El uso de hongos nematófagos como alternativa no química de control de nematodos gastrointestinales de rumiantes

Publicado el: 13/1/2020
Resumen

Los parásitos internos del ganado ocasionan enfermedades parasitarias, que se reflejan en pérdidas en la industria ganadera por los efectos adversos que producen en los bovinos, no obstante el formidable logro obtenido gracias al descubrimiento y desarrollo de medicamentos antihelmínticos. Los nematodos gastrointestinales reducen la ganancia de peso y la producción de leche, en particular en regiones tropicales como Colombia, donde las condiciones ambientales, como humedad y temperatura, son óptimas para su desarrollo y supervivencia (Márquez, 2008b).

Para contrarrestar los perjuicios ocasionados por los parásitos gastrointestinales, la mayor parte de los ganaderos ha empleado de manera indiscriminada e inadecuada medicamentos antihelmínticos; esta práctica se ha facilitado por la existencia de una gama variada de compuestos antihelmínticos de amplio espectro y alta eficacia. Infortunadamente, el uso irracional de estas eficientes sustancias químicas ha llevado a inconvenientes como:

  • Aparición de resistencia a los antihelmínticos en las poblaciones de nematodos.
  • Efectos ecotóxicos, en particular, en los organismos no blanco en el ambiente, como la microfauna benéfica del estiércol.
  • Presencia de residuos de estas sustancias químicas en productos de origen animal, principalmente en la leche.

Estos inconvenientes unidos a las cada vez mayores exigencias de los consumidores para que se produzcan alimentos con mínimos niveles de residuos químicos y mínimo impacto ambiental negativo en los procesos de producción de alimentos, ha estimulado la búsqueda y el desarrollo de métodos alternativos no químicos de control, con el objeto de minimizar el uso de antihelmínticos e implementar esquemas de control de endoparásitos del ganado tendientes a producir alimentos inocuos y de mayor calidad (Márquez, 2008b).

Entre las alternativas no químicas de control en investigación se destacan actualmente: el desarrollo de vacunas, la selección de animales resistentes mediante la identificación de marcadores moleculares asociados a la resistencia genética de los hospederos a los endoparásitos, la herbolaria o fitoterapia y el control biológico, entendido éste como la identificación y el uso de enemigos naturales para el control de las formas de vida libre de los nematodos gastrointestinales en las pasturas, entre los que se encuentran los hongos nematófagos (Saumell, 2006).

Si bien estas herramientas tienen estados de desarrollo diferentes, el control biológico ha tenido un incremento notable en las dos últimas décadas y constituye hoy la posibilidad más segura y eficiente para el control de los nematodos gastrointestinales de rumiantes en las praderas, toda vez que se ha pasado de las observaciones y las experimentaciones en los laboratorios a los experimentos en campo.

El interés y el progreso en el desarrollo de estas estrategias han aproximado mucho la posibilidad de introducir el control biológico en el marco de un esquema integrado para reducir el uso de los antihelmínticos (Saumell, 2000). Sin embargo, el gran potencial de esta alternativa de control parasitario dependerá, en un futuro, del interés comercial que manifieste la industria farmacéutica y de los precios, los cuales deben ser competitivos con los medicamentos antihelmínticos disponibles en la actualidad.

Los hongos nematófagos, u hongos antagonistas de nematodos, son una variedad de organismos que tienen como característica importante pasar de estado de saprobios a estado de parásitos en presencia de nematodos, a los cuales atrapan mediante el desarrollo de distintas estrategias de captura o de infección como: anillos simples o anillos constrictores, redes tridimensionales, dedos y ramas adhesivas. Hoy se sabe que existen más de 200 hongos nematófagos, de los cuales al género Arthrobotrys se le conocen más de 27 especies. De éstas, Arthrobotrys oligospora es el más estudiado actualmente (Saumell, 2006).

Tradicionalmente, los hongos nematófagos son clasificados en cuatro grupos: hongos atrapadores de nematodos, endoparásitos, parásitos de huevos y productores de toxinas. El tropismo, al igual que las estructuras de infección y las características ecológicas de estos organismos debe ser suficientemente conocido, con el objetivo de seleccionar adecuadamente los potenciales candidatos que puedan ser empleados como agentes de biocontrol de los nematodos gastrointestinales de los bovinos. El propósito de este capítulo es presentar el estado actual del conocimiento sobre los hongos nematófagos, basado especialmente en los datos extraídos de la literatura internacional y de la experiencia adquirida por este autor en el trajinar en este fascinante tema.

 

CONTROL BIOLÓGICO

El control biológico se define como el uso de microorganismos vivos introducidos en un medio ambiente para el control de los parásitos gastrointestinales del ganado, reduciendo las poblaciones parasitarias a niveles que no produzcan problemas clínicos en los animales ni ocasionen pérdidas económicas en los sistemas de producción ganaderos. El control biológico se diferencia de los antihelmínticos en tanto éstos se emplean para eliminar la totalidad de los parásitos en los animales, mientras que el primero es una estrategia que regula las poblaciones parasitarias. Una gama amplia de microorganismos se ha estudiado como potenciales agentes de control biológico de parásitos, entre los cuales se encuentran bacterias, hongos, protozoos, nematodos, artrópodos, escarabajos de heces de animales y lombrices de tierra, los cuales deben caracterizarse por especificidad de acción, alta capacidad reproductiva y por resistir las condiciones medioambientales de la zona. Sin embargo, los que han mostrado tener un mayor efecto de reducción en las poblaciones larvales de parásitos de rumiantes son los escarabajos de heces animales, lombrices de tierra y hongos (Saumell, 2000).

El control biológico debe basarse en la utilización de agentes bióticos naturales de los agroecosistemas de Colombia, a partir de los cuales se puedan elaborar preparados comerciales, para evitar la introducción de microorganismos de otras latitudes que puedan competir con los autóctonos y producir desequilibrios ambientales y reducción de la eficacia para el control de endoparásitos (Márquez, 2008b). La selección de estos microorganismos para que puedan ser empleados comercialmente debe basarse en las siguientes características:

  • Que su ciclo de vida sea más corto que el de los nematodos gastrointestinales en su fase de vida libre, de tal manera que puedan capturar larvas infectivas L3 antes de que éstas se desplacen a las pasturas.
  • Buena capacidad de producción industrial del hongo, es decir, que tenga alta capacidad reproductiva.
  • Que sea competitivo comercialmente con los medicamentos disponibles en el mercado, con relación a costos de producción y tiempos de sobrevivencia del organismo en las formulaciones comerciales.
  • Que sea estable y de larga vida en las formas de administración.
  • Que ofrezca seguridad para productores, consumidores, animales tratados y el ambiente.
  • Que sea económico y las formas de administración sean fáciles.
  • Que tenga un grado de eficacia capaz de reducir las poblaciones parasitarias a niveles esperados.

El concepto del control biológico es profiláctico o preventivo, constituyéndose en la herramienta más promisoria en el futuro cercano para controlar, de manera sostenible, el parasitismo gastrointestinal de los bovinos, especialmente si se tienen en cuenta, por un lado, los desarrollos logrados en la última década y, por otro, la desventaja que tiene el uso de productos químicos por la acumulación de residuos tóxicos en los productos de origen animal. Como herramienta no química de control, su empleo permitirá evitar o retardar la aparición de resistencia en las poblaciones parasitarias, siendo los hongos los organismos con los que se ha continuado la exploración de esta herramienta de control. En términos prácticos este método de control centra sus acciones en la fase larvaria de vida libre de los nematodos, sin que se ocasionen efectos tóxicos en el microambiente de los parásitos. Una ventaja del control biológico frente al control químico es que los agentes biocontroladores no eliminan totalmente las poblaciones parasitarias, haciendo que la población parasitaria remanente actúe como estímulo permanente de la respuesta inmunológica contra los parásitos.

Los hongos nematófagos son, además, habitantes naturales del suelo, que tienen la propiedad de controlar los nematodos gastrointestinales capturando y predando las larvas en las heces antes de la migración a las pasturas, evitando así su ingestión por los animales en pastoreo. Esta acción ha sido demostrada en bovinos, ovinos, cabras, equinos y cerdos.

