INTRODUCCIÓN
La Leucosis Bovina Enzoótica (LBE) es causada por un virus de la familia Retroviridae, género Deltaretrovirus, el Virus de la Leucosis Viral Bovina (BLV) (Murphy et al., 1999). En Costa Rica, la LBE fue diagnosticada y reportada por primera vez en la Escuela de Medicina Veterinaria en el año de 1976 (González, 1977). Desde entonces, la seroprevalencia del VLVB reportada&en Costa Rica en 20 años no ha variado mucho (Rodríguez et al., 1980; Jiménez et al., 1995; Dolz Moreno, 1999). Un estudio recientemente realizado por Beita (2008) determinó una seroprevalencia de 41% a nivel de animales y del 97,4% a nivel de hatos en ganado lechero especializado.
Los estudios de estimaciones para determinar el impacto de la LBE en la producción han sido inconsistentes. Algunos investigadores determinaron una relación entre infección con el BLV y producción de leche, con disminuciones de un 2,5% a 3,5% (Brenner et al., 1989; Emanuelson et al., 1992; 1998) hasta un 11% en vacas seropositivas, en comparación con animales seronegativos (D’Angelino et al., 1998). En este mismo sentido, Mora (1997) determinó menor producción de leche en vacas seropositivas que en seronegativas al BLV en Costa Rica; sin embargo, la muestra analizada no fue lo suficientemente grande para sustentar estadísticamente el resultado, solamente reflejó una tendencia.
Las pérdidas económicas que se reportan, en vacas infectadas con el BLV, van desde una reducción en la producción de leche, hasta un aumento en los costos de reemplazo e incremento en los gastos veterinarios (Pelzer, 1997; Sargeant et al., 1997; Chi et al., 2002; Ott et al., 2003; Erskine et al., 2012). Además, los productores de animales de cría incurren en pérdidas, debido a restricciones en la exportación de ganado bovino seropositivo (OIE, 2012).
Las pérdidas económicas determinadas en EE.UU por Willar (2006) fueron de $560 millones. Se debió a la baja producción de productos lácteos atribuibles al BLV. También, existen reportes sobre los costos anuales ocasionados por la LBE por rebaño infectado, utilizando, como tamaño promedio, hatos de 50 vacas, determinándose en $806, debido a la disminución en la producción de leche de cada rebaño (Chi et al., 2002). Otra variable afectada por el BLV es el número de animales descartados. Trainin et al. (1996) reportan que existe relación entre la LBE y la tasa de descarte. En sus estudios dieron seguimiento a dos grupos de animales, uno seropositivo y otro seronegativo, por un período de 36 meses; determinaron que, en el grupo de seropositivos, se descartó un 38,65% de animales, mientras que en el grupo de animales seronegativos al BLV solamente un 10,69%. Por otra parte, en este estudio se logró asociar la presencia de Trichophyton verrucosum en el grupo de animales seropositivos, indicando que el BLV podría tener un efecto negativo sobre el sistema inmune.
Finalmente, la mayor pérdida económica, cuantificable, que ocasiona la LBE, es la restricción de venta y exportación de vacas seropositivas a mercados internacionales y el decomiso de vacas con linfosarcomas en mataderos (Radostits, 1999; Rhodes, 2003). Según Ott y colaboradores (2003) una mayor proporción de sacrificio de vacas seropositivas, conlleva a una mayor tasa de condena de animales que presentan tumores.
En contraste, otros estudios no encontraron asociación negativa, e incluso, reportaron una asociación positiva entre el BLV y la producción de leche (Huber et al., 1981; Pollari et al., 1992; van Leeuwen et al., 2000; Tiwari et al., 2005, Tiwari et al. 2007).
Debido a que existe controversia en los resultados obtenidos en los diferentes estudios realizados respecto a si vacas seropositivas al BLV muestran parámetros productivos diferentes a los de animales seronegativos, se realizó el este estudio longitudinal, en el cual se busca determinar la asociación entre el estatus serológico al BLV y la producción láctea en hatos lecheros especializados de Costa Rica.
METODOLOGÍA
2.1 Tipo de estudio y población en estudio
Se realizó un estudio longitudinal y analítico (Argimon, 1991) en un total de 26 fincas: cuatro en San José, cuatro en Heredia, ocho en Cartago y 10 en Alajuela. Todas& poseían registros automatizados mediante el programa VAMPP Bovino (Noordhuizen Buurman, 1984) actualizado al 2009. Un primer muestreo se realizó durante 2006-2007 (Beita, 2008) tomando muestras a todos los animales mayores de seis meses de edad. Luego, en 2009, se realizó el segundo muestreo, en el cual se tomaron muestras de sangre de todas las vacas que habían sido analizadas y habían resultado seronegativas en el 2006-2007. Las vacas que fueron seropositivas en el primer muestreo y aún estaban presentes en las fincas durante el segundo muestreo, no fueron sangradas en este muestreo pues el VLVB ocasiona infecciones persistentes; por ello, se asumió que el estatus de seropositividad se había mantenido desde el 2006-2007.
