Efecto de la estimulación hormonal sobre los resultados de la aspiración folicular (opu) en novillas brahman anéstricas con baja condición corporal

Introducción

La técnica de aspiración folicular transvaginal, conocida como OPU por sus siglas en inglés (Ovum pick up), comenzó a utilizarse en la mujer en la década de l980 y se describe por primera vez en bovinos por Pieterse et al. (1988). De manera que fue considerada por Pieterse et al. (1991, 1992), como un método poco invasivo y con gran repetibilidad, para la recuperación repetida de ovocitos a partir de donantes vivas.

En la actualidad, la fertilización in vitro (FIV), cuando es empleada de forma conjunta con OPU (OPU-FIV), es considerada a nivel mundial, como la más eficiente técnica que permite el avance genético de nuestros hatos ganaderos, comparada con otras como la inseminación artificial e incluso, mencionan Kruip et al. (1994); Nava y Hernández, (2005); Denis (2008) y Seneda et al. (2001), si se compara con la transferencia de embriones producidos por superovulación.

En un sistema de producción de embriones por OPU-FIV, garantizar la obtención del mayor número posible de ovocitos de buena calidad, viene a ser uno de los principales objetivos. En este sentido las características del desarrollo folicular de la donante, en el momento de la aspiración juegan un papel de suma importancia, como lo confirman estudios realizados por distintos autores (Bergfelt et al. 1994; Hendriksen et al. 2004).

Los mejores resultados han sido reportados cuando las aspiraciones son realizadas en una fase de desarrollo folicular donde hay mayor número de folículos de pequeño tamaño y no hay presencia de un folículo dominante, en tanto que el número de folículos disponibles para la aspiración presenta grandes variaciones dependiendo de la fase del crecimiento folicular, siendo el inicio de la onda el momento más favorable para la recuperación aseguran Solís et al. (2012), y como menciona De Rover et al. (2005), más folículos resultan en más ovocitos. Precisamente en la búsqueda de mejores resultados, autores como, De Roover et al. (2005) y Paul et al. (1995), emplearon tratamientos de prestimulación ovárica con gonadotropinas y no evidenciaron diferencias en los resultados de OPU con respecto a los tratamiento que no emplearon prestimulación. No obstante, Goodhand et al. (2000), De Ruigh et al. (2000), Murakami et al. (2003), entre otros, han encontrado que los tratamientos de preestimulación con FSH, incrementaron significativamente el número de folículos aspirados y la cantidad de ovocitos colectados. Por su parte Chong et al. (2008), obtuvieron resultados similares al emplear eCG (PMSG).

Viendo toda esta panorámica podemos aducir que la necesidad de obtener cada día mejores resultados, apuntan en este sentido, a la estimulación del desarrollo folicular mediante la aplicación de pequeñas dosis hormonales, durante la fase de reclutamiento folicular. Sin embargo, como menciona Palma (2008), OPU se lleva a cabo generalmente en los programas de producción de ganado que incluyen novillas saludables y con excelentes rasgos productivos y a pesar de que la influencia de la condición corporal sobre la actividad reproductiva es un fenómeno bien documentado (Palma, 2008); los estudios que vinculan la condición corporal directamente con los resultados de OPU, son escasos y más aún si se estudian conjuntamente con los resultados de estimulación hormonal.

Domínguez (1995), encontró que la tasa de ovocitos de buena calidad aumentó con el incremento de la condición corporal; lo cual puede ser explicado por el consenso de autores que indican que la condición corporal es un indicador del estado nutricional del animal (Hess et al. 1999, Arreaza et al. 2002, Días R. 2007, Torrico y Cardona 2011 entre otros) y los efectos nutricionales son mediados por cambios en los niveles de hormonas metabólicas y de la superfamilia de factores de crecimiento (Meza–Herrera et al. 2006). De manera que las concentraciones séricas de la hormona del crecimiento (GH) fluctúan en respuesta al estado nutricional, pudiendo deprimir la síntesis y secreción de gonadotropinas (FSH y LH) y afectar la eficiencia reproductiva (Scaramuzzi et al. 2006).