 

HONGOS NEMATÓFAGOS

Los hongos nematófagos son organismos vivientes del suelo cuyo interés en ser estudiados se deriva de su potencial uso como agentes de control biológico de nematodos de plantas y animales (Saumell, 2008). Comprenden más de 200 especies que pueden encontrarse en todas las regiones del mundo desde el trópico hasta la Antártida, y se les encuentra comúnmente a 20 cm de profundidad del suelo, mientras que a 40 cm de profundidad su densidad es ya baste menor. La mayoría de estos hongos pueden vivir como saprofitos teniendo como sustrato materia orgánica en descomposición y también como parásitos, usando a los nematodos como nutrientes. Se cree que estos organismos al encontrarse en hábitats con limitantes de nitrógeno, emplean a los nematodos como fuente de este recurso, lo cual le confiere una ventaja frente al resto de hongos.

Debido a que los hongos nematófagos desarrollan su actividad nematicida en las larvas de las heces depositadas en las praderas, se les suministran a los animales para que luego de pasar a través del tracto digestivo, invadan dichas heces en las praderas y capturen y maten a las larvas tan pronto éstas se desarrollen. Estos hongos desarrollan micelio y conidios, lo mismo que clamidosporas, que son un tipo de esporas de paredes gruesas y fuertes que garantizan su supervivencia durante el tránsito a través del tracto digestivo de los rumiantes.

La mayor parte de los hongos se agrupan tanto en los hongos anamórficos como en los imperfectos o deuteromicetes; son habitantes naturales del suelo y pueden aislarse de heces de animales, suelo y material vegetal en descomposición.

El descubrimiento de los hongos con habilidades para atrapar nematodos se inició en 1888, cuando se observó por primera vez que el hongo Arthrobotrys oligospora infectaba parásitos de plantas y animales.

Existen más de 200 especies de hongos atrapadores de nematodos, que pertenecen a distintos géneros como: Arthrobotys, Dactylaria, Dactyella, Duddingtonia, Monacrosporium, Genicularia, Dactylariopsis y Harposporium. Entre éstos se destaca Duddingtonia flagrans por ser el hongo que ha demostrado tener mayor habilidad para atrapar nematodos, ya que destruye larvas de parásitos tricostrongílidos en heces de animales y no sufre alteraciones luego de pasar a través del tracto gastrointestinal de los rumiantes. Esta característica se debe a que producen esporas resistentes, que posteriormente germinan y se extienden por toda la materia fecal fresca para atrapar larvas en movimiento antes de que éstas migren a las pasturas (Nordbring-Hertz et al., 2002; Skipp et al., 2002). Este comportamiento pone de manifiesto el gran potencial de estos hongos para ser utilizados en formulaciones biológicas tendientes al control de endoparásitos del ganado.

Basados en los descubrimientos de las potencialidades de estos microorganismos, la actividad científica en los últimos 20 años ha sido intensa en Dinamarca, Australia, México, así como en Brasil y Argentina en Suramérica, y ha estado dirigida a explorar el potencial atrapador de nematodos que tienen algunos microhongos, como D. flagrans. Se han reportado aislamientos de D. flagrans en Australia, Canadá, Dinamarca, Estados Unidos, Francia, India, Inglaterra, Malasia, México y Rusia.

Los primeros estudios en que se utilizaron hongos como control biológico de parásitos gastrointestinales de animales se realizaron en Francia a finales del siglo XIX; en ellos se demostró la capacidad predadora de estos microorganismos sobre larvas infectantes de Strongyloides papillosus y Bunostomum phlebotomum en pruebas in vitro e in vivo. Sin embargo, el desarrollo farmacológico de los antihelmínticos de amplio espectro y de altos niveles de eficacia produjeron un estancamiento en esta línea de investigación; de no ser así, los desarrollos en este campo serían probablemente superiores en la actualidad.

En la actualidad, se están haciendo esfuerzos para continuar la investigación en esta temática en diversas partes del mundo, como en México, país en el que se evaluaron dos cepas de D. flagrans, una mexicana y otra francesa, en un cultivo en harina de maíz agar con larvas Panagrellus redivivus; se observaron reducciones de larvas de 98,9% con la cepa mexicana y de 97,7% con la cepa francesa. También se evaluó el porcentaje de reducción de larvas de Haemonchus contortus en pastos, mediante la administración oral de conidias de Dactylaria spp., Arthrobotris oligospora y conidias de D. flagrans a ovejas, observándose que D. flagrans era el microorganismo con mayor habilidad para reducir larvas de nematodos de H. contortus.

Así mismo, en Francia se conocieron también reducciones de larvas de nematodos en praderas superiores a 90%, al evaluar D. flagrans en ovejas experimentalmente infectadas con Trichostrongylus colubriformis y Teladorsagia circuncimta. Resultados similares relacionados con esta habilidad del mismo hongo se han obtenido y reportado por parte de muchos investigadores en otros países.

En relación con el potencial reproductivo de D. flagrans, se ha reportado que la tasa de producción de esporas de este hongo, en temperaturas óptimas de 30 ºC, es 700-800 trampas/cm2 en dos días, cuando se les induce con 20 larvas L3 de nematodos por centímetro cuadrado en agar, informándose también que el número de esporas requeridas para el control adecuado depende de la especie animal. Así, por ejemplo, se menciona que dosis diarias de 1x106 clamidosporas de D. flagrans por kilogramo de peso en terneros redujeron significativamente las infestaciones en las praderas y, por lo tanto, los niveles de infección, mientras que otros informes señalan un control efectivo de larvas de H. contortus en heces de ovejas dosificadas diariamente con 2,5 x 104 - 5,0 x 105 esporas/kg de peso. En este mismo sentido, se han observado reducciones por encima de 90% de larvas L3 de H. contortus, al emplear dosis de 1x106 clamidosporas de D. flagrans en ovejas, sugiriéndose el uso de este hongo como una alternativa promisoria de control biológico.

Dosis de 2x106 esporas/kg de peso han reducido eficientemente la transmisión de larvas L3 de ciatostoma equina en pastos cercanos a las porciones fecales durante un año. Otras especies de hongos han mostrado buenas habilidades para el control de larvas de nematodos de parásitos gastrointestinales de rumiantes, pero con la desventaja, hasta ahora, de alterarse durante su paso por el tracto gastrointestinal de estos animales.

Hay que destacar que tanto en las especies bovinas como en las ovinas se han producido resultados interesantes al utilizar D. flagrans, a pesar de que en algunos trabajos con ovinos los resultados hayan sido bastante variables, sin que se den razones que expliquen esta situación; no obstante, se menciona que estas diferencias pueden estar relacionadas con la estructura material de los bolos fecales de estos rumiantes, que pueden secarse antes de que los hongos atrapen las larvas de los parásitos. A pesar de esto, algunos investigadores informan sobre los grandes beneficios obtenidos en ovinos cuando han empleado D. flagrans para el control de parásitos gastrointestinales.

Sin embargo, a pesar de las bondades que muestra D. flagrans para el control de endoparásitos, se plantean algunos retos que es necesario superar para que este hongo pueda ser utilizado ampliamente en el futuro: la comercialización, la producción de grandes cantidades de esporas a muy bajo costo, y la estabilidad para el mantenimiento de la viabilidad de las esporas durante su almacenamiento.

No obstante estos retos importantes y debido al uso indiscriminado de compuestos químicos como única herramienta de control de los parásitos gastrointestinales, la contaminación ambiental, la resistencia a los antiparasitarios y la presencia de residuos químicos en los productos de origen animal ponen al orden del día el desarrollo de alternativas no químicas de control de endoparásitos mediante el uso de hongos. Por lo tanto, se requiere el aislamiento de cepas nativas y la evaluación posterior de su capacidad para reducir la contaminación de larvas infectivas de nematodos gastrointestinales en las pasturas.

Imperativos ambientales, sociales y de calidad e inocuidad alimenticia exigen una respuesta a estos problemas, haciendo, en definitiva, urgentes el desarrollo y la incorporación de alternativas al control convencional de parásitos, con énfasis en el control biológico.