Para realizar las comparaciones de parámetros productivos entre las diferentes categorías de vacas (seropositivas, seronegativas y seroconvertidas), el tamaño de muestra por grupo se calculó usando la fórmula para diferencia de promedios, asumiendo una media de producción de 5500,0 kg 305-d de leche/vaca/lactancia& con una desviación estándar esperada de 1730,0 kg 305-d de leche (Vargas Gamboa, 2008), y una disminución de un 11% de leche para el grupo de seropositivas (D’Angelino et al., 1998), nivel de confianza del 95% y una potencia del 80%, en dos vías. Esto arrojó una muestra por analizar de 136 vacas por grupo; no obstante, en este estudio se analizó un total de 1719 vacas, 999 se mantuvieron seronegativas durante el estudio, 152 seroconvirtieron entre el primer y segundo muestreo, y 568 fueron seropositivas en ambos muestreos (Se asumió que las vacas que resultaron seropositivas al primer muestreo, presentes aún en el segundo, mantenían su condición de positivas a la infección).
2.2 Toma de muestras sanguíneas
Se tomó una muestra de sangre a las vacas seleccionadas mediante punción de la vena coccígea media utilizando Vacutainer®. Las muestras se trasladaron al laboratorio en hieleras a temperatura cercana a 4–7°C. En el laboratorio se separó el suero mediante centrifugación a 10 000 g por 10 minutos, y se almacenó a -20°C hasta su análisis.
2.3 Análisis serológico
Para determinar seropositividad al VLVB, se realizó una prueba inmunoenzimática (ELISA) indirecta comercial (SVANOVA®), que reporta un 100% de sensibilidad y un 99,7% de especificidad (Portetelle et al., 1989; Monti et al., 2005; Svanova, 2009), siguiendo el protocolo recomendado por la compañía SVANOVA®.
Se añadió 100 µl de tampón de dilución a cada pozo cubierto con antígeno BLV; seguidamente, se agregó 4 µl de suero de la muestra por analizar, suero control positivo (por duplicado) y suero control negativo (por duplicado), se agitó la placa y se incubó 1 hora a 37°C. Posteriormente, se lavó tres veces con tampón de lavado, se le añadieron 100 µl de conjugado (anti IgG bovina-peroxidasa) a cada pozo y se volvió a incubar por 1 hora a 37°C. Se lavó de nuevo tres veces y se agregó sustrato (tetrametilbenzidine) a cada pozo; se incubó una última vez a temperatura ambiente por 10 minutos. Finalmente, la reacción se detuvo con 50 µl de solución de frenado (ácido sulfúrico) y se determinó la densidad óptica (DO) a 450 nm. Se consideró válido el ensayo cuando el control positivo mostró una DO mayor a 1,0 y el suero control negativo arrojó un porcentaje de positividad (PP) menor o igual a 15%. Sueros analizados que arrojaron un PP mayor o igual a 20% se consideraron positivos al BLV. El porcentaje de positividad (PP) se calculó con la siguiente fórmula:
2.4 Definición de las variables
Estatus serológico: Variable categórica dicotómica. Condición inmunológica, caracterizada por la presencia o ausencia de anticuerpos específicos en la sangre; en este caso, contra el BLV. Una vaca se consideró negativa cuando el suero analizado arrojó un PP< 20% durante los dos muestreos; positiva cuando el suero analizado arrojó un PP≥ 20% durante los dos muestreos.
Seroconversión: Variable dicotómica. Condición inmunológica, caracterizada por la aparición de anticuerpos (PP≥ a 20%) en una segunda muestra luego de una primera con resultado negativo (PP< de 20%).
Producción de leche corregida a los 305 días (kg 305-d): Variable numérica continua. Es la cantidad de leche producida, medida en kilogramos, corregida por los efectos fijos&de hato, número de lactancia, época de parto y días abiertos, a los 305 días de lactancia (Vargas Solano, 1995).
Raza: Variable categórica. Indica el grado de pureza racial de los animales. Los grupos de razas fueron: Holstein (≥ 6/8 Holstein), Jersey (≥ 6/8 Jersey), Chumecas (4/8 Holstein + 4/8 Jersey; 5/8 Jersey + 3/8 Holstein, 3/8 Jersey + 5/8 Holstein), Guernsey (≥ 6/8 Guernsey) y un último grupo, en el cual se aglomeraron todas las otras vacas que no fuesen de las razas ya mencionadas; a este grupo se denominó como “Otras”.
