Identificación bacteriana empleando Pcr-Dgge en leche de vacas con mastitis de un rebaño mestizo gyr-holstein del municipio Obispo Ramos de Lora, Mérida, Venezuela

Publicado el: 7/12/2017
Autor/es:
Resumen

Con el objetivo de caracterizar las bacterias presentes en muestras de leche mastíticas de vacas Girolando (Mestizas Holstein-Gyr), procedentes de un rebaño con una historia de mastitis clínica de 6 meses y baja en la producción lechera, se empleó la técnica PCR-DGGE usando como marcador la región V3 del ADNr 16S, la cual es una metodología independiente de cultivo bacteriológico. La valoración de mastitis sub clínica se realizo por medio de CMT y las muestras se tomaron de vacas que tenían al menos 4 semanas sin terapia antibiótica. Las alícuotas fueron usadas para bacteriología e identificación molecular. Solo se seleccionaron las muestras negativas a cultivo para hacer la PCR-DGGE. El valor de mastitis sub-clínica por CMT al momento de la toma de muestra fue de 48.07% (225 cuartos). El PCR-DGGE permitió evidenciar la presencia de varios tipos de bacterias en las muestras estudiadas, las cuales se relacionaron más estrechamente a bacterias de los filos Firmicutes y Proteobacterias, donde destacó la presencia del género Acinetobacter. Muchos de estos microorganismos están implicados en multi-resistencia antibiótica, por lo cual la técnica se convierte en una herramienta útil para analizar estas poblaciones microbianas en vacas con mastitis clínica y cultivo negativo y establecer mejores medidas de control y prevención contra esta patología en las fincas lecheras. Se requieren otros estudios para establecer las posibles implicaciones de los microorganismos aislados sobre la salud humana y animal.

Palabras Clave: Bacterias, Mastitis, Cultivo negativo, PCR-DGGE.

Introducción

La mastitis bovina es una infección de la glándula mamaria presente día a día en las explotaciones lecheras (Kuang, Tani, Synnott, Ohshima., Higuchi, Nagahata, y Tanji, 2009). Las mastitis pueden ser de tipo subclínicas y clínicas, afectando la salud y bienestar animal; lo cual se acompaña de disminución en la producción láctea, incremento en costos sanitarios, mayor tasa de descarte y en algunas ocasiones la muerte del animal (Melchior, Vaarkamp, y Fink-Gremmels, 2006). Anualmente, ocasiona millones de dólares en pérdidas a nivel mundial, asociadas básicamente a reducción en la producción y calidad, así como por descarte de leche en vacas tratadas (Kuang et al., 2009), los productores deben hacer grandes esfuerzos para reducir la incidencia de mastitis en sus rebaños, siendo la mastitis sub-clínica el mayor reto.

Esta patología puede ser causada por más de 150 patógenos distintos de tipo contagioso o ambiental, los cuales pueden ser clasificados en 5 grandes grupos: cocos Gram-positivos, cocos Gram negativos, Corynebacterium, Mycoplasma y misceláneos como Nocardia, Prototheca y levaduras (Rebhun,William., Guard, Chuck y Richards, Carolyn, 1995).

En muchos países, el patógeno más importante asociado a la infección intramamaria en vacas lecheras es Staphylococcus aureus (Graber, Casey, , Naskova, Steiner, y Schaeren, 2007; Kuang et al.,2009). Entre las especies de estreptococos, el S. agalactiae, S. dysgalactiae y S.uberis son los de mayor importancia en las mastitis ambientales (Dmitriev, Bhide, Y Mikula, 2006). Escherichia coli es uno de los principales patógenos relacionados con mastitis ambientales, con un amplio rango de diseminación y con distintos niveles de severidad que van desde la forma aguda a la sistémica (Günther, Esch, Poschadel, , Petzl, Zerbe, Mitterhuemer, y Seyfert, 2011).