Una de las características de los hongos nematófagos usados como antagonistas naturales es que no actúan sobre los estados parasíticos de los nematodos sino contra las formas libres (larvas L3) en el estiércol que se encuentra en las praderas, disminuyendo así la fuente de infección de los hospederos sin ocasionar efectos negativos en el ambiente, situación que no ocurre con el uso de compuestos químicos (Su et al., 2007). Aparte de estas habilidades nematófagas, los microorganismos que se utilicen como agentes de control biológico deben tener especificidad de acción, alta capacidad reproductiva y soportar las condiciones ambientales locales en las que se lleva a cabo el control.

En un futuro cercano, el control biológico, si se integra a otras estrategias, constituirá una importante herramienta por tener las ventajas siguientes: disminución del desarrollo de la resistencia a los antihelmínticos, que es hoy uno de los principales agravantes del problema de los parásitos gastrointestinales en rumiantes; reducción de problemas sanitarios en la salud pública derivados de la ingestión de residuos medicamentosos a través de los productos de origen animal, en particular, de leche y/o carne; minimización de la ecotoxicidad, es decir, de la acción tóxica que muchos residuos antiparasitarios, como las avermectinas, tienen sobre una variedad de agentes vivos que actúan en el ambiente como controladores biológicos, y contribución a la prolongación de la vida útil de los compuestos químicos, que constituyen una herramienta para combinar en la estrategia del control integrado de parásitos (Waller, 2002).

Desde la perspectiva de los agentes de control biológico los hongos nematófagos pueden ser clasificados en facultativos y formas parasitarias. Si bien se ha considerado que los hongos facultativos utilizan a los nematodos como una fuente suplementaria de nutrientes en vez de un recurso primario alimenticio, la prevalencia de hongos predadores formadores de trampas para capturar nematodos, sugiere que la nematofagia es un estado trófico importante de los hongos nematófagos y que, por tanto, los nematodos pueden ser más importantes para los hongos en vez de constituir un simple recurso de nutrientes de manera oportunista.

Los hongos nematófagos son taxonómicamente diferentes y tienen habilidades para atrapar nematodos y usarlos como nutrientes, lo que los ha hecho interesantes en el campo de la investigación de las herramientas de control alternativo de endoparásitos de rumiantes y otras especies. Dependiendo de su modo de infectar nematodos (Saumell, 2008), se han agrupado en:

  • Hongos predadores o atrapadores de nematodos
  • Endoparásitos
  • Hongos productores de toxinas.
  • Hongos parásitos de huevos y hembras

El hongo Stropharia rugasonnulata mata a los nematodos mecánicamente, mediante una estructura esférica y espinosa que daña la cutícula de estos vermes, sugiriéndose que este tipo de hongos podría constituir un quinto grupo de hongos nematófagos.

 

HONGOS PREDADORES

Estos hongos son parásitos facultativos que tienen la capacidad de atrapar nematodos porque desarrollan distintas estructuras de infección en las hifas; y ocasionalmente en algunas especies, estos mecanismos de captura se desarrollan en los conidios. Estos hongos son los más estudiados por su facilidad de reproducirlos en el laboratorio y porque son capaces de reducir las poblaciones parasitarias tanto en laboratorio como en campo. Algunas especies desarrollan estas estructuras de captura como resultado de medios pobres en nutrientes, por estímulos externos, como la presencia de nematodos, mientras que otras las desarrollan espontáneamente, siendo estos últimos más dependientes de los nematodos como fuente de nutrientes (Liu et al., 2009).

A los hongos predadores se les ha clasificado como insensitivos o sensitivos, perteneciendo a los primeros los que forman trampas espontáneamente y los segundos aquellos que no forman trampas espontáneamente (Saumell, 2008). La tabla 28 muestra la clasificación de los hongos predadores, así como características de crecimiento y dominancia en el suelo. La restricción de nutrientes puede inducir el paso de estado saprofítico a parasítico en ambos tipos de hongos.

Las especies que forman trampas espontáneamente abundan mucho en suelos ricos en materia orgánica, en comparación con los no formadores de trampas de manera espontánea, situación que los ubica en posición de ventaja frente a los segundos, y por esa razón los hongos no formadores de trampas espontáneamente son menos exitosos para predar nematodos.

Los hongos nematófagos predadores desarrollan diferentes estructuras de infección que consisten en: redes adhesivas, anillos no constrictores, anillos constrictores, ramificaciones adhesivas, botones adhesivos y ramas adhesivas. Cuando estos hongos son estimulados por la presencia de nematodos en el medio, luego del contacto con éstos, el micelio de los hongos desencadena la formación de trampas lo que le permite capturar, penetrar, matar y digerir el contenido de nematodos (Yang et al., 2007; Liu et al., 2009).

 

 

Estructuras de infección o de captura de los hongos nematófagos predadores

En el suelo, los hongos nematófagos, inducidos por necesidades de alimentación, tienen la habilidad de capturar nematodos que son empleados como fuente de alimentos, capacidad que les confiere ventajas de supervivencia. Esta dependencia varía según la especie de hongo, siendo mayor en lo hongos que son parásitos obligados. Sin embargo, los hongos predadores o atrapadores de nematodos tienen la facultad de vivir en condiciones saprofíticas. En este tipo de hongos el movimiento de los nematodos es muy importante, pues es en virtud de este movimiento que el parásito entra en contacto con las esporas de los hongos endoparásitos o con las trampas de los hongos predadores, para posteriormente ser atrapado e invadido. Adicionalmente, los nematodos pueden inducir la formación de trampas en los hongos predadores (Liu et al., 2009).

Tanto los hongos endoparásitos como los predadores comparten la capacidad de desarrollar sofisticadas estructuras morfológicas para atrapar nematodos vivientes; dentro del grupo de los predadores, algunos desarrollan trampas espontáneamente, mientras que otros las desarrollan sólo después de estímulos externos, y se considera que los primeros son más dependientes de los nematodos como fuente de nutrientes (tabla 29). Estas observaciones han permitido sugerir que los hongos formadores de trampas espontáneamente tienen ventajas competitivas sobre los formadores de trampas no espontáneamente en el suelo (Saumell, 2008).

 

 

Redes adhesivas tridimensionales

La formación de las redes tridimensionales consiste en el crecimiento y posterior anastomosis de varias ramas adhesivas, que surgen desde la hifa principal. El primer “anillo” de la red surge de la hifa matriz y es fácilmente detectable en microscopio de luz. Este surge de una rama de tres estructuras celulares de aproximadamente 20-25 μm, que se curva hasta volver a encontrar su lugar de origen en la hifa matriz (Barron, 1977). De esta manera se van formando más estructuras similares que dan la forma de la red tridimensional.

El desarrollo de trampas tridimensionales es entonces resultado de muchas anastomosis de hifas, en el cual emerge inicialmente una hifa perpendicularmente a la hifa vegetativa matriz que luego se curva hasta unirse en otra región de la hifa madre. El proceso es repetido varias veces hasta que se forme una red tridimensional (Yang et al., 2007). Las células de estas redes secretan una sustancia mucilaginosa de tal manera que al deslizarse el nematodo sobre la red, queda atrapado. Este mecanismo de captura es el más comúnmente desarrollado por los hongos predadores. Los hongos que forman redes adhesivas parecen no ser dependientes de la densidad de nematodos, sino que responden más bien a situaciones de mayores disponibilidades de nutrientes y de fuentes de energía (figura 37).

Anillos no constrictores

Los anillos no constrictores son estructuras compuestas por tres células globulosas. La formación de éstos se inicia cuando una rama erecta de una hifa crece y se curva lo suficiente hasta llegar a su punto de inicio para formar el anillo y entra en contacto con el tallo fusionando así las tres células, quedando soportado en un tallo delgado. El nematodo es capturado cuando se desliza por el interior del anillo y ejerce presión quedando atrapado (Liu et al., 2009) (figura 38)

 

 

Anillos constrictores

Los anillos constrictores, estructuras bastante sofisticadas, son los mecanismos de infección más eficaces que emplean los hongos predadores para capturar a su presa. Se forman de manera similar a los anillos no constrictores, pero se diferencian en que tienen los tallos más cortos y más gruesos. Cuando un nematodo entra en contacto con los anillos, sus tres células se activan y se ensanchan en su interior, y mediante fuerza y presión mecánicas estrangulan rápidamente al nematodo, en cuestión de 1-2 segundos (Yang et al., 2007). Los estudios de los hongos nematófagos informan que el diámetro de los anillos es de 30 µm, con diámetro de apertura de 20 µm (Barron, 1977) (figura 39).

