Identificación de G tipos de rotavirus bovinos y porcinos encontrados en granjas porcinas y bovinas del Río Cuarto de Grecia

Rotavirus bovino y porcino son la causa más frecuente de gastroenteritis. Varios tipos han sido identificados basados en dos proteínas de superficie VP4 (P-tipo) y VP7 (G-tipo). Sin embargo, estudios limitados han sido realizados en países tropicales como Costa Rica y otros de Centroamérica en identificar las cepas predominantes en porcinos y bovinos, debido probablemente a la disponibilidad de métodos apropiados. En este estudio se describe un método Reverso Transcriptasa-Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT-PCR) para la tipificación de G-tipos para rotavirus porcinos y bovinos. Este método permitió identificar G-tipos de aislados colectados en granjas porcinas y bovinas del Río Cuarto de Grecia. Dentro de estos aislados se logró identificar G5 y G6 en lechones y terneros, respectivamente. Este estudio demostró que un método RT-PCR typing, es apropiado para estudios de la epidemiología molecular y que puede haber mayor diversidad entre rotavirus porcino y bovino que la previamente reportada. Palabras claves: Rotavirus porcino, Rotavirus Bovino, Diarrea, RT-PCR.


Introducción

Los rotavirus grupo A son una de las principales causas de enfermedades diarreicas en niños y animales jóvenes de todo el mundo (Paul et al. 1992; Saif et al. 1994; Kapikian et al. 1996). En granjas porcinas y bovinas las infecciones por rotavirus usualmente ocurren como afectación enzoótica afectando a más del 60% de la población de lechones y terneros (Paul et al. 1992; Saif et al. 1994). La mayoría de las infecciones naturales con rotavirus son subclínicas o están asociadas a diarreas moderadas. Sin embargo, muchas infecciones están asociadas con gastroenteritis moderada o severa (Woode, 1986; Paul et al. 1992).

Los rotavirus son clasificados dentro de la familia Reoviridae y son caracterizados por la presencia de una triple cápside viral y el genoma viral está compuesto por 11 segmentos de ARN doble cadena (Mattion et al. 1994). Basados en la especificidad de la VP6 localizada en la cápside interna del virus, los rotavirus pueden ser clasificados dentro de siete serogrupos distintos, denominados A, B, C, D, E, F y G. Las dos proteínas de superficie externa, VP4 y VP7, son responsables para activar anticuerpos de neutralización contra el virus. Un sistema binario es usado para clasificar los rotavirus del grupo A basados en la VP4 (P-tipos) y VP7 (G-tipos) específicamente (Estes et al. 1989). Estudios limitados han sido realizados sobre la prevalencia y distribución de serotipos de rotavirus porcinos y bovinos. En la actualidad las cepas que pertenece al grupo A de rotavirus porcino corresponden al serotipo G son 1, 3, 4, 5, 9, 10 y 11 (Bohl et al. 1984; Nagesha et al. 1988; Ciarlet et al. 1994; Pongsuwanna et al. 1996; Rach et al. 2000) han sido detectados. Dentro de los RV grupo A que circulan en bovinos se han reportado los G-tipos: G1, G2, G3, G6, G8, G10 y G11 (Gouvea et al. 1994; Falcone et al. 1999). Este estudio reporta el desarrollo de un método multiplex RT-PCR para tipificar P y G tipos y obtener un mejor conocimiento de la epidemiología molecular de rotavirus en porcinos y bovinos.


Material y Método

El estudio se realizó en una colección de 11 muestras en lechones a una edad aproximada de 1 día a 1 mes de vida, y 8 muestras de terneros de 1 día a 6 meses de edad, para un total de 19 muestras tomadas de granjas porcinas y bovinas del Río Cuarto de Grecia con presencia de diarrea. Las muestras fueron analizadas por la prueba Inmunoenzimática ligada a una enzima (ELISA) dirigido contra la proteína VP7, para rotavirus grupo A, empleando el ensayo IDEIA de Dako. Este kit comercial, utiliza un anticuerpo policlonal en un enzimoinmunoensayo “sandwich” de fase sólida, para la proteína VP7 (capside interna). Se sigue el protocolo de la casa comercial.