Los organismos coliformes como Escherichia coli, Enterobacter aerogenes y Klebsiella pneumoniae, por lo general causan mastitis clínica, a veces aguda o hiperaguda, limitada a un cuarto y de corta duración. Esta infecciones son de difícil diagnóstico por medio de la bacteriología clásica, debido a los bajos contajes y la duración de la infección. Muchos de estos patógenos como estreptococos y enterococos se presentan con más frecuencia durante el período de secado de las vacas, siendo más prolongadas las causada por coliformes (Scaramelli y González, 2005).

Los microorganismos que causan mastitis varían ampliamente entre países, regiones, fincas y de un momento a otro dentro de una finca, además la mastitis puede estar influenciada por el tipo de ordeño y las condiciones en las que el ordeño se practica, lo que hace necesario conocer la propia realidad de la mastitis en las diversas regiones y fincas lecheras para de esta forma implementar programas de control de mastitis, de acuerdo a los problemas específicos (Farías, García, D’Pool, Valero, Allara y Angelosante, , 2005).

Los estudios epidemiológicos revelan que luego de un tratamiento con agentes antimicrobianos, la tasa de curación varia en un rango de 0% a 80%, dependiendo de la edad, número de partos, fase de lactancia, posición del cuarto infectado y Contaje de Células Somáticas (CSS) (Sol, Sampimon, Snoep, y Schukken, 1997)

Las metodologías clásicas para el control y prevención de mastitis se basan en evaluación de la mastitis subclínica por medio del California mastitis test (CMT) en las fincas, el cual debe ejecutarse de manera periódica, y el CSS que realizan las plantas procesadoras de leche. La determinación de los microorganismos causales del problema se realiza por lo general usando aislamiento, cultivo y antibiograma de leche de la glándula afectada y monitoreo en leche de tanque,; siendo esta metodología de amplio uso y dominio, tiene la desventaja de que hay poblaciones viables no cultivables (microorganismos que crecen en condiciones naturales y que aún no han podido ser cultivados en el laboratorio), que no pueden ser detectadas por esta vía.

En cuanto a las alternativas de identificación microbiana, hoy día existen distintos métodos de biología molecular que permiten tipificar las poblaciones microbianas presentes en una muestra compleja (orina, leche, heces, líquido ruminal, y fluidos fetales).

A partir del descubrimiento de los ácidos nucleicos por Watson y Crick en 1953, una revolución molecular empezó en el mundo orientada a saber si estas moléculas eran la mejor manera de establecer relaciones filogenéticas y determinar la identidad precisa de los individuos.

Sin embargo, la metodología que realmente generó un avance significativo en la biología molecular se la debemos a Karys Mullys en 1986, con la amplificación de fragmentos de ADN, llamada reacción en cadena de la polimerasa o PCR. A partir de entonces se han derivado numerosas técnicas de genotipificación a nivel de procariotes y eucariotes que han llevado a realizar cambios importantes en las relaciones filogenéticas, principalmente en el área microbiana, y que han logrado ser herramientas aplicables a la ciencia básica y aplicada (microbiología clínica humana, animal y en alimentos).

Uno de los procedimientos que es de gran utilidad en la microbiología clínica es el estudio del marcador de ADN 16S por medio de la electroforesis en gradiente desnaturalizantes, mejor conocida como DGGE por sus siglas en inglés, que permite la identificación de microorganismos cultivables y no cultivables porque es independiente de ello. (Muyzer, De Waal, y Uitterlinden, 1993; Kuang et al, 2009).

En ese particular se propuso el uso de la metodología PCR-DGGE, para conocer la población bacteriana presente en leche de vacas de un rebaño lechero con mastitis clínicas y negativas a cultivo bacteriológico.

 

Metodología

1. Determinación de Mastitis sub clínica y toma de muestras:

Se evaluó un rebaño lechero en el Municipio Obispo Ramos de Lora, estado Mérida, Venezuela, consistente en 117 vacas de la raza Girolando con un promedio de 15 litro/día y manejado mediante ordeño mecanizado. Al momento del estudio se determinó que este rebaño había presentado un descenso estimado del 30% en la producción y casos de mastitis clínicas en los últimos seis meses.