Todos estos fenómenos fisiológicos nos llevan a pensar que los bajos resultados de OPU originados por las deficiencias nutricionales, manifestadas en un estado de anestro y baja condición corporal, pudieran ser solapados con la aplicación de hormonas de actividad folículo estimulante, lo que pudiera permitir la sostenibilidad de los sistemas de producción continua de embriones a partir de ovocitos obtenidos por OPU, incluso cuando las hembras se encuentren en dicho estado.

Objetivo general. Estudiar el efecto de la aplicación de hormonas con actividad folículo estimulante, sobre los resultados de OPU (número de folículos disponibles para aspiración, tasa de recuperación y calidad de ovocitos recuperados) en novillas Brahman anéstricas con baja condición corporal.

Objetivos específicos

Conocer los resultados de OPU que se obtienen a partir de novillas de la raza Brahman anéstricas con baja condición corporal.

Determinar si la aplicación de hormonas con actividad folículo estimulante permite mejorar los resultados de OPU en novillas anéstricas con baja condición corporal. Comparar los resultados de OPU obtenidos de tres protocolos de estimulación con hormonas de actividad folículo estimulante. Analizar la relación costo beneficio de la utilización de hormonas con actividad folículo estimulante como alternativa para mejorar los resultados de OPU.

Metodología

Este estudio fue realizado en el Centro de Investigación en Biotecnología Agropecuaria, de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad de Panamá. Ubicado en el corregimiento de Chiriquí, localizado a los 8°23’15.12’’ de latitud norte y 82°19’47.48’’ de longitud oeste, con una elevación de 26 msnm. Dicho centro se encuentra ubicado dentro de la zona climática tropical de sabana, con una temperatura máxima de 32.0 ºC y mínima de 22.1 ºC, una precipitación pluvial anual con promedio de 2 856.9 mm y una humedad relativa de 80%.

Se emplearon un total de 24 novillas de la raza Brahman, con edades entre 15 y 16 meses de edad y peso promedio de 275 kg, las cuales se encontraban anéstricas y presentaban una condición Corporal de 2.5 en escala de 5 descrita por Lowman en 1976 y Van Niekerl y Louw en 1980. Los animales fueron asignados al azar en cuatro tratamientos (n: 6 por tratamiento). ). Con el objetivo de sincronizar la onda folicular, en todos los animales, un implante de progestágeno (Crestar®) de segundo uso, fue colocado en la oreja de forma subcutánea, seguido de la aplicación de 50 mg de progesterona y 2 mg de benzoato de estradiol (Over®) intramuscular (Día 0, 10:00 am). Se realizaron aspiraciones a las 48 y 96 h después de finalizados los tratamientos hormonales con FSH (Folltropin-V®) y PMSG (Folligon®). Trt. 1: Día 4 (9:00 am) aplicación de 300 UI de PMSG y OPU el día 6 (9:00 am) Trt. 2: Día 4: 25mg de FSH en la mañana (7:00 am) y 25mg de FSH en la tarde (6:00 pm), día 5: 25mg de FSH en la mañana (7:00 am) y 25mg de FSH en la tarde (6:00 pm); Día 7: OPU (6:00 pm) Trt. 3: Día 4: 300 UI de PMSG (9:00 am), día 8 OPU (9:00 am) Trt. 4: Día 4 OPU (9:00 am), sin estimulación.

Para realizar OPU, las hembras fueron sedadas con Xilacina al 2% (0.4 ml/vaca IM) y anestesiadas de forma local con Lidocaina al 2% (2.5 ml/vaca, vía epidural), esto nos ayudó a prevenir contracciones rectales y facilitó la manipulación de los ovarios. El recto fue vaciado manualmente e higienizada la región perineal por medio de un lavado con agua yodada. Para tal fin se empleó un ecógrafo Essaote, Aquila®, con un transductor microconvexo de 5 MHz, acoplado a una guía de aspiración folicular con cánula de 20G x 2”, la cual estaba unida mediante un sistema de aspiración folicular equipado tubos conicos de 50 ml para recolección, a una bomba de vacío (Pioneer pro pump). Se procedió a introducir el transductor por vía vaginal, cubierto con un protector con gel para ultrasonografía. Los ovarios se manipularon rectalmente de forma tal forma que se colocaron estos contra el transductor y visualizaron los folículos en la pantalla del ecógrafo. Con la aguja se atravesó la pared vaginal, puncionando de esta forma los folículos entre 3 y 10 mm de diámetro, en este momento se aplicó presión de vacío de 50 a 65 mmHg y se recogió el aspirado folicular en los tubos de recolección, contenidos medio de aspiración (PBS + heparina, en relación 50:1).