 

 

Botones adhesivos

El botón adhesivo es formado por células adhesivas en forma de globo que se encuentran al final de una hifa o en el apéndice de un tallo erecto y delgado. El nematodo es capturado al deslizarse por la formación globosa. Se cree que los botones adhesivos junto con los anillos, debido a que pueden desplazarse con los nematodos, confieren una ventaja mayor a los hongos que forman este tipo de estructuras (Barron, 1977; Yang et al., 2007).

En general, las estructuras de captura de los hongos nematófagos se desarrollan desde una hifa, es decir, su origen tiene una fase hifal. Sin embargo, algunos hongos desarrollan estas trampas no desde una hifa matriz sino directamente sobre el sitio de la germinación del conidio, sin que se lleve a cabo ninguna fase hifal intermedia, como ocurre con A. dactyloides y Monacrosporium gephiropagum, y con A. oligospora y A. superba en menor grado. Estas estructuras, conocidas como trampas conidiales, son totalmente funcionales para atrapar nematodos y constituyen una eficiente estrategia de supervivencia de estos hongos.

Generalmente, los hongos predadores desarrollan un solo tipo de estructura de infección, aunque algunos pueden desarrollar más de una, como en el caso de A. oligospora.

Si bien existen diferencias en la morfología de las estructuras de infección de los hongos atrapadores de nematodos, estos hongos comparten algunas características en las células de las hifas adhesivas: en primer lugar, las células hifales presentan organelos citosólicos, denominados cuerpos densos, lo que las diferencia de las células de las hifas vegetativas y, en segundo lugar, la presencia de una capa extensa de polímeros extracelulares, que desempeñan un papel importante en la unión de las trampas a la superficie del nematodo.

 

HONGOS ENDOPARÁSITOS

Estos hongos nematófagos se caracterizan por atacar nematodos mediante esporas que pueden adherirse a la superficie de las larvas o ser ingeridas por éstas, como los hongos Catenaria auxiliaris y Lagenidium spp. Una característica evidente en este tipo de hongos es la formación de numerosos conidios y pocas hifas. La forma de infectar a los nematodos es mediante la adhesión de sus esporas a la cutícula de estos parásitos o por la ingestión de las mismas por el nematodo. Luego de la penetración de la espora, ésta germina dentro del parásito para iniciar el proceso de absorción de nutrientes.

Por el tipo de estructuras que estos hongos producen se les clasifica como zoosporas móviles, conidios adhesivos y conidios ingeribles. Ejemplos de los primeros y segundos son los hongos Drechmeria coniospora o de Hirsutella rhossiliensis (Saumell, 2008).

Algunas características propias de los hongos endoparásitos son:

  • La mayoría son parásitos obligados de nematodos, pues solo forman esporóforos y esporas fuera del hospedero infectado.
  • El rango de hospederos es menor que el de los predadores.
  • El mecanismo de infección es: contacto con la cutícula del nematodo, ingestión de la misma, germinación en el esófago, desarrollo del micelio dentro de la larva y esporulación para su reproducción.

 

HONGOS PRODUCTORES DE TOXINAS

Estos hongos producen toxinas en sus hifas mediante las cuales inmovilizan a los nematodos, como es el caso de Pleurotus ostreatus, el hongo más estudiado de este grupo. Debido a que atacan más a nematodos sedentarios y migratorios de plantas tienen entonces mayor importancia en estos vegetales, considerándose que las toxinas causan daño directo en la cutícula de las larvas (Yang et al., 2007)

 

HONGOS PARÁSITOS DE HUEVOS

Estos hongos emplean dos mecanismos para expresar su nematofagia: afectando indirectamente a las larvas o embriones contenidos en los huevos o dañando directamente los huevos mediante procesos de penetración e infección. Se cree que estos procesos ocurren de la siguiente manera:

  • Contacto inicial entre la hifa y la superficie del huevo.
  • Formación de un bulbo en el sitio de contacto.
  • Cambios en la permeabilidad de la cáscara para facilitar la penetración en virtud de acciones enzimáticas que deterioran el complejo proteína-quitina de la cubierta del huevo.
  • Ramificación del micelio del hongo para consumir el embrión. Se destaca el hongo Paecilomyces lilacinus como el principal representante de este grupo.

Un ejemplo del uso de hongos parásitos de huevos es el empleo que se hace en los sistemas agrícolas, en los cuales son aplicados en grandes cantidades en el suelo en forma de esporas; posteriormente el hongo coloniza la rizosfera encontrando en este sitio nematodos sedentarios parásitos de plantas, infecta a las hembras y reduce de esta manera su fecundidad. La infección de huevos de nematodos ocurre por el encuentro de la hifa con los huevos, la cual forma un órgano apresorio a partir del cual se secretan las enzimas extracelulares y mediante éstas se facilita la penetración al huevo (Nordbring-Herts et al., 2006).

 

INTERACCIÓN HONGO-NEMATODO

Los nematodos tienen dos barreras principales de protección: la cáscara de los huevos y la cutícula. Para una mejor comprensión de la interacción entre los hongos nematófagos y los nematodos es importante dar a conocer las características de estas dos barreras de los nematodos.

La cáscara de huevos de los nematodos está compuesta por tres capas: una externa, vitelina, una media, quitina, y una interna de lipoproteínas; el grosor de estas capas depende del género de los nematodos. La capa externa está compuesta predominantemente por proteínas, que constituyen 50% del total de sus componentes; y debido a los aminoácidos que componen la cáscara, se cree que tiene proteínas tipo lectina, las cuales son importantes en la permeabilidad de la cáscara de los huevos (Morton et al., 2004).

La cutícula juega un papel importante en la motilidad del nematodo, en el mantenimiento de su integridad morfológica y en la protección contra sus enemigos naturales y factores ambientales adversos. Es secretada por la epidermis y el revestimiento de la superficie está constituido por carbohidratos y proteínas, importantes en los eventos de reconocimiento en tanto influencia la especificidad de las interacciones con los hongos antagonistas. La cutícula tiene tres capas bien definidas: cortical, medial y basal, y su estructura y propiedades físicas cambian dependiendo del estado del ciclo de vida del nematodo. En el estado parasítico, la cutícula se desprende de los nematodos y las proteínas -como la lectina- enmascaran los nematodos de los hospederos (Morton et al., 2004).

Se ha postulado que diferentes factores están involucrados en la formación de las trampas de los hongos predadores, mencionándose entre ellos los movimientos de los nematodos y/o sustancias excretadas por estos parásitos, la escasez de agua o nutrientes o de manera espontánea.

Se han observado diferencias en la susceptibilidad de diferentes especies de nematodos a diferentes especies de hongos. Así, por ejemplo, se informa que hongos predadores del género Monacrosporium tienen prelación por nematodos de vida libre frente a nematodos de plantas y de bovinos; caso similar se reporta con especies del genero Arthrobotrys, en el cual diferentes aislamientos de la misma especie de este hongo nematófago muestran grados de eficacia de predación diferentes frente a las mismas especies de nematodos. Estas observaciones sugieren que las diferencias antigénicas en la cutícula de los nematodos o en diferentes aislamientos de la misma especie pueden resultar en diferencias en la eficacia de la predación, al igual que las observadas por Mendoza de Gives et al. (1999a, 1999b), en relación con el hongo Pasteuria penetrans frente a la cepa mutante srf del nematodo de vida libre Caenorhabditis elegans y otros nematodos parásitos de plantas.

Los mecanismos involucrados en el proceso de la interacción hongo y nematodos parásitos no está del todo dilucidado hasta el momento, revistiendo este tema mucha importancia toda vez que su comprensión contribuirá a la selección apropiada del hongo nematófago a emplearse en un programa de control integrado de parásitos.

Los hongos nematófagos se han clasificado morfológicamente en tres géneros: Arhrobotrys Corda, Dactyllela Grove y Monacrosporium Oudem. Sin embargo, estudios recientes indican que el ITS (Internal Trenascribed Spacer) y las secuencias de 18S ribosomal DNA (rDNA) brindan más información que las estructuras morfológicas para la delimitación de los géneros (Yang et al., 2007; Swe et al., 2011).