La determinación en campo se realizó empleando el California Mastitis Test (CMT), a todos los cuartos en producción, y los resultados fueron interpretados por un técnico entrenado. La escala utilizada fue la numérica usando los valores 0,1, 2 o 3, en donde el valor 0 indica que no hay reacción, el valor 1 es traza, siendo los valores 2 y 3 positivas en orden creciente (Dingwell, Leslie, Schukken, Sargeant y Timms, 2003).

Como se muestra en la tabla 1, se tomaron cinco muestras de vacas con signos de mastitis clínica (V2, V4, V5) y sub-clínica (V1 y V3) de acuerdo a las normas sugeridas por Scaramelli, para un muestreo adecuado para estudio microbiológico (Scaramelli, 2005; NMC, 1999). Para el estudio se hizo un pool (cuatro cuartos) de cada vaca; una alícuota de las muestras fue enviada al Laboratorio de Microbiología de la Escuela de Farmacia de la Universidad de Los Andes (Venezuela) y otra congelada a -20 °C, hasta su procesamiento extracción de ADN y PCR-DGGE.

 

Tabla 1. Vacas seleccionadas sometidas al PCRDGGE. Se incluyen datos relacionados con: CMT, días en lactancia, promedio de producción, presencia de signos clínicos y cultivo bacteriano.

Fuente: datos suministrados por el productor de las vacas

 

2. Extracción de ADN a partir de muestras de leche

Se descongeló una alícuota de leche a partir de la cual se tomaron, 500 microlitros (µL) de leche que se mezclaron con 100 µl de buffer NET (50 mM NaCL, 125mM EDTA, 50mM Tris-HCL [pH 7.6]), 100 µl de dodecil sulfato de sodio 24% (concentración final 3.4%), se incubó a 80 grados por 10 minutos y luego se enfrió en baño de hielo, se adicionó 325 µg/ml de proteinasa K sy e incubó a 37 grados por 1.5 horas;, la extracción de ADN se hizo por la metodología estándar de fenol:cloroformo:alcohol isoamilico (25:24:1), precipitación con isopropanol, lavado con etanol y secado al vacío (Romero y Lopez, 1999). El pellet de ADN se reconstituyó en 25 µl de agua estéril destilada, se evidenció el ADN genómico por medio de electroforesis con gel de agarosa al 0.8% (p/v) y tinción con bromuro de etidium, luego se almacenaron a -20 C° hasta su uso. Se empleó 2 microlitros de ADN dilución 1/10 para cada mezcla de reacción.

3. DGGE en muestras de leche

Fueron extraídos 5 ADN genómicos de muestras de leche, para ser evaluados por medio del PCR-DGGE: se emplearon los iniciadores de la región V3 del ADN ribosomal 16S, que se detallan a continuación : cebador P1 , 5’-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’; cebador P2, 5’ –ATT ACC GCG GCT GG-3’ y cebador P3 con cola de GC,5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’ (Muyzer et al, 1993). La secuencia del P3 es la misma que el P1 pero con una cola de guaninacitosina. Para la amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa se emplearon una con los cebadores P1 y P2, para evaluar amplificación de la banda de interés de 200 pb, y luego se realizó un segundo PCR con los cebadores P3 y P2, las bandas fueron evidenciadas por medio de electroforesis con gel de agarosa al 1.5% (p/v) y teñidas con bromuro de etidium. La mezcla de reacción se realizó según el protocolo de Muyzer para PCR-DGGE (Muyzer et al, 1993), en un termociclador marca Eppendorf Mastercycler® Gradient, el ciclaje fue 95 C° 3 minutos, 35 ciclos de 94 C° por 1 minuto; 55 C° por 1 minuto, 72 C° 2 minutos y extensión final de 72 C° 3 minutos. La corrida se efectuó durante 12 horas a 90 voltios y temperatura constante de 58ºC en un equipo para DGGE marca C.B.S Scientific, utilizando geles de acrilamida al 8% (acrilamida:bis-acrilamida 37:5:1 (v/v)), con un gradiente de desnaturalización de 40 a 80% (obtenido de una mezcla de urea: 42,16% y formamida: 40% en 100% desnaturalizante).