Los ovocitos obtenidos fueron evaluados y se clasificaron morfológicamente de acuerdo a de Loos et al. (1989) en la escala de 1 a 4, (1, 2, 3 aptos y 4 no aptos para fertilización in vitro).

Parámetros a evaluar:

Número de folículos disponibles para aspiración
Tasa de recuperación de los ovocitos
Calidad de los ovocitos recuperados
Análisis estadístico

Los tratamientos fueron analizados mediante un diseño completamente al azar, y se trabajó con un nivel de significancia de α 0.05. El número de folículos disponibles para aspiración, la tasa de folículos recuperados y las distintas categorías de calidad de ovocitos, fueron analizados empleando el procedimiento GLM de SAS (The SAS System, 1997).

Resultados y Discusión

Como se puede apreciar en la tabla No. 1 se evidenciaron diferencias estadísticas (p<0.05), entre los cuatro tratamientos ensayados, siendo el Trt.2, en el cual fue utilizada hormona FSH, el que aportó la mayor cantidad de folículos para ser aspirados y a su vez la de mayores rendimientos en cuanto a ovocitos aptos para la maduración (32,8 ±4,56 y 19,25 ±8,70 respectivamente). El Trt.1, que empleó PMSG seguido de la aspiración 48 horas más tarde, fue el segundo con mejores resultados para estos mismos parámetros de eficiencia (27,30 ±7,27 y 16,63 ±5,60). Siguiéndole el Trt.3 (PMSG seguido de la aspiración 96 horas después) y en último lugar como era de esperar el Trt. 4, que no empleaba hormonas con actividad folículo estimulante. A pesar de esto, la diferencia entre el mas y el menos eficiente (Trt.2 y Trt.3) a nuestro criterio se debe a la mayor disponibilidad de folículos para aspiración, de acuerdo con lo planteado por Goodhand et al. 2000, De Ruigh et al. 2000, Seneda et al. (2005), Chaubal et al. (2006), quienes obtuvieron en este mismo sentido, resultados similares a los nuestros cuando estimularon a las donantes con FSH y Chong et al. (2008) con eCG.

Efecto de la estimulación hormonal sobre los resultados de la aspiración folicular (opu) en novillas brahman anéstricas con baja condición corporal - Image 1

Por su parte, el tratamiento con FSH mostró valores superiores a los tratamientos que emplearon PMSG, hallazgo que a nuestro criterio puede ser sustentado haciendo referencia a los estudios de superovulación con PMSG, donde queda evidenciado que su permanencia prolongada en sangre provoca un crecimiento folicular disperso, con altos niveles de estrógenos (Palma, 2001), que pueden afectar el desarrollo de ovocitos o como fue planteado por Blanco et al. (2003), que algunos folículos atresian por la influencia de los altos niveles de estradiol. Por otra parte pensamos que en el caso del Trt. 3 el período de los 4 días transcurridos después de la estimulación con PMSG, permitió en mayor escala la atresia folicular y esto a su vez disminuyera el número de folículos disponibles para OPU, por ende la media de ovocitos aptos para fertilización in vitro.

En referencia a la calidad de los ovocitos colectados (Tabla No.2), se apreció que los tratamientos 1 y 2, aportaron una media superior de ovocitos, con mayor cantidad de células del cúmulo correspondientes a la mejor calidad para la fertilización in vitro, (categoría 1 con 3,25 ±1,83 y 3,75 ±1,67 respectivamente), difiriendo estadísticamente (P<0.05), con el resto de los tratamientos ensayados. Estos resultados son similares a los reportados por Aller et al. (2010), quienes encontraron mejores promedios de ovocitos colectados cuando emplearon un protocolo con FSH, no obstante, esta tendencia es explicada fácilmente por el mayor número de ovocitos colectados a partir de los tratamientos 1 y 2. De manera que se realizaron análisis porcentuales de los grados de calidad de ovocitos obtenidos en cada tratamiento (Gráfica No 1).

