoria. Curso, Manejo de la Salud del hato. CEIEGT – FMVZ – UNAM. Martínez de la Torre, Veracruz, México. 18p.
Escobar A. y Ponce P., 2001. Obtención evaluación de un diagnosticador químico para la determinación de la mastitis. Rev. Salud Anim. 23:97 – 101.
Jasper D.E., Wittwer M.V., Araya O. y Pappel C. (1972). Empleo de un reactivo preparado con TEEPOL para ser utilizado en el “California Mastitis Test” (CMT). Archivos de Medicina Veterinaria. 1:1 – 2.
Mellenberg R. 2001, California mastitis test (CMT) an Invaluable toll for managing mastitis. Dept. of Animal Sciences. Michigan State University. Disponible internet http://www.immucell.com/pdf/An InvaluableTool.pdf [Fecha de acceso: septiembre, 2012].
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