Los hongos nematófagos tienen la propiedad de vivir de manera saprofítica en el suelo, propiedad que cambia para pasar a forma infectiva en presencia de nematodos, produciéndose un cambio en su morfología y la formación de estructuras de atrapamiento como mecanismo de infección, siendo éste un proceso dependiente de características ambientales y de la presencia de nematodos. El paso de estado saprofítico a estado parasítico para desarrollar el estado infeccioso implica la ocurrencia de dos grandes transformaciones en los hongos: el desarrollo de mecanismos parasíticos, particularmente formación de dispositivos de captura especializados y/o la producción de toxinas.

Se han llevado a cabo estudios que han empleado principalmente A. oligospora como especie modelo, dirigidos a descifrar los mecanismos moleculares involucrados en la interacción de los hongos con sus nematodos hospederos, reportándose que en este proceso los hongos nematófagos actúan e infectan a los nematodos gracias a una serie de eventos sucesivos (Yang et al., 2007; Lian et al., 2010) denominados como:

  • Atracción o reconocimiento y adhesión del hongo a la cutícula del nematodo.
  • Degradación y penetración de la cutícula del nematodo/cáscara del huevo por enzimas hidrolíticas secretadas por el hongo.
  • Inmovilización y digestión del nematodo por parte del hongo.

Según lo anterior, los mecanismos patogénicos desplegados por los hongos nematófagos durante la infección de los nematodos son diversos. Estos mecanismos pueden ser mecánicos mediante la formación de estructuras especializadas de captura, o mediante la producción de toxinas para matar a los nematodos, implicando esto entonces que varios factores de virulencia pueden estar involucrados en este proceso de infección.

En relación con la atracción entre los hongos nematófagos y los nematodos, la mayor parte de los estudios ha estado focalizada a descifrar cómo es el funcionamiento subyacente en este encuentro, considerándose que algunas sustancias exudadas por los nematodos o productos volátiles de estos organismos constituirían la base quimioecológica entre los nematodos y los hongos. Estas sustancias serían las que estimularían inicialmente la formación de las trampas en los hongos nematófagos, pues se ha observado que cambios en el ambiente iónico del hongo influencian la morfogénesis.

Igualmente, otros estudios informan que compuestos como el CO2 y el ácido siálico son también sustancias que inducen a la formación de las estructuras de atrapamiento (Yang et al., 2007).

Luego de la atracción o reconocimiento, la adhesión es un requerimiento esencial de los hongos para infectar a su presa. Este proceso es mediado por una matriz extracelular que es formada en la superficie mucilaginosa de la superficie del hongo y las esporas, la cual es esencialmente una estructura fibrilar con residuos de azúcares neutrales, ácido urónico y proteínas. Se considera que éste es un proceso bastante complejo que va más allá de una simple unión receptor-ligando, en el que pueden estar involucradas las estructuras de infección y las enzimas secretadas por los hongos nematófagos. Luego del contacto inicial del hongo con la cutícula del nematodo se inicia una interacción con los receptores específicos, reorganización de los polímeros de la superficie para fortalecer la adhesión, cambios en la morfología y la secreción de enzimas (Mendoza de Givers et al., 2003).

Se cree que la penetración de la cutícula de los nematodos es consecuencia de fuerzas mecánicas ejercidas por el hongo en combinación con enzimas hidrolíticas que degradan la cutícula.

Hasta la fecha, se ha descrito una proteína encargada del proceso de reconocimiento y adhesión al hospedero, presente en las hifas fúngicas llamada lectina, que se une a los azucares (carbohidratos) de la superficie de la cutícula del parásito, para romper esta barrera física y dura de los nematodos. Esto implica una interacción entre el enlace carbohidrato proteína (lectina) y el carbohidrato receptor presente en el nematodo. La selección de los nematodos por parte del hongo está relacionada con unas sustancias enzimáticas hidrolíticas, de las cuales las reportadas en la actualidad son:

proteasas tipo serina, quitinasas, colagenasa, fosfatasa ácida (Mendoza de Gives et al., 2003; Morton et al., 2004; Liang et al., 2010; Yang et al., 2007). Las proteasas tipo serina son una familia de enzimas extracelulares que se encargan de hidrolizar catalíticamente enlaces peptídicos, con preferencia por determinados substratos que, en el caso del hongo más estudiado A. oligospora, se denominan PII y Aoz1, que actúan sobre la caseína, gelatina, cutículas de nematodos, entre otras. Estos últimos substratos son los encargados de estimular la producción de las proteasas tipo serina por parte del hongo, para que se produzca un reconocimiento y posterior infección del parásito por parte de la hifa fúngica.

En algunos estudios se ha descrito que la proteasa serina PII también tiene una acción nematotóxica, que interfiere en los movimientos del parásito, lo cual facilita la captura de éste por parte del hongo y limita su escape (Liang et al., 2010). Para el caso de D. flagrans, se ha demostrado que la enzima fosfatasa ácida se incrementa durante la interacción de este hongo con nematodos, con una máxima actividad a los 70 minutos.

Durante la adhesión, el hongo nematófago utiliza unas sustancias mucilaginosas y una capa de fibrillas extracelulares compuestas por proteínas y carbohidratos, las cuales están puestas directamente perpendiculares a la superficie de la pared del nematodo, tal vez para facilitar el rápido anclaje de la hifa y posterior invasión.

Otro tipo de enzimas secretadas por algunos tipos de hongos para el proceso de infección son las quitinasas. La quitina es un importante polímero estructural de las paredes celulares de hongos y exoesqueletos de invertebrados, y en este caso de la capa media de las cáscaras de los huevos de nematodos. Los hongos que parasitan huevos, en presencia de estos últimos, secretan estas enzimas para facilitar el proceso de infección y control de nematodos.

Por ser el colágeno uno de los componentes más importantes de la estructura de la cutícula de los nematodos, se considera que la colagenasa es la enzima secretada por los hongos nematófagos de mayor relevancia en el proceso de infección. La acción de esta enzima consiste en catalizar la hidrólisis de colágeno y gelatina, mediante lo cual se debilita la cutícula del nematodo facilitándose así la entrada del hongo y finalizar el proceso de infección. La tabla 30 muestra las enzimas identificadas y caracterizadas bioquímicamente de diferentes hongos nematófagos.

La penetración del hongo se produce luego de todo este proceso de solubilización de las macromoléculas de la pared del nematodo, por medio de las enzimas ya descritas, ayudándose con una fuerza mecánica, la cual termina de destruir la cutícula ya degradada, para empezar el proceso de digestión.

Una vez el hongo esté dentro del nematodo, se forma una especie de bulbo en una hifa trófica que es la que va a digerir el parásito, la cual tiene unos cuerpos densos y organelos celulares muy bien desarrollados, particularmente el retículo endoplasmático, y a medida que va avanzando la digestión, se van acumulando gotas de lípidos en la hifa trófica.

Durante este proceso, se producen altas cantidades de lectina, las cuales se distribuyen a lo largo de la hifa trófica para ir facilitando la destrucción del nematodo, a medida que se va produciendo la digestión del mismo y para acelerar el crecimiento de la hifa. Aunque la acción de las lectinas no es muy clara todavía, sí se sabe que éstas están directamente relacionadas con la penetración del nematodo y la posterior digestión de sus tejidos internos. Sin embargo, en los reportes de un estudio se informa que a un aislado de A. oligospora se le suprimió el gen de la lectina y se observó que la supresión de ese gen no afectó la patogenicidad de dicho hongo nematófago, lo cual puede sugerir que este hongo compensa la ausencia de lectina mediante la expresión de otra proteína.

Se sabe que el interés por los hongos nematófagos proviene de su uso potencial como agentes de control biológico y que recientemente el interés está centrado en dilucidar mejor los aspectos moleculares involucrados en el proceso de infección e identificar los potenciales factores de virulencia, entre los cuales algunas enzimas extracelulares como las proteasas serina, colagenasa y quitinasa se ha descubierto que tienen un papel importante en la patogénesis de los hongos nematófagos. La comprensión de estos aspectos permitiría seleccionar los sustratos, la preferencia de huéspedes y a escala molecular las enzimas blanco en el terreno de la ingeniería genética. Descubrimientos en esta dirección ampliarían la comprensión de la interacción de las proteasas y los componentes proteínicos de la cutícula de los nematodos, lo cual, a su vez, explicaría la preferencia de los hongos nematófagos hacia los nematodos.