Genotipificación de para G (VP7) mediante RT-PCR

Extracción de ARN. Purificación de ARN de rotavirus. La extracción de muestras fecales fue realizada con Trizol LS (Gibco BRL# 10296-028) de acuerdo con el protocolo de la casa comercial. El botón que contiene el ARN se resuspende en 50μl de agua DEPC (0.1% diethyl pyrocarbonato, SIGMA) se guarda a -80°C hasta su posterior análisis.

Reverso Transcripción y Reacción en Cadena de la Polimerasa. Se basó en tres aspectos: la desnaturalización del dsRNA extraído, la transcripción reversa, utilizando la Transcriptasa Reversa, la amplificación del gen “G” (VP7), con los“primers” Beg9-End9 (Gouvea et al., 1994) y la genotipificación con el coctel de primers G5, G6, G8 y G10 (Gouvea et al., 1994) siguiendo la técnica descrita por Gouvea et al., (1990) y Gouvea et al (1994).


Tabla 1. Primers usados para RT-PCR de rotavirus porcino y bovino

Resultados

De un total de 19 muestras colectadas en bovinos y porcinos, se identificaron 5 muestras positivas en lechones y 6 muestras positivas en terneros mediante la prueba de ELISA.

Todas las muestras positivas al ELISA, fueron caracterizadas mediante la técnica de RT-PCR, para el caso de los terneros se detectó la presencia del genotipo G6 con un peso molecular de aproximadamente 500 bp y para el caso de los lechones el genotipo detectado fue G5, con un peso aproximado de 780 bp (Fig. 1).




Figura 1. Representa los G tipos de rotavirus porcino (arriba) y bovinos (abajo), correspondientes a G5 (780 bp) y G6 (500 bp), respectivamente, utilizando un marcador de 100 bp.


Discusión

La especificidad de los serotipos de los aislados de campo y, consecuentemente, la disponibilidad de herramientas diagnósticas fiables hoy en día llegan a ser la relevancia primaria para el desarrollo de sistemas apropiados de vigilancia y control epidemiológico de infecciones por rotavirus porcino y bovino. En este contexto, las limitaciones de pruebas serológicas existentes son también reconocidas, mientras que las técnicas moleculares, tal como las prueba de PCR, ha quedado ampliamente aceptada como la prueba de elección para la rápida y completa caracterización de aislados de campo (Hussein et al. 1996).

En este estudio se detecta por primera vez la presencia del genotipo G6 en terneros, el cual es considerado el más prevalente en un estudio realizado en Argentina, donde mostró una presencia de 60% sobre el resto de los serotipos identificados (Garaicoechea L. et al. 2006). Otro estudio realizado en Ireland, también describe a G6 como el serotipo más prevalente con un 80% sobre resto (Reidy et al. 2006). Estudios realizados en Brasil muetran a G6 como el serotipo prevalente en un 42% con respecto de los otros encontrados (Fernández A. et al. 2004). Estos resultados se obtuvieron de terneros menores de 6 meses de edad con presencia de diarrea.

En el caso de rotavirus porcino el serotipo G5 se encuentra entre uno de los más comunes identificados según un estudio realizado en Brasil en cerdos de uno a sesenta días de edad con y sin presencia de diarrea, al cual también lo implican con posible rearreglo con serotipos P de humanos (Rácz M. et al. 2000); así también en un estudio realizado en Argentina mostró a G5 como el principal serotipo identificado en cerdos de uno a cuarenta y cinco días de edad con presencia de diarreas (Mattion et al. 1989).

La exactitud del análisis del serogrupo G realizado también resultó en un número muy bajo de cepas identificadas por la cantidad pequeña de muestras colectadas, por lo que deja en claro que puede haber mayor diversidad entre rotavirus porcino y bovino que la previamente reportada; por lo que en la medida de lo posible sería de mucha utilidad continuar con el estudio para obtener datos más significativos; ya que una de las ventajas de la clasificación y definición de los diferentes serogrupos de rotavirus porcino y bovino es la posibilidad de elaborar vacunas y entender más sobre la epidemiología molecular del virus ya que se ha considerado como potencial zoonótico (Palombo, 2002).


Agradecimiento