Una vez finalizada la electroforesis se procedió a teñir con bromuro de etidium y visualizar en luz UV las bandas obtenidas, para cortarlas y colocarlas a 4ºC en tubos de eppendorf de 1,5ml con 30µl de agua destilada por 48 horas. Se procedió luego a realizar una amplificación con volumen final de 50 µL, para evidenciar la amplificación de la banda de interés y purificar el ADN del producto de PCR con el kit PCR CleanUp (Invitrogen®) bajo las instrucciones del fabricante. Una vez purificado fue enviado a secuenciación a la Unidad de Estudios Genéticos y Forenses del nstituto Venezolano de Investigaciones Científicas (UEGF-IVIC).

4. Análisis Filogenético:

Los datos obtenidos de la secuenciación fueron evaluados por la herramienta de alineación de secuencias local del NCBI-Blast, luego los software Clustal Omega, Mega 6 y Gel Comprar II 6.6, para alineamientos múltiples, filogenia y edición de fotos respectivamente.

 

Resultados

Se evaluaron 117 vacas lecheras (468 cuartos), de los cuales se detectaron: 226 cuartos sanos (48.29%), 13 cuartos perdidos (2.77%), 225 cuartos con mastitis sub-clínica (48.07%) y 4 cuartos con mastitis clínica (0.87%). Los resultados de laboratorio de las muestras de las vacas con mastitis clínica que fueron evaluadas por DGGE, reportaron cultivos negativos hasta 48 horas de incubación.

Las muestras V1, V2, V4 y V5 amplificaron a la región V3 del gen ADN ribosomal 16S, y los amplicones fueron sometidos al DGGE. La figura 1 detalla las bandas obtenidas para cada muestra, la vaca V3 no amplificó inicialmente y se corrió en el gel como vaca negativa. La V1 solo obtuvo una banda; la V2 presentó tres bandas que no se cortaron por tener un perfil similar a tres de las bandas de V5; la V4 presentó una sola banda y V5 obtuvo el perfil de siete bandas, de las cuales la banda V5.1 no fue enviada a secuenciación por no amplificar luego de la purificación de la banda, ésta era de muy baja intensidad en el gel del DGGE.

En base a la relaciones filogenéticas, las bandas fueron identificadas más cercanamente a los filos de Proteobacterias (Gamma-proteobacterias), Firmicutes (Bacillin) y Bacteroidetes (Flavobacterias), como se puede evidenciar en la figura 1., del árbol filogenético obtenido de las UTO, bajo el método UPGMA para establecer las relaciones entre secuencias de alineamientos múltiples.

 

Figura 1. Gel de DGGE para análisis de la composición bacteriana de leche cruda procedente de vacas Girolando con mastitis clínica y sub clínica.

 

Figura 2. Árbol filogenético bacteriano a partir de secuencias de bandas de DGGE, de muestras leche cruda procedente de vacas Girolando con mastitis clínica y sub clínica.

 

Es importante destacar que los microorganismos relacionados con el perfil la banda V5.2, V5.3 y V54 se repiten en la vaca V2 que no se cortaron, los cuales se corresponden a los géneros Streptococcus, y Acinetobacter, siendo la última la más común de las UTO que se encontraron presente en las vacas V2,V4 y V5.De las 4 vacas evaluadas, dos vacas estaban en el mismo lote de producción y las tres presentaban mastitis clínica con alteraciones en la leche, como se puede detallar en la tabla 2 (datos obtenidos del programa Gansoft®), al momento del estudio de campo.

