Diseño de iniciadores especie específico para la detección de Brucella Abortus por PCR punto final

La brucelosis es una enfermedad de distribución mundial, siendo un gran problema sanitario y económico para la ganadería de nuestro país. Son distintas las especies animales susceptibles a este patógeno, lo que complica las acciones de erradicación y control de esta enfermedad. Brucella abortus es la especie que afecta a la ganadería bovina, siendo un patógeno intracelular Gram negativo, que se replica dentro de un compartimiento delimitado por la membrana (Pizarro-Cerdá et al.¸1998).

La brucelosis en México ha provocado numerosas pérdidas económicas asociadas a bajas producciones dentro de la ganadería bovina, impactando negativamente la salud pública, principalmente de los trabajadores de los ranchos con problemas de alta incidencia de la enfermedad. La principal limitante de esta enfermedad es el diagnóstico certero, debido principalmente a que los síntomas característicos que definen con precisión esta enfermedad son mínimos en las primeras etapas de la enfermedad, bajo este esquema a nivel mundial se han desarrollado múltiples investigaciones por diversas instituciones para desarrollar un método de diagnóstico rápido, sensible y específico, y de esta manera contribuir con un tratamiento adecuado y oportuno (Martínez-Vázquez et al., 2000).

En la actualidad se requieren de métodos de diagnóstico con mayor precisión con los que se puedan enfrentar los planes de prevención y control de este tipo de enfermedades bacterianas altamente contagiosas, que afectan la reproducción y producción ganadera a nivel mundial. Los métodos moleculares ofrecen la ventaja de tener mayor sensibilidad y un menor tiempo para general los resultados, comparado con los métodos tradicionales (Pérez et al., 2009).

Para el desarrollo de un diagnóstico oportuno se ha utilizado la técnica de aislamiento del agente causal de la brucelosis bovina, esta técnica es tardada, laboriosa y la sensibilidad es muy variable, obteniéndose aislamientos del microorganismo en un 20 y 25%. El diagnostico serológico de esta enfermedad es uno de los más utilizado, pero no permite detectar individuos con infecciones primarias, con lo anterior se nota claro que no existe una prueba única en nuestro país que garantice el diagnóstico de esta enfermedad en bovinos (MartínezVázquez et al., 2000).

Otras técnicas utilizadas en el diagnóstico de la brucelosis bovina son la Rosa de Bengala (RB), fijación de complemento (FC), seroaglutinacion estándar (SAE) y la prueba de ELISA. En los últimos años se han desarrollado técnicas de biología molecular basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que permiten de manera rápida, sensible y especifica detectar en muestras clínicas el patógeno, esta prueba se convierte en la técnica de mayor innovación, con facilidad de realizarse, ofreciendo resultados con mayor rapidez y precisión, siendo una alternativa de diagnóstico más confiable (Sánchez-Jiménez y Cardona-Castro 2013).

Diseñar iniciadores específicos para la detección molecular por PCR de Brucella abortus.

Validar el desempeño de los iniciadores en la detección de Brucella abortus.

Diseño de iniciadores: con la finalidad de establecer los blancos moleculares más empleados en la detección de Brucella abortus se realizó una revisión de literatura dentro de la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) y se seleccionó el gen de la proteína VirB3el sistema se secreción tipo IV y el gen wbkA que codifica para una glucosiltransferaza requerida para la biosíntesis de la cadena O del lipopolisacarido.

Se construyó una minería de secuencias de referencia en formato fasta tomada de la base de datos del GenBank con los números de acceso CP023309, CP023214, CP007788, CP002932, CP000709, CP008756, CP019346, CP006897 para el gen virB3 y CP008774, CP016981, CP001578, CP017012, CP000708, CP022875, CP023239, CP007743, CP023974, CP023213 para el gen wbkA, las secuencias en formato fasta se sometieron a alineamiento por medio del software MEGA y la plataforma electrónica BLAST, esto permite asegurar que las secuencias sean similares y poder cuantificar su similitud. Los alineamientos generados fueron enviados a T4Oligo (Irapuato, México), para realizar la síntesis de oligos específicos para PCR y generar los primers o iniciadores de cada gen seleccionado.