Existe, por ejemplo, la esperanza de que novedosas herramientas como la genómica, la cristalografía y técnicas biológicas moleculares brinden información acerca de los genes que codifican las trampas, las señales que disparan la transformación del estado saprofítico al parasitario de los hongos nematófagos y los mecanismos moleculares involucrados en el proceso de infección.

En términos prácticos, el uso de hongos nematófagos como agentes de control biológico tiene, hasta ahora, algunas limitantes; por ejemplo, se sabe que un agente de control biológico debe crecer bien en el campo y es posible que el crecimiento de estos agentes pueda ser influenciado por factores químicos, físicos y biológicos en el suelo, lo mismo que factores fungistáticos en el suelo pueden inhibir su crecimiento, lo cual pone de presente que los resultados de la aplicación de esta estrategia puede ser impredecible.

Se cree que estas limitantes pueden superarse mejorando la expresión de los factores de virulencia mediante ingeniería genética, el crecimiento y la adaptabilidad de los hongos; esto permite seleccionar los agentes apropiados, como las clamidosporas. Sin embargo, proponer la liberación de organismos modificados puede ser un asunto polémico y candente en algunas partes del mundo (Liang et al., 2010).

 

 

FACTORES AMBIENTALES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO DE LOS HONGOS Y SU MORFOGÉNESIS

La distribución, ocurrencia, crecimiento y formación de los mecanismos de infección de los hongos nematófagos están asociados a factores bióticos y abióticos propios del suelo como la humedad, el pH, los nutrientes, los metales pesados, la densidad de los nematodos y la cantidad de agua sumergida en el suelo, asocia - ciones avaladas por resultados de estudios llevados a cabo para ese fin. Por ejemplo, se reporta que, en general, la mayor diversidad de hongos nematófagos se encuentra a 20 cm de profundidad del suelo, y que a profundidades de 4 m no se han detectado. Así mismo, se ha observado asociación positiva entre nutrientes del suelo (N, P, K) y den - sidad de nematodos por un lado y, por otro, se ha encontrado que los hongos predadores formadores de anillos constrictores son muy abun - dantes en suelos ricos en nutrientes y materia orgánica.

Las variables abióticas y bióticas cambian dependiendo de la profun - didad de los suelos, y está suficientemente demostrado que la actividad de los hongos nematófagos se pre - senta en la rizosfera, aunque ésta puede variar según el tipo de suelos y plantas.

 

IMPACTO AMBIENTAL DEL USO DE HONGOS NEMATÓFAGOS

Si bien las intervenciones de los seres humanos en la naturaleza, a través de procesos, ocasionan impactos positivos o negativos en ella, la incursión que se ha hecho hasta el momento para desarrollar herramientas de control biológico de los nematodos gastrointestinales de rumiantes mediante el uso de hongos nematófagos ha demostrado que estos microorganismos son inocuos para los animales, las plantas y el hombre, teniendo únicamente actividad contra estos nematodos. Así lo han reportado durante más de 15 años las investigaciones del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) de México, en las que el uso de estos hongos ha resultado seguro.

De otro lado, en relación con el ecosistema, si bien los hongos nematófagos actúan también contra los nematodos de vida libre, en el suelo existe una fungistasis que pone límites considerables a las poblaciones de hongos en este hábitat.

Así mismo, se ha reportado que los hongos tienen muchos enemigos naturales que luchan contra ellos, lo que conlleva una estabilización de las poblaciones de hongos. Es necesario resaltar que los hongos consumidos oralmente por los animales y eliminados directamente en las heces sin sufrir alteraciones actúan contra las formas larvarias de los nematodos gastrointestinales en el estiércol, lo que hace de esta alternativa una herramienta de control de endoparásitos amigable con el medio ambiente.

Finalmente, si se tienen en cuenta las demandas de los consumidores por alimentos con menos residuos químicos, particularmente carne y leche, y producidos a través de procesos que ocasionen menos daño ambiental, uno de los impactos benéficos del desarrollo de estrategias de control biológico será en la salud pública. En otras palabras, con el control biológico, se minimizará el uso de antihelmínticos en los esquemas de control de los parásitos internos de los rumiantes, se obtendrán productos inocuos y de mayor calidad y se responderá a las exigencias actuales de los consumidores.

 

FORMAS DE ADMINISTRACIÓN DE LOS HONGOS NEMATÓFAGOS

Se han realizado estudios tendientes a encontrar vehículos o medios apropiados que garanticen la viabilidad de los hongos para su administración a los animales; es decir, que luego de consumidos por los bovinos, mantengan su capacidad de reproducirse y atrapar larvas de nematodos gastrointestinales en el estiércol de dichos bovinos. Entre las principales formas de administración se mencionan granos de cereales, bloques minerales, bloques energéticos, capsulas de alginato y los bolos de liberación controlada (Sagüés et al., 2011).

Todas estas formas de administración han dado resultados bastante promisorios como para ser tenidos en cuenta para la conservación de estos hongos; el hongo probado mayoritariamente es D. flagrans por ser el candidato número uno para ser empleado como agente de control biológico de los nematodos gastrointestinales de rumiantes.

 

PROTOCOLO PARA EL CULTIVO Y PRODUCCIÓN DE HONGOS NEMATÓFAGOS EN LABORATORIO

Con base en información fundamental de Mendoza de Gives (comunicación personal, 2005), el proceso de cultivo, producción y mantenimiento de cepas de hongos nematófagos implica la realización de un proceso metodológico que abarca las siguientes etapas, las cuales deben ser tenidas en cuenta rigurosamente debido a la facilidad de contaminación de los cultivos de estos microorganismos en condiciones de laboratorio.

Toma de muestras de suelo

Materiales y equipos: cucharas de plástico, bolsas de plástico o polietileno, marcador de vidrio, libreta de registro.

  • Tomar muestras de suelo con cuchara, preferencialmente cercanas a porciones de estiércol de rumiantes y que contengan, en lo posible, porciones de raíces de plantas, pues se sabe que las raíces poseen altos contenidos de estos hongos. Debe procurarse que la muestra provenga de áreas ricas en materia orgánica y alto contenido de humedad, las cuales son condiciones óptimas para la supervivencia de estos organismos en estado saprofítico. Estos hongos tienen la característica de pasar de la condición saprofítica a la de saprobios.
  • Empacar las muestras en bolsas de polietileno rotuladas, en las cuales se identifique potrero, finca, número -si se toman varias muestras- y otra información pertinente en caso de nuevas tomas de muestras en los mismos lugares.
  • Transportar las muestras en condiciones normales, es decir, no requieren condiciones especiales de manejo.
  • Sembrar, mediante la técnica del espolvoreo, la muestra en caja de petri con agar-agua, haciendo de 3 a 5 repeticiones por muestra. Tapar las cajas y agrupar envolviendo estos grupos con papel parafilm. La capa de agar-agua debe ser delgada -porque ésta es pobre nutritivamente- con lo cual se logra inhibir el crecimiento de otros microorganismos como bacterias y ácaros.
  • Mantener el cultivo en condiciones ambientales normales teniendo la precaución de transferir los hongos de interés antes de que el agar se seque, especialmente en los climas cálidos.
  • A los tres días de sembrada la muestra, agregar larvas limpias de nematodos gastrointestinales con el fin de estimular el crecimiento de los hongos. Las larvas deben lavarse con sacarosa al 40%.
  • Observar en el estereoscopio sin destapar las cajas de petri el posible desarrollo de los hongos, al tercer día de la siembra de las larvas. Si en esta primera observación no se ven hongos, debe continuarse la inspección hasta el día 30. Deseche las cajas contaminadas con ácaros. En ocasiones hay que desechar todas las cajas de una misma bandeja por la alta contaminación.
  • Marcar la tapa de la caja con un marcador el sitio donde se encuentre el crecimiento de los conidios y amplificar esta región mediante un círculo en la base de la caja. Observar posteriormente en un microscopio (10X) el área demarcada para corroborar la presencia de conidios.
  • Cuando haya crecimiento de hongos transferir con un asa micológica esterilizada en un mechero los conidios a otra u otras cajas de petri con capa delgada de agar-agua. Para ello, el asa debe enfriarse poniendo en contacto ésta con el agar de las cajas en las cuales se vaya a realizar la segunda siembra o primera transferencia de conidios. La transferencia de conidios se puede realizar de dos maneras: a) Con el uso del microscopio de luz invertida ubicar el asa en el campo de visión, tomando los conidios aéreos y enterrándolos en agar-agua de la segunda transferencia; b) Con el uso del asa micológica cortar el agar donde se encuentran los conidios, tomar el trozo de agar con la misma asa y colocarlo sobre el agar de la segunda transferencia de manera perpendicular a la superficie del agar. El número de cajas con conidios transferidos dependerá de la cantidad de conidios desarrollados en la primera muestra.
  • Realizar más transferencias de conidios a otras cajas hasta tres o más transferencias con el objeto de obtener conidios cada vez más limpios (sin contaminación). A partir de la tercera transferencia, en caso de ser necesarias más de tres, deben hacerse usando mechero y cabinas de flujo laminar, buscando la obtención de conidios limpios. Esta recomendación debe tenerse en cuenta también cuando se transfieran conidios a tubos con agua destilada para la conservación de éstos en refrigeración.