De esa manera se logró determinar la presencia de bacterias acido lácticas (Lactococcus), patógenos ambientales como Streptococcus spp., Acinetobacter y Aeromonas. La vaca V1 obtuvo una sola banda relacionada con Lactococcus lactis , y la vaca 4 una sola banda V4.1 cercana a Acinetobacter calcoaceticus, la banda V5.5 correspondiente a Acinetobacter haemolyticus, está ubicada similar a la V4, ambas pertenecen al género Acinetobacter, pero la región usada del ADNr 16S permitió tipificar dos especies diferentes. La banda V5.2 se relacionó con Streptococcus suis y la banda V5.7 fue identificada como Aeromonas hydrofila, dos UTO no lograron ser identificadas debido a bajos índices de identificación en el BlastN, y otra fue catalogada como secuencia parcial del ADN 16S de bacteria no cultivable, lo cual sucede con cierta frecuencia en este tipo de metodología.

Los microorganismos más cercanamente identificados están desglosados en la tabla 2, donde se observa el porcentaje e identificación por el BlastN-NCBI, y el código de acceso a la secuencia más parecida con la cual alineó. Solo dos secuencias resultaron con porcentajes menores al 97% de identificación usando esta metodología, la secuencia V5.3 y V5.5 las cuales corresponden parcialmente a las especies de Chryseobacterium y Moraxella, pero serán reportadas como no identificadas y requerirán un segundo proceso de identificación. Todas las demás secuencias presentaron índices mayores a 97% de similitud con las secuencias reportadas.

 

Tabla 2. Secuencia y relación filogenética de las secuencias de bandas obtenidas de DGGE a partir de muestras leche cruda procedente de vacas Girolando con mastitis clínica y sub clínica

 

Discusión

Las investigaciones pioneras en Venezuela estimaron la prevalencia de mastitis sub clínica cercana a un 60% (Alonso, 1977), atribuida principalmente a pobres condiciones higiénico-sanitarias, considerándose escaso el efecto del sistema y las características del ordeño. El test CMT es una evaluación cualitativa del contaje de células somáticas en la leche, s se emplea como prueba de tamizaje para detección de mastitis sub-clínica debido a su fácil uso y amplia difusión (Dingwell et al, 2003).

En este estudio, la presencia de mastitis sub clínica en la explotación fue reportada en el 48.07% de los cuartos bajo estudio (225 cuartos); representando un valor alto si se compara con valores reportados previamente en Venezuela de 30.18% en trabajos realizados en 6405 vacas lecheras de trece estados, donde además se pudo estimar que la prueba permite la identificación correcta del 69% de los cuartos afectados Ferraro, Scaramelli y Troya, 1999; Farías et al, 2005). Los cuartos perdidos en este rebaño 2.77 % y la mastitis clínica de 0.84%, están por debajo del valor reportado por Ferraro, et al., de 3.99% y 2.69%, aunque es importante destacar que este valor puede ser no real, ya que previamente a la realización del estudio se habían descartado un importante número de animales con mastitis crónica.

Otros estudios recientes realizados empleando CMT, en la zona alta del estado Mérida, con vacas Holstein, Jersey y Pardo Suizo reportan un valor de 36,2%, resaltando la importancia del mismo ya que estos valores de mastitis sub clínica logran la disminución de hasta el 25% de la producción lechera en la explotación con las pérdidas económicas que esto acarrea. (Suniaga, Rojas, Hernández, Caamaño, Urbina y Tovar, 2009).

La importancia de analizar muestras de leches mastíticas con cultivos negativos ha sido estudiada anteriormente. La identificación de los microorganismos responsables del cultivo negativo, permite medir los cambios en las poblaciones bacterianas a lo largo de las infecciones y mejorar la comprensión de la enfermedad a fin, de establecer mejores estrategias preventivas y curativas. El uso de metodologías independientes a cultivo usando el gen del ADNr 16s, han permitido obtener datos importantes de estas comunidades bacterianas (Kuehn, Gorden, Munro, Rong, Dong, Plummer, y Phillips, 2013).

