Validación del sistema PCR punto final para determinar Mycobacterium avium sbps. paratuberculosis a partir de muestras no invasivas en ganado bovino lechero.

Publicado el: 21/1/2019
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Resumen

Existe una condición crónico- degenerativa en rumiantes principalmente, cuya manifestación clínica es en etapas muy avanzadas de la enfermedad y se conoce como paratuberculosis o enfermedad de Johne’s. Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (PTb) es un patógeno obligado, que presenta una capa lipídica que lo hace resistente a condiciones adversas ambientales, químicos y altas temperaturas. Sin ser concluyente se le ha relacionado con la enfermedad de Crohn con el loci predisponente en el genoma humano (Manning 2010). La importancia de la detección de este microorganismo radica en la complejidad de su diagnóstico en etapas tempranas (1 y 2), antes que el patógeno se distribuya en el ambiente y contamine animales susceptibles. El objetivo del trabajo fue la validación molecular diagnóstica que permita identificar a los animales que eliminan PTb en leche en etapas tempranas de la enfermedad. De un establo de 800 vacas, se analizaron 85 sueros de vaca con la prueba de ELISA como tamizaje, se repitió la prueba de las mismas por ELISA identificándose como seropositivas, 12 vacas positivas y 1 sospechosa (0.635 DO). El testigo negativo fue leche en polvo. Se muestrearon leche, excretas y sangre de estas vacas para analizarlos por quintuplicado por PCR con una secuencia altamente específica, ISMav2 (209 pb). La sensibilidad de la prueba se incrementó mediante la extracción de ADN para organismos ácido-resistentes, disminuyéndose los inhibidores de PCR (da Silva, 1999). Se corroboraron los resultados de ELISA determinándose como positivas a PCR en excretas y/o leche, y la vaca sospechosa salió como positiva, demostrando 100 % sensible y 98.6 % específica. Lo que sigue es identificar animales negativos a ELISA con niveles de 0.600 de densidad óptica (sospechosos) para poder incrementar la detección de PTb en etapa 2.

1. INTRODUCCIÓN

Descripción del Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis.

La familia Mycobacteriaceae posee especies de lento y rápido crecimiento. Entre las especies de lento crecimiento se encuentra la patogénica Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae y Mycobacterium avium con sus subespecies. M. avium subs.  paratuberculosis (PTb) es una bacteria acido- alcohol resistente de forma bacilar que posee una pared celular gruesa rica en lípidos, esta propiedad le confiere resistencia a la decoloración por ácido alcohol usado en tinción con fucsina. La membrana rica en lípidos le concede a las micobacterias una ventaja de supervivencia e incrementa su resistencia a químicos y a procesos físicos, consecuentemente presenta un lento crecimiento debido a la  absorción limitada de nutrientes. En cultivos en medio sólido, la formación de colonias puede tardar desde 5 semanas hasta 6 meses bajo condiciones de enriquecimiento especiales (OIE, 2009; Fecteau and Withlock, 2010).

Importancia epidemiológica de Ptb

PTb es un patógeno de distribución mundial, con la excepción deNoruega y Suecia que reportan ser libres (Manning, 2010). Es causante de la enfermedad de Johne’s en rumiantes, con una manifestación crónico degenerativa de prepatencia prolongada. La presentan otras especies animales como: conejos, zorros, ratones, caballos, cerdos, perros y primates que pueden mantener al bacilo circulante. La sero-prevalencia de PTB en poblaciones bovinas en EUA es de 33 % del ganado lechero; en México se calcula entre un 10.71 y 31.3 %, en estudios serológicos y moleculares realizados en Guanajuato, San Luis Potosí y Aguascalientes (Dorshorst et al, 2006; Martínez et al, 2012).