Identificación de los hongos nematófagos

La identificación de hongos nematófagos es bastante difícil, requiriendo tener en cuenta sus estructuras para una adecuada identificación morfológica (figuras 40 y 41):

  • Hifas: si son septadas o no.
  • Conidios: número de éstos, tamaño y formas.
  • Longitud y anchura de los conidios. Esta medida es bastante importante.
  • Número de septas de los conidios.
  • Presencia o ausencia de candelabros en los conidios.
  • Si producen o no clamidosporas.
  • Tipo de estructuras de captura (anillos simples, anillos constrictores, redes tridimensionales, etc.).
  • Tipo de candelabro.

Es importante tener en cuenta que casi siempre se requieren métodos moleculares para confirmar las identificaciones morfológicas de los hongos nematófagos, dada la complejidad de sus estructuras, la existencia de especies y subespecies y la variación morfológica que se puede presentar en distintos aislamientos de una misma especie dependiente del medio de cultivo.

 

 

Producción de hongos nematófagos

  • La producción o cosecha de hongos requiere el medio PDA (papa, dextrosa, agar), el cual debe ser de capa gruesa.
  • La siembra en PDA debe realizarse haciendo cortes cuadrados o rectangulares con el asa en el agar-agua que contiene los conidios originales. En este proceso lo que se busca es la producción de clamidosporas, lo cual puede tardar de cuatro a seis semanas posteriores a la siembra. Es imprescindible en este proceso el uso de la cabina de flujo laminar.
  • Coloque las cuadrículas perpendicularmente a la superficie de la capa de PDA.
  • Observe la producción de clamidosporas a partir de la cuarta semana de la siembra, pues la formación de éstas tarda de 4 a 6 semanas. Si hay formación de clamidosporas, las cajas en las cuales emergieron éstas constituyen la fuente primaria para la producción de más hongos, es decir, son una especie de “hongos madre”. Luego de producidos los hongos (clamidosporas) o fuente primaria, puede dárseles tres usos o vías de mantenimiento:
  1. Criopreservarse: para ello es necesario hacer cuadrículas y colocarlas en viales que contengan glicerol al 50%. Podría intentarse tomar sólo las clamidosporas mediante raspados con una espátula, lo cual liberaría sólo a las clamidosporas.
  2. Mantenimiento en refrigeración en matraz o tubos: este procedimiento implica hacer raspados como el descrito en el punto anterior y echarlos en un matraz o tubo de 50 ml que contenga agua destilada estéril y antibiótico (cloranfenicol: 50 mg/L. Es posible que en el transcurso de seis meses el contenido de las clamidosporas en los tubos o matraces lleguen a contaminarse. Si esto ocurriere debe extraerse el sobrenadante del matraz (las clamidosporas se sedimentan fácilmente y ésta es muy visible) y adicionar más agua destilada esterilizada. Eventualmente, luego de la adición del agua destilada, los tubos pueden centrifugarse, y a lo decantado adicionarle más agua y guardar en refrigeración.
  3. Resiembra: este procedimiento puede hacerse cortando cuadrículas y sembrándolas de forma perpendicular a la superficie de la capa de PDA, pues si se hiciere horizontalmente esto puede tardar el crecimiento del hongo.

Preparación de agar-agua

• Disolver 10 g de agar en un litro de agua destilada a punto de ebullición.

• Para una dilución adecuada del agar se deben echar inicialmente 400 ml de agua destilada, agregar paulatinamente el agar y adicionar finalmente los 600 ml restantes.

• Esterilizar la solución en autoclave a 15 libras de presión durante 20 minutos.

• Dejar enfriar la solución (± 60 °C), y en una cabina de flujo laminar adicionar 500 mg de cloranfenicol a la preparación.

• Vaciar el agar-agua en cajas de petri hasta formar una capa delgada, manteniendo un mechero encendido en el interior de la cabina. Se debe evitar que la solución se enfríe para que no se formen grumos en la capa de agar.

Lavado de larvas de nematodos gastrointestinales en solución de sacarosa

Para una producción abundante de larvas de nematodos se debe utilizar la técnica de Baerman, llevando a cabo el siguiente procedimiento:

  • Mezclar las heces de rumiantes con pedazos pequeños de hule espuma en un platón de plástico. Tener en cuenta que tanto la temperatura como la humedad son factores críticos en la producción de este tipo de larvas. Por lo tanto, luego de realizada la mezcla tomar una porción de ésta y comprimir con la mano hasta observar que salgan gotas del puño de la mano. Evitar la formación de charcos de agua en el platón.
  • Tapar el platón con papel de aluminio haciendo un orificio central en éste, colocar gasa en el orificio con el fin de permitir aireación del coprocultivo.
  • Incubar la mezcla a temperatura ambiente o a 20 °C durante seis o siete días.
  • Observar el coprocultivo diariamente y evalar el estado de humedad de éste. Agregar agua si la mezcla llegare a secarse.
  • Al día 6 o 7 retirar la tapa del platón, tomar porciones del coprocultivo, envolverlas con gasa y anudar evitando que salga contenido del coprocultivo.
  • Sumergir las bolsas del coprocultivo en cada uno de los tubos del aparato de Baerman y dejarlos durante 24 horas, tiempo suficiente para la migración de las larvas al fondo de los tubos.
  • Retirar los tubos de los embudos y extraer con pipeta Pasteur el agua hasta dejar el sedimento que queda en el fondo de los tubos.
  • Recoger el material decantado en cada uno delos tubos y transferirlos a otros tubos hasta llenarlos.
  • Centrifugar a 3.500 rpm durante tres minutos y retirar el sobrenadante de los tubos. Si luego de esta centrifugación se observa que el material está sucio, se procede a otra centrifugación llenando los tubos con agua. Obtenido este material limpio, se procederá al lavado de las larvas con solución de sacarosa al 40% (40 g de sacarosa en 100 ml de agua destilada).
  • Extraer de los tubos el líquido limpio o transparente hasta dejar solamente la porción sedimentada que contiene las larvas y traspasarlo a otro tubo. Con el fin de traspasar todas las larvas lavar los tubos con un poco de agua.
  • Lavar las larvas con sacarosa de la siguiente manera:
    • Traspasar primero con una pipeta Pasteur de 2,5 ml a un tubo cónico de vidrio 7,5 ml de sacarosa, posteriormente agregar 2,5 ml del material que contiene las larvas a través de las paredes del tubo cónico para evitar que las larvas se vayan al fondo del tubo.
    • Centrifugar a 3.500 rpm durante tres minutos. Luego de la centrifugación se observará en el tubo la formación de tres capas bien delimitadas: la primera, constituida por agua, la segunda por larvas y la tercera por sacarosa.
    • Extraer el agua y, posteriormente, las larvas que quedan en la capa media con pipeta Pasteur haciendo movimientos circulares y evitando extraer sacarosa. Verter las larvas en otro tubo y completar con agua de llave.
    • Centrifugar en centrífuga refrigerada a 4 °C y 3.500 rpm durante tres minutos. Se deben realizar cuatro lavados en la centrífuga refrigerada para garantizar que las larvas queden sin sacarosa. Recordar que luego de cada centrifugación se debe eliminar el sobrenadante, completar con agua y agitar antes de la centrifugación. Luego del cuarto lavado eliminar el sobrenadante, completar con agua de llave, transferir a un tubo con tapa rosca, tapar y mantener en refrigeración.