Como se aprecia claramente en el gráfico No 1, la tendencia de los grados de calidad de ovocitos fue similar en todos los tratamientos, mostrándose en cada tratamiento un mayor porcentaje de ovocitos de grado tres, seguido de los de grado dos y cuatro, en tanto que los de grado uno particularmente se mostraron más bajos. Chaubal et al. (2006), utilizaron distintos protocolos con FSH y encontraron al igual que nosotros mayor cantidad de ovocitos de tercera categoría, sin embargo, el número de ovocitos desnudos o de cuarta categoría fue mayor a los de grado uno y dos, aun cuando estos dos últimos fueron agrupados en un solo número, por su parte, Bacelar et al. (2010), usaron una escala de clasificación bastante similar a la nuestra y reportaron un resultado igual al nuestro: mayor cantidad de ovocitos de tercera categoría, seguido de los de segunda categoría y finalmente los de cuarta y primera categoría, en tanto que Solís et al. (2012), reportaron coincidentemente mayor número de ovocitos de grado tres; seguido de los de grado dos y luego los de grado uno y cuatro que fueron similares.

En nuestra investigación, a pesar de que se obtienen un mayor número de ovocitos cuando se emplean hormonas FSH y PMSG, esto no parece mejorar la calidad de los ovocitos colectados, lo que concuerda con lo reportado por autores como Gibbons et al. (1994) y Bungartz et al. (1995), quienes realizaron pre-estimulación con FSH y no observaron diferencias en la calidad de ovocitos colectados entre vacas pre-estimuladas o no. De igual manera Chaubal et al. (2006), no encontraron diferencias en la calidad con el uso o no de FSH cuando aspiraron una vez a la semana y removieron el folículo dominante antes de la aspiración. Vale la pena señalar que todos estos resultados discrepan con lo reportado por Viana et al. (2003), quienes indicaron que la prestimulación con FSH mostró ser una alternativa para mejorar la calidad más no el número de ovocitos colectados.

Con el fin de sustentar las aplicaciones prácticas de esta investigación decidimos valorar en términos económicos los protocolos empleados en cada tratamiento, de manera que como se aprecia en el cuadro No 3, el protocolo del Trt. 3, presentó los costos más elevados con un valor de 44.20 USD (Dólar Americano) por animal, seguido de los tratamientos 1 y 2 que presentaron costos iguales (9.85 USD por animal) y finalmente como es lógico, el protocolo del Trt. 4, el cual no utilizó hormonas con actividad folículo estimulante presentó un valor de 6.70 USD por animal.

Si analizamos la relación costo beneficio y valoramos el hecho de que el protocolo que emplea FSH (Trt. 2), ostentó las mejores tasas de recuperación de ovocitos aptos para fertilización in vitro, mientras que el protocolo que empleó PMSG seguido de la aspiración 48 horas más tarde (Trt. 1), mostró valores un tanto inferiores, pero requiere de menos manipulación de las hembras donadoras y como mencionamos, el costo de este protocolo es menor, podemos inclinarnos a la utilización de los protocolos tanto del Trt. 1 como del Trt. 2.

Conclusiones

Es posible obtener ovocitos aptos para fertilización in vitro a partir de novillas anéstricas con baja condición corporal.

La aplicación de hormonas con actividad folículo estimulante permite mejorar los resultados de OPU en novillas anéstricas con baja condición corporal, lo cual podría ser una herramienta útil para satisfacer la necesidad de ovocitos aptos para fertilización in vitro, en sistemas continuos de producción de embriones a partir de donantes vivas, incluso cuando la condición nutricional y reproductiva de las hembras es limitada.

La estimulación folicular con FSH parece ser la mejor alternativa para garantizar la mayor proporción de ovocitos de buena calidad cuando se emplean hembras anéstricas con baja condición corporal.

Al analizar los resultados desde un punto de vista económico y valorar la relación costo beneficio de los protocolos empleados en cada tratamiento, podemos aducir que los tratamientos uno y dos parecen brindar las mejores alternativas para satisfacer la demanda de ovocitos empleados en fertilización in vitro.

Efecto de la estimulación hormonal sobre los resultados de la aspiración folicular (opu) en novillas brahman anéstricas con baja condición corporal

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