Los becerros se infectan de PTb en etapas tempranas por la ingesta de leche y calostro contaminado, y por contaminación ambiental (vía fecal-oral) (Ansari-Lari et al., 2009). Los factores de riesgo para la transmisión del patógeno es 87.3 veces más en calostro proveniente de vacas serológicamente positivas (Dieguez, 2008). El desarrollo de signos clínicos de la enfermedad puede llevar entre 2 y 5 años. Se describen cuatro etapas de presentación de la enfermedad, la primera es posterior a la invasión de la mucosa intestinal que en cuestión de horas llega a los linfonódulos regionales, manteniéndose ahí por un periodo de 2 a 4 años; posteriormente invade órganos como hígado y bazo, hasta que el ganado clínicamente afectado elimina el patógeno en excretas en cantidades de 106 a las 108 de UFC/g (Tiwari et al, 2006; Wu et al, 2007). La presentación clínica incluye pérdida de peso, diarrea crónica persistente, emaciación y retraso en el desarrollo.

Paratuberculosis es una de las enfermedades más costosas para la industria del ganado lechero, las pérdidas económicas estimadas en Estados Unidos son aproximadamente de 200 a 250 millones de dólares por año. El diagnóstico se realiza por cultivo, serología, signología clínica y patología. Las pruebas de ELISA, son las pruebas serológicas más usadas para identificar animales infectados con PTb que tengan una respuesta inmunológica humoral y el ensayo de Interferón-γ identifica aquellos en los que la infección se ha diseminado (Charavaryamath et al., 2013). La sensibilidad de la prueba ELISA en suero de animales es del 7% en la primera etapa de la enfermedad, 15% en etapas subclínicas y presenta una variación de entre el 85% y el 98% en la etapa clínica (Gilardoni et al., 2012). Aun cuando el resultado de ELISA es positivo, se ha implementado una segunda prueba para confirmación diagnóstica por un método que resulte más certero como el diagnóstico por PCR, esto con el fin de evitar la presencia de falsos positivos, controlar la diseminación del microorganismo y evitar el sacrificio de animales sanos.

PTb es un organismo que puede sobrevivir en diversas condiciones y su persistencia en el ambiente y en los productos lácteos puede ser una fuente de infección para los seres humanos, ya que se cree de la existencia de una posible relación con la enfermedad de Crohn, tema que presenta cierta controversia (Charavaryamath et al., 2013). La enfermedad de Crohn es una enfermedad inflamatoria crónica del intestino con etiología desconocida que generalmente afecta a pacientes jóvenes de entre 15 y 25 años. Ambas enfermedades comparten la presentación  de diarrea crónica y pérdida de peso crónica, en lo que se refiere a patología ambas producen inflamación granulomatosa en el íleon, no obstante, también se presentan diferencias considerables como que las bacterias ácido- alcohol resistentes no logran ser visibles en secciones del intestino en pacientes con enfermedad de Crohn, mientras que si son visibles en el intestino de bovinos afectados por la enfermedad de Johne. Por otro lado se sabe que hay una mutación específica en la región pericentromérica del cromosoma 16 (IBD1), que favorece la presentación en humanos (Ogura, 2001). Lo que indica que se requiere de un componente genético para el desarrollo de Crohn.

El cultivo bacteriano de Ptb es la prueba de oro para la identificación del patógeno, no obstante es un proceso muy lento como para dar una respuesta oportuna, es entonces que PCR se vuelve la alternativa para toma de decisión. La prueba de ELISA debe ser repetida dos veces para eliminar el mayor número de falsos positivos dado que detecta también reacciones inmunológicas de micobacterias ambientales (Osterstock, 2007). Los sistemas de extracción de ADN para Mycobacterium spp., deben considerar la eliminación de inhibidores cuando las muestras provienes de heces o leche, puesto que presentan iones de calcio y proteinasas que pueden evitar la amplificación del ADN (Rådström et al., 2004). Por otro lado, se requiere identificar un sistema específico que no tenga reacciones cruzadas con otras micobacterias. Uno de ellos es el ISMav2, que presenta 3 copias en el genoma de PTb, mientras que el tradicional IS900 presenta de 14 a 18 copias, lo que baja la sensibilidad de este último (Shin et al, 2004). 