De esta manera se mantienen larvas limpias, las cuales pueden ser usadas en cajas de petri donde se estén cultivando hongos a partir de muestras de suelo para estimular el crecimiento de los hongos; también pueden utilizarse en cajas en las que se haya realizado la primera transferencia de conidios. Igualmente estas larvas servirán para infectar experimentalmente animales.

Recuento de larvas L3 de nematodos gastrointestinales

  • Agitar el tubo que contiene las larvas, sacar 50 microlitros y distribuirlos en gotas sobre una lámina portaobjetos. Repetir este proceso 10 veces.
  • Observar en un microscopio y contar el número de larvas en cada gota.
  • Promediar el número larvas por lámina.
  • Determinar el número de larvas contenidas en el tubo de volumen conocido.

Evaluación de la capacidad nematófaga in vitro

  • Es muy importante identificar el hongo que se requiere para la investigación. Los hongos a seleccionar deben reproducirse rápidamente, no contaminar mucho, producir rápidamente estructuras de atrapamiento y clamidosporas. Es importante seleccionar medios que induzcan la formación de clamidosporas; estas se cuentan en una cámara de neubauer.Un aspecto clave en la selección de hongos para el control biológico de nematodos es descartar los hongos cuyo desarrollo de estructuras sea lento pues tienen poca eficacia para el control de nematodos, ya que las larvas se desarrollan primero y por consiguiente migran a las hojas de los pastos.
  • Usar la misma cantidad de clamidosporas en cada una de las cajas en las cuales se enfrentan a las larvas. Para esto se requiere estandarizar el número de clamidosporas de la siguiente manera:
    • Preparando una suspensión de clamidosporas.
    • Homogeneizando la suspensión.
    • Calculando mediante regla de tres el número de clamidosporas que hay en recipiente de volumen conocido.
  • Incubar durante siete días o más si fuere necesario, dependiendo del hongo, esperando siempre que el crecimiento de éste supere la mitad de la caja de petri. El rango de temperatura es de 20 a 30 °C, humedad de 60%-80% y pH neutro. En general, los suelos ácidos disminuyen la microbiología de las muestras.
  • Agregar un número conocido de larvas (de 200 a 500) en las cajas control y en los tratamientos. Se debe agregar el mayor número de larvas con el fin de estimular el desarrollo de las estructuras de los hongos.
  • Una vez se agreguen las larvas se debe decidir el tiempo de interacción hongos-larvas en un estereoscopio o un microscopio. Es conveniente hacer lecturas seriadas dada la importante información que se obtiene acerca de la rapidez de acción de los hongos. La observación puede ser diaria o día por medio. En este punto es importante constatar si las larvas están vivas, quietas o muertas, para ello deben estimularse con una gota de agua o una cerda en un asa.
  • Para hacer una lectura adecuada deben usarse cajas de petri cuadriculadas. Para ello se cuentan las larvas atrapadas en cada cuadrante y calcular el porcentaje de captura y la desviación estándar. Algunas veces podría leerse 20% de las cuadrículas, las cuales deben elegirse aleatoriamente. Otra forma de hacer las lecturas es utilizando embudos de Baerman, en particular cuando el número de larvas atrapadas sea tan alto que dificulte su lectura. Para esto es necesario desprender toda la capa de agar de las cajas de ambos grupos y colocarlas en los embudos, esperando que las larvas que no fueron capturadas bajen al fondo de los tubos. Se cuentan las larvas recogidas en los tubos de los grupos y se saca el promedio de las larvas recuperadas para determinar finalmente el porcentaje de atrapamiento. Cuando la evaluación es de dos grupos, es decir, un hongo y el grupo control, se usa la prueba t de student; si son más de dos grupos, entonces aplicar un Anova.

Evaluación de la capacidad nematófaga in vivo

Para llevar a cabo esta prueba deben tenerse en cuenta los siguientes aspectos:

  • Que el hongo a evaluar conserve su capacidad nematófaga una vez pasa por el tracto gastrointestinal de los animales, es decir, que no sufra alteración, siendo aconsejable realizar primero una prueba de digestión artificial usando jugo gástrico. Esto permite seleccionar mejor los hongos que posean mayor capacidad de resistencia a la acidez gástrica.
  • Usar los hongos de mayor agresividad en cuanto a capacidad nematófaga. En la prueba de digestión artificial hay que hacer una prueba de digestión abomasal y una de digestión ruminal, las cuales se llevan a cabo generalmente en un matraz. Luego del proceso de la digestión, a este recipiente se le extrae el agua que queda como sobrenadante, y se puede centrifugar varias veces.
  • Realizada la prueba de digestión artificial, se procede a sembrar las clamidosporas que se encuentran en el matraz de la digestión. La siembra debe hacerse en agar-agua y se le agregan las larvas de nematodos. Si el hongo desarrolla trampas en un corto tiempo, pueden utilizarse entonces en el experimento in vivo. • El número de animales a evaluar dependerá del número de hongos (tratamientos) a evaluar, aunque es válido usar 10-15 animales por grupo.
  • Calcular y definir el número de clamidosporas a usar en las dosis de los animales. Pueden usarse las siguientes dosis, siempre y cuando se justifique la elección de una u otra:
    • Dosis bajas: 250.000 clamidosporas por kg de peso animal.
    • Dosis medias: 500.000 clamidosporas por kg de peso animal.
    • Dosis alta: 1.000.000 clamidosporas por kg de peso animal.
  • Seleccionar los animales: deben, en lo posible, homogenizarse por edad, peso, etc. Casi siempre se prefieren machos debido a la menor contaminación con orina de las heces que provienen de este tipo de animales al momento de la defecación. Es importante agrupar los animales por recuento de huevos antes de los tratamientos.
  • Monitorear la carga parasitaria postratamiento: aquí es importante tener en cuenta el día –1. Y el monitoreo debe iniciarse a partir del segundo día de iniciado los tratamientos, aunque esto queda a discreción del investigador. No olvidar la conformación del grupo control. 
  • Redosificar: debe hacerse cada dos o tres días; por cuestiones prácticas, preferiblemente cada tres. Debe tenerse en cuenta que los recuentos de los huevos de los grupos control y tratado no varían los primeros días del experimento, puesto que los hongos no son ovicidas. Por lo tanto, las mediciones de esta capacidad deben hacerse midiendo qué tanto depredan los hongos a las larvas durante los días de la prueba in vivo. Estos coprocultivos deben realizarse tan pronto se inicie el experimento.
  • Duración del experimento in vivo: debe ser mínimo de un año con el objeto de cubrir varias estaciones climáticas.
  • Sobre el seguimiento parasitológico es necesario hacer revisiones de trabajos y diseñar el más apropiado. No olvidar que muchas veces los diseños riñen con los recursos económicos disponibles para el experimento, por lo que muchas veces es necesario ajustar el diseño a los recursos.

 

CONCLUSIONES

Los requerimientos de los mercados en cuanto a la calidad de los alimentos, especialmente los de origen animal, representan una presión fuerte para que se reduzca el uso de compuestos químicos para el incremento de la producción y para el control de los agentes patógenos y de las enfermedades ocasionadas por éstos, como es el caso de los nematodos gastrointestinales de los rumiantes.

El uso de compuestos químicos como única herramienta para el control de los parásitos, si bien revolucionó el control de estos agentes infecciosos, se tornó insostenible ambiental, económica y técnicamente, en particular por la presencia de residuos en los alimentos de origen animal y por la aparición de la resistencia a los antiparasitarios actualmente en uso.

Los resultados promisorios de investigaciones realizadas en diferentes países del mundo consideran el control biológico, basado en el uso de hongos nematófagos, como la alternativa más promisoria en el futuro para el control de los nematodos de rumiantes, desde una perspectiva ambiental y sostenible con ventajas en cuanto a salud pública y de reducción de la ecotoxicidad.

Parte del libro Control sostenible de los nematodos gastrointestinales en rumiantes

 
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