Lactancia: Variable categórica ordinal. Se refiere al número de lactancia de vaca. Se formaron tres grupos por número de lactancia: 1 y 2, 3 a 5 y ≥6 lactancias.
2.5 Análisis Estadístico
Del programa VAMPP Bovino se extrajo, para los animales seleccionados, su raza y los datos de producción de leche corregida a los 305 días (kg 305-d), para cada lactancia en el período de estudio.
El efecto del estatus serológico, sobre kg 305- d, se hizo en dos fases. En la primera, se comparó la kg 305-d según el estatus serológico por raza, así como por número de lactancia mediante la prueba de Kruskal-Wallis, utilizando el programa estadístico Infostat®. Se consideró significativo un valor de P <0,05. En una segunda fase, se realizó un modelo de regresión lineal mixto, siendo la variable compuesta hato-año de sangrado la que ofrece el efecto aleatorio, mientras que las variables de estatus serológico, raza y número de lactancia, los efectos fijos. Este análisis se realizó con el programa SAS/STAT ver. 9.2.
Adicionalmente, se calculó el riesgo de que una vaca seropositiva estuviera en el nivel de baja producción, por medio de la razón de posibilidades (OR, por su nombre en inglés Odds Radio) mediante regresión logística con efectos aleatorios, siendo la variable finca la que confiere la condición de aleatoriedad. La variables de kg305-d se dicotomizó (producción alta y baja) tomando la mediana como punto de corte, de forma específica dentro de cada raza. La producción en kg 305-d fue la variables dependiente; el estatus serológico y el número de lactancia, las variables independientes. La significancia del modelo se analizó mediante el valor de la devianza, y de cada variable por medio de los intervalos de confianza al 95%. El análisis se realizó en programa epidemiológico Egret 2.0.
Factores tales como la ocurrencia de (endo)metritis, renqueras, mastitis u otras enfermedades en los animales en estudio, que pudieron confundir el efecto del estatus serológico sobre la producción de leche, no fueron tomados en cuenta; dada la ausencia de estos datos en la mayoría de las fincas. Ante tal situación, se asume que los casos de enfermedad se distribuyeron de manera aleatoria y homogénea entre las tres categorías de estatus serológico.
RESULTADOS
3.1 Efecto del estatus serológico al BLV sobre la producción corregida a 305 días (kg 305-d)
La comparación general de kg 305-d, entre los diferentes grupos, estableció que vacas seroconvertidas y seropositivas produjeron -12,94% y -4,44% respecto a las seronegativas; siendo, únicamente, significativa la diferencia en las seropositivas (Cuadro 1).
Al medir el efecto combinado del estatus serológico al BLV y el número de lactancia sobre kg 305-d, se comprobó un efecto negativo en el grupo de vacas seroconvertidas de 1-2 lactancias, así como en las seropositivas de 3-5 lactancias (P< 0,01). No hubo efecto significativo en el grupo de vacas seropositivas ≥ 6 lactancias (Cuadro 2).
Asimismo, al establecer el efecto combinado del estatus serológico al VLVB con la raza, sobre kg 305-d en las razas Holstein y Jersey (P< 0,0001), no hubo efecto significativo en Chumecas, Guernsey ni en el grupo Otras, aunque se determinó una tendencia a producir más leche en las seronegativas, en comparación con las seropositivas y seroconvertidas (Cuadro 3). El porcentaje de diferencia en kg 305-d entre las vacas seroconvertidas y seropositivas, respecto a las seronegativas, de diferentes razas, osciló de +0,01% a -16,10% (Cuadro 3).
Cuando se corrige el efecto del estatus serológico sobre kg 305-d por las variables de hato, año de muestreo, raza y número de lactancia, se observa el efecto significativo de las variables con efectos fijos (P < 0.0001) . Así, las vacas seroconvertidas y las siempre seropositivas produjeron, respectivamente, -243,71 y -95,71 kg-305 d comparadas con las siempre seronegativas (Cuadro 4).
3.3. Riesgo de baja producción según: estatus serológico, raza y número de lactancia
El análisis de las razones de posibilidades de baja producción, corregido por raza y número de lactancia, estableció que animales de los grupos de seroconvertidos (OR= 2,84; IC 95%: 1,95-3,41) y seropositivos (OR= 2,12; IC 95%: 1,71-2,63) mostraron un mayor riesgo de producir menos kg-305 d que animales seronegativos. Igualmente, se observó que las vacas de primera y segunda lactancia tuvieron mayor chance de producir menor cantidad de leche que las de tres o más lactancias (Cuadro 5).