Los filos Firmicutes, Bacteroidetes y Proteobacteria, fueron los reportados en este estudio al igual que otro realizado en Japón con vacas mastiticas (Kuang et al. 2009), coincidiendo ambos en que el grupo de las Proteobacterias fue el más diverso y abundante en número de UTO.

Para el caso de Acinetobacter, en un estudio realizado entre el 2003 y 2008 en un total de 552 vacas lactantes, se logró aislar en un porcentaje de 8.2% tanto Acinetobacter calcoaceitus como A. baumanii, siendo resaltante que los géneros Serratia, Acinetobacter y Enterobacter son organismos multi-resistentes a la mayoría de los antimicrobianos evaluados, incluyendo Cefalosporina Y Ciprofloxacina, Lo Que Se Denomina Multi-Resistencia De Amplio Espectro (Nam, Lim, Kang, Kim, Moon, Jang, y Jung, 2009; Lockhart, Abramson, Beekmann, Gallagher, Riedel, Diekema, y Doern, 2007). Además, algunos de estos microorganismos pueden mantenerse en el tiempo como biofilms dentro del canal del pezón o dentro de los equipos de ordeño, complicando más su tratamiento y prevención (Melchior et al, 2006), lo cual concuerda con cuadros crónicos y resistentes a múltiples terapias antibióticas.

El Lactococcus lactis identificado en la banda V1.1, es considerado un comensal y con la capacidad de producir sustancias antimicrobianas que pueden prevenir la infección causada por bacterias Gram positivas, como los estafilococos. Es interesante que en el caso de esta banda, la intensidad de la banda se asocia a una concentración alta de microorganismos, lo cual coincide con lo que concluye Kuang que puedan estar jugando un rol antagónico (protector) a la infección de estos patógenos (Kuang et al., 2009). Es bien conocido que el Lactobacillus lactis produce bacteriocinas como el Lacticin 3147, que es capaz de inhibir microorganismos como estreptococos y estafilococos (Ryan, Meaney, Ross, y Hill 1998) y se ha empleado en infusión intramamaria para el control de la mastitis bovina (Klostermann, Crispie, Flynn, Ross, Hill y Meaney, 2008).

Tanto Streptococcus suis como S. bovis y los patógenos productores de mastitis S. dysgalactiae y S. uberis, han sido descritos como microorganismos frecuentemente aislados de las tonsilas del ganado vacuno, siendo S. suis el dominante en terneros entre 1 mes y un año, pero infrecuente en becerros menores a un mes de nacidos (Colque et al., 1993) y es considerado un patógeno ambiental, eventualmente asociado a mastitis y capaz de producir biofilms (Olson, Ceri, Morck, Buret y Read, 2002).

Esa bacteria, tanto en la forma libre como en biopelícula, es sensible a drogas beta-lactamicas como (penicilina, ceftiofur, cloxacilina, ampicilina) y oxitetraciclina (Olson et al, 2002). Esto coincide con los días de lactancia (108) de la vaca 5 de donde fue detectada esta UTO y la presencia de S.suis en terneros de edad temprana, donde la leche juega un rol importante en la presencia de la bacteria.

Aeromonas hydrofila, ha sido descrita dentro de los bacilos aeróbicos, Gram negativos ambientales productores de mastitis bovina, generalmente aislada en bajo porcentaje entre y 1 y 6.1% (Watts, 1988; Rea, Cogan, y Tobin,, 1992; NAM,, KIM, LIM, JANG, y Jung, 2010).

Por otra parte, se observaron bandas no identificadas debido a bajos índices de homología, en la banda V5.3 posiblemente esté asociado a co-migración de bandas, lo cual genera la incapacidad de alinear correctamente al existir mezclas de ADN. La secuencia en el árbol se ubica en la rama de los Bacteroidetes, pero debe realizarse una posterior modificación de las condiciones de gradiente y tiempo que permita una mejor resolución (Kuang et al, 2009; Sekiguchi, Tomioka, Nakahara, y Uchiyama, 2001). Otro limitante son las bandas de baja intensidad, ya que al tener poco ADN el proceso de secuenciación se ve limitado y por ende la capacidad de identificación con la secuencia obtenida (Kuang et al, 2009).