3. PARTE EXPERIMENTAL

Sitio geográfico. De un hato lechero de 800 vacas en Atitalaquia, Hidalgo, se tomó una muestra de vacas lecheras con más de 2 años de edad.

Selección de las muestras. Se analizaron 85 sueros de vaca, de más de dos partos y que estuvieran en el primer tercio de la lactación. Se obtuvieron sueros sanguíneos analizándose con la prueba de ELISA como tamizaje, repitiéndose la prueba en las muestras serológicas por ELISA nuevamente. Se descartaron las vacas negativas en las dos pruebas, y se identificaron a las vacas 12 seropositivas y una sospechosas a una densidad óptica (OD) de 0.635.

Muestreo. De los animales positivos y sospechoso, se colectó 40 ml de leche en total de los cuatro cuartos de la glándula mamaria, conservándose a -18 °C hasta su procesamiento. Se colectaron excretas de estas mismas vacas para hacer un diagnóstico comparativo. El testigo negativo fue leche en polvo, y excretas de un hato libre de paratuberculosis clínica en los últimos 15 años. Todas las muestras se codificaron para hacer una prueba doblemente ciega y evitar sesgos en el laboratorio. 

Pruebas de laboratorio. Se realizaron pruebas moleculares de 3 a 5 veces con la variante de purificación de ADN y no para realizar la amplificación por PCR. El sistema de extracción de ADN se hizo con la técnica de da Silva, 1999, para protozoarios ácido-resistentes. La amplificación se realizó utilizando el sitio específico conocido como IsMav2, dada la especificidad del mismo. Se identificó la amplificación al detectar un fragmento de 209 pb en las muestras positivas (Figura 1).

 

 

Resultados

En el caso de 90% de las muestras fecales si hubo amplificación, sin necesidad de purificación del ADN, no así de las muestras de leche. Se corroboraron los resultados de ELISA determinándose como positivas a PCR en excretas y/o leche, y la vaca sospechosa salió como positiva, demostrando 100 % sensiblilidad y 98.6 % específicidad.

Lo que sigue es identificar animales negativos a ELISA con niveles de 0.600 de densidad óptica (sospechosos) para poder incrementar la detección de PTb en etapa 2.

 

4. CONCLUSIONES

En el caso de la leche, en una gran mayoría de artículos no se habla de una purificación en el proceso como un paso esencial, sin embargo, recientemente se ha encontrado que la leche presenta inhibidores tales como iones de calcio y proteinasas por lo que la amplificación de ADN puede ser negativa, habiendo material genético de la bacteria en la mezcla. Este artículo presenta la opción de una técnica perfeccionada para leche tomando en cuenta estos resultados y resaltando la importancia de la purificación no solamente para excretas, sino también para leche (Rådström et al., 2004).

Finalmente el diseño experimental de este diagnóstico integral incluye un proceso de tamizaje cuyo objetivo principal es evitar costos innecesarios en ejecución de PCR, ya que al elegir de manera certera aquellos animales candidatos a través de pruebas de ELISA, los costos de llevar muestras negativas hasta PCR se ve directamente
reducido, optimizando el diagnóstico final evitando continuar procesando muestras de animales negativos.

Es importante resaltar que aunque esta metodología si bien busca aumentar la rentabilidad de este tipo de diagnóstico, no puede eliminar por completo el paso de muestras negativas a través del proceso, ya que incluso siendo negativas al microorganismo, esto no es una garantía de que estén libres del mismo, debido a que factores como la de progresión de la enfermedad, asimismo si el microorganismo está siendo o no excretado en ese preciso momento y la cantidad, por mencionar algunos, son determinantes al final del proceso.

 Capítulo del libro módulo Jean Monnet de marzo de 2018 de la Ciudad de México. 

Referencias bibliográficas

 
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