DISCUSIÓN
En el este estudio se reporta, por primera vez en Latinoamérica, los resultados de una investigación longitudinal realizada en hatos lecheros especializados, para determinar el efecto del estatus serológico de bovinos al BLV sobre la producción de leche en vacas en diferentes lactancias y razas. El hallazgo, de que vacas seropositivas y seroconvertidas al BLV producen menos leche que animales seronegativos, concuerda con lo reportado por otros autores (Brenner et al., 1989; Emanuelson et al., 1992; Mora, 1997; D’Angelino et al., 1998; Ott et al., 2003). En contraste, otros autores han reportado que el BLV no tiene ningún efecto sobre la producción de leche, al no encontrar asociación alguna entre la enfermedad y disminución de los parámetros productivos (Huber et al., 1981; Pollari et al., 1992; van Leeuwen et al., 2000; Tiwari et al., 2007).
Los animales que seroconvirtieron, mostraron mayor diferencia negativa en la producción de leche. Esto podría ser una consecuencia de una alteración del sistema inmunológico ocasionada por el BLV, como lo han propuesto varios autores (Stott et al., 1991; Ballagi-Pordani et al., 1992; Schwartz et al., 1994; Trainin et al., 1996; Tiwari et al., 2007), con un efecto negativo mayor en animales que han sufrido la infección en un período reciente. Esta condición de mayor susceptibilidad inmunológica, deja al animal en desventaja ante otras infecciones concomitantes que pueden afectar su condición general; afectando, de manera directa, su producción al reducir el consumo de alimento y agua; o, inclusive, por incremento en la posibilidad de infecciones de la glándula mamaria, sean clínicas o subclínicas. Desafortunadamente, esa posibilidad no pudo ser comprobada en este estudio por la ausencia de estos datos.
Una posibilidad, la cual debe ser confirmada con estudios de seguimiento más intensivos, es que los animales recién infectados por el BLV podrían estar sufriendo una inmunosupresión más severa, por lo cual, su producción se ve más afectada en la lactancia concurrente que en los animales seropositivos; pues estos ya llevan más tiempo con esa condición, o el efecto inicial de la inmunosupresión haya sido compensado, o que permanezca el efecto de inmunosupresión, pero menos fuerte.
Johnson & Kaneene (1991) y Beita (2008), reportan que la frecuencia de infección con el BLV aumenta, en forma significativa, en el momento que los animales ingresan al hato en producción, dado que son sometidos a un manejo más intensivo, lo cual conlleva a un riesgo de infección y alteración del sistema inmunológico. Esto explica, al menos en parte, el efecto significativo –negativo- en el grupo de vacas seroconvertidas con una y dos lactancias sobre la producción de leche, y el riesgo de menor kg 305-d. También, en el grupo de vacas seropositivas con tres a cinco lactancias, se estableció un efecto negativo –significativo- y riesgo de producir menos leche; lo cual indica que el efecto negativo se puede observar en cualquier lactancia. Sin embargo, en animales con seis o más lactancias, tales diferencias no fueron tan importantes. Esto puede explicarse por el hecho de que quizás los animales, que han llegado a esta edad en el hato, se han mantenido en él precisamente por su habilidad productiva; de hecho se podría tratar de individuos superiores en los hatos.
Finalmente, en todas las razas analizadas se encontró menor producción absoluta y riesgo de producir menos leche en vacas seropositivas y seroconvertidas que en vacas seronegativas; resultando estadísticamente significativa en las razas Holstein y Jersey. La ausencia de significancia estadística en las diferencias en las demás razas, es más bien atribuible al pequeño número de animales analizado por grupo, lo que introduce alta variación intragrupo. A pesar del escaso número de animales analizados, la tendencia a la diferencia entre estratos es constante. Tanto en Holstein como en Jersey, diversos estudios reportan diferencias significativas en la producción (Brenner et al., 1989; Emanuelson et al ., 1992; D’Angelino et al., 1998).
Aunque durante muchos años se ha discutido y cuestionado el efecto de mantener animales seropositivos al BLV en un hato, este trabajo aporta evidencia importante de que, al menos en las condiciones de los hatos analizados, el virus ocasiona pérdidas significativas por disminución de la producción de leche, tomando en cuenta las limitaciones de la ausencia del control estricto del efecto de variables importantes que pueden afectar la producción láctea, como enfermedades durante la lactancia –por ausencia de información-.
Dado que las razas Holstein y Jersey son las principales razas lecheras de Costa Rica, y los resultados muestran el efecto del BLV sobre la producción de leche en estas razas, es importante implementar y mantener estrategias integradas de control o eliminación del BLV en los hatos lecheros, dentro de plazos razonables, según el nivel de prevalencia y el grado de afectación sobre la producción específicos en el hato.