 

Conclusiones

Las técnicas de identificación independientes de cultivo, en las últimas décadas se han constituido como poderosas herramientas para identificación de poblaciones microbianas en leche cruda individual o de tanque, permitiendo tener así un conocimiento más claro en patologías de etiología compleja como la mastitis bovina. El estudio de leches con mastitis subclínicas o clínicas y cultivo negativo, tiene disponibles herramientas para identificar los microorganismos responsables que no crecen bajo cultivo convencional, lo cual además nos permite mejorar los sistemas de cultivo para lograr las condiciones necesarias para su crecimiento. En el caso particular del DGGE usando la región V3 del ADNr 16S, permitió identificar claramente, con un poder discriminatorio aceptable, microorganismos asociados a mastitis sub-clínica y clínica negativos a cultivo.

Muchas de las bacterias implicadas en estos procesos como Acinetobacter o Aeromonas, están asociadas a multi-resistencia y formación de biofilms, por lo cual este tipo de estudios puede contribuir a mejorar las maniobras de prevención y los abordajes de tratamientos anti-mastíticos. Hoy día los estudios basados en el ADNr 16S, empleando meta genómica están permitiendo una excelente tipificación de las poblaciones microbianas presentes en leche cruda y derivados lácteos.

 

Agradecimiento

A la colaboración y asesoría prestada por el Laboratorio Genmolab, en las personas de la Lic. Mary Acosta y Lic. Gerson Caraballo, y al Sr R.G.M., por permitir el estudio en su finca.

 

Referencias

ALONSO, FR. (1997). “Prevalencia de mastitis subclínica bovina en la cuenca del lago de Maracaibo I. Porcentaje de prevalecía y caracteres de la infección. Jornadas nacionales Sobre Ganadería de doble Propósito”. Machiques Perija.

DINGWELL, Randy., LESLIE, Ken., SCHUKKEN, Ynten., SARGEANT, Jan y TIMMS, Leo (2003). “Evaluation of the California mastitis test to detect an intramammary infection with a major pathogen in early lactation dairy cows”. The Canadian Veterinary Journal, 44(5), 413.

DMITRIEV, A., BHIDE, M., y MIKULA, I. (2006). “cpn60 gene-based multiplex-PCR assay for simultaneous identification of Streptococcal species”. Acta Veterinaria Brno, 75(2), 235- 240.

FARIAS REYES, José., GARCÍA URDANETA, Aleida., D’POOL, Gerardo., VALERO LEAL, Kutchynskaya., ALLARA, María y ANGELOSANTE, Geovany. (2005). “Detección de mastitis subclínica en bovinos mestizos doble propósito ordeñados en forma manual o mecánica. Comparación de tres pruebas diagnósticas”. Revista Científica, 15(002).

FERRARO, Luciano., SCARAMELLI, Aura., TROYA, Héctor.(1999) “Prevalencia de la mastitis subclínica bovina en Venezuela y evaluación de la prueba de mastitis de California (CMT) como prueba diagnóstica”. Revista Científica. 9, (2), 81-90.

GRABER, H. U., CASEY, M. G., NASKOVA, J., STEINER, A., y SCHAEREN, W. (2007). “Development of a highly sensitive and specific assay to detect Staphylococcus aureus in bovine mastitic milk”. Journal of dairy science, 90(10), 4661-4669.

KUANG, Ying., TANI, Kaori., SYNNOTT, Aidan. J., OHSHIMA, Kazuhito., HIGUCHI, Hidetoshi., NAGAHATA, Hajime y TANJI, Yasunori. (2009). “Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCR– DGGE method”. Biochemical Engineering Journal, 45(1), 76-81.