Cultivo de cepa: se adquirió la cepa de Brucella abortus 99S, se cultivó en medio TSA Brucella el cual contiene 40 gr/Lt. de medio TSA, extracto de levadura 5 gr/Lt. y 2 gr/Lt. de extracto de carne, se homogenizaron los ingredientes y se esterilizo en autoclave a 121°C por 15 minutos, el medio se depositó en cajas de Petri, solidificado el medio se sembró la bacteria y se incubo a 37°C por 48 horas.

Extracción de DNA: para obtener DNA de referencia se recuperaron 250 mg de biomasa del cultivo sólido sembrado con B. abortus, con esta cantidad de muestra recuperada se extrajo DNA con el kit comercial QUICK-DNA fecal/soil Microbe Miniprep (Zymo-Research), siguiendo las recomendaciones y pasos del fabricante. La concentración y ´pureza del DNA se midió con el equipo de espectrofotometría NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).

Reacción de PCR: Las condiciones del ensayo de PCR para Brucella abortus se estandarizó utilizando los iniciadores VirB3 Fw 5´-CGAGCAGGCGGAACATCTGA3´/Rv 5´- GGCGGCAGCATCGTTCTCTT-3´ y para el gen wbkA fueron Fw 5´- GCCACGGGTGCAGTTATCCT-3´/Rv 5´-GGGCAGGTCCCCAGAAAACA-3´, que amplifican un fragmento de 121 y 146 pares de bases (bp), respectivamente. La reacción se realizó con un volumen final de 25 µL, conteniendo: 1X de buffer, 400 µM de dNTP´s, 2.5 µM de MgCl2, 20 µM de cada iniciador ,1.5 U de Taq y 100 ng de DNA. Para la reacción de PCR se utilizó un termociclador SelectCyclerBioproducts, USA, el cual para establecer la temperatura de amplificación más adecuada se programó con gradientes de temperaturas consistiendo en 1 ciclo de desnaturalización inicial a 94°C por 5 minutos, seguido por 30 ciclos de una desnaturalización a 94°C por un minuto, un alineamiento en gradiente que fue de los 62° a los 71°C por un minuto, una extensión a 72°C durante un minuto, para terminar con una extensión final a 72°C por 5 minutos.

Análisis del producto amplificado: se realizó una electroforesis a 90V por 45 minutos, para esto fue necesario realizar un gel de agarosa al 1.5% con sybr safe DNA gel stain. Las bandas se visualizaron en un fotodocumentador (Gel Logic 112).

La cantidad de DNA extraído proveyó una concentración de 193 ng/ µL y una pureza de 1.9 a una relación de absorbancias 260/280, resultados aceptables para poder ser utilizado el DNA en las pruebas de PCR.

Estandarizada la metodología de PCR, se observaron las bandas amplificadas de los pares de bases establecidos de los fragmentos de los genes seleccionados de Brucella abortus: wbkA y virB3. En la Figura 1, se observa que las bandas tuvieron la talla esperada de 146 y 121 bp, y tuvieron mayor intensidad cuando la temperatura de alineamiento fue de 64°C (Figura 1, carril 4 y 5).

Los resultados del límite de detección de DNA por PCR punto final se muestran en la fig. 2, la cual nos indica que la cantidad mínima de DNA detectada durante la PCR es de 3.86 ng. ya que en la reacción con DNA diluido 1:50 el cual fue colocado en el carril 10 y 11, se pudo observar la amplificación de bandas a 146 y 121 bp, correspondientes al fragmento seleccionado de los gen wbkA y virB3, respectivamente. No obstante, en los carriles 12 y 13 ya no se logró detectar la visualización de bandas, debido a que la cantidad de DNA utilizado no fue suficiente.

Los primers diseñados para el diagnóstico de Brucella abortus fueron funcionales en esta primera etapa de estandarización de la técnica de PCR punto final, se logró establecer la cantidad mínima de DNA requerida para el funcionamiento de la prueba, logrando amplificar los fragmentos esperados de los genes seleccionados. Para que esta técnica se recomiende en un fututo como prueba diagnóstica para este patógeno es necesario seguir evaluando el funcionamiento de los primers bajo otras condiciones de trabajo incluso para ser utilizados en pruebas rápidas y de mayor sensibilidad como la PCR en tiempo real.