KUEHN, Joanna., GORDEN, Patrice., MUNRO, Daniel., RONG, Ruichen., DONG, Qunfeng., PLUMMER, Paul y PHILLIPS, Grerory. (2013) “Bacterial community profiling of milk samples as a means to understand culturenegative bovine clinical mastitis”. PloS one, 8(4), e61959.

KLOSTERMANN, Katja., CRISPIE, Fiona., FLYNN, James., ROSS, Paul., HILL, Colin y MEANEY, William. (2008). “Intramammary infusion of a live culture of Lactococcus lactis for treatment of bovine mastitis: comparison with antibiotic treatment in field trials”. Journal of dairy research, 75(03), 365-373.

LOCKHART, Shaun, ABRAMSON, Murray., BEEKMANN, Susan., GALLAGHER, Gale., RIEDEL, Stefan., DIEKEMA, Daniel y DOERN, Gary. (2007). “Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli causing infections in intensive care unit patients in the United States between 1993 and 2004”. Journal of clinical microbiology, 45(10), 3352-3359.

MELCHIOR, M. B., VAARKAMP, H., y FINKGREMMELS, J. (2006). “Biofilms: a role in recurrent mastitis infections? The Veterinary Journal, 171(3), 398-407.

MUYZER, Gerard., DE WAAL, Ellen y UITTERLINDEN, Andre. (1993). Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA”. Applied and environmental microbiology, 59(3), 695-700.

NAM, H. M., LIM, S. K., KANG, H. M., KIM, J. M., MOON, J. S., JANG, K. C., Y JUNG, S. C. (2009). “Prevalence and antimicrobial susceptibility of gram-negative bacteria isolated from bovine mastitis between 2003 and 2008 in Korea”. Journal of dairy science, 92(5), 2020- 2026.

NAM, H. M., KIM, J. M., LIM, S. K., JANG, K. C., y JUNG, S. C. (2010). “Infectious aetiologies of mastitis on Korean dairy farms during 2008”. Research in veterinary science, 88(3), 372-374.

OLSON,Marie., CERI, Howard., MORCK, Douglas., BURET, Andre y READ, Ronald. (2002). “Biofilm bacteria: formation and comparative susceptibility to antibiotics”. Canadian Journal of Veterinary Research, 66(2), 86.

REA, Mary., COGAN, T. M., Y TOBIN, S. (1992). “Incidence of pathogenic bacteria in raw milk in Ireland”. Journal of Applied Bacteriology,73(4), 331-336.

REBHUN,William., GUARD, Chuck y RICHARDS, Carolyn. (1995). Diseases of dairy cattle. Williams and Wilkins.

SCARAMELLI, Aura y GONZÁLEZ, Zuleima. (2005). Epizootiología y diagnóstico de la mastitis bovina. Disponible desde Internet en: http://avpa. ula. ve/docuPDFs/libros_online/ manualganadería/seccion5/articulo 9_s5. pdf (con acceso 20/07/09).[Links].

SOL, J., SAMPIMON, O. C., SNOEP, J. J., y SCHUKKEN, Y. H. (1997). “Factors associated with bacteriological cure during lactation after therapy for subclinical mastitis caused by Staphylococcus aureus”. Journal of dairy science, 80 (11), 2803-2808.

SUNIAGA, José., ROJAS, Golfredo., HERNÁNDEZ, Javier., CAAMAÑO, Janeth., URBINA, Analcelmira y TOVAR, Luis. (2009). “Estudio de prevalencia de mastitis subclínica en la zona alta del estado Mérida”. Universidad de Los Andes (Venezuela). Instituto de Investigaciones Agropecuarias.

WATTS, Jeffrey. L.(1988). “Etiological agents of bovine mastitis. Veterinary microbiology”, 16(1), 41- 66.

 
remove_red_eye 460 forum 0 bar_chart Estadísticas share print
Compartir:
close
Ver todos los comentarios
 
   | 
Copyright © 1999-2019 Engormix - All Rights Reserved