Producción de embriones transgénicos por inyección intracitoplasmática de espermatozoides tratados con estreptolisina

La transgénesis es una herramienta biotecnológica con diversas aplicaciones en el área de la industria farmacéutica, la medicina humana hasta el sector agropecuario (Lavitrano et al., 2013). En la transgénesis, los animales de granja son utilizados para mejorar sus características productivas, producir fármacos o proteínas recombinantes a partir de la leche y/o como xenotransplantes en humanos (Anzar and Buhr, 2006; Monzani et al., 2016). Un método que promete llevar la transgénesis a gran escala de una manera sencilla, aparentemente económica y rápida es la transgénesis mediada por espermatozoides (SMGT), la cual se basa en aprovechar la habilidad de los espermatozoides para unir, internalizar y transportar moléculas exógenas dentro del ovocito durante la fecundación para permitir la generación de embriones y/o crías transgénicas (Lavitrano et al., 2013). Aunque se ha logrado producir animales transgénicos mediante SMGT, la eficiencia de esta técnica sigue siendo baja. Uno de los mejoramientos que se ha hecho en la transgénesis mediada por espermatozoides (SMGT) es adaptar la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) para generar embriones transgénicos (SMGT-ICSI). La ICSI ofrece grandes ventajas que otras técnicas de reproducción asistida no ofrecen (Hossain et al., 2016). Una de ellas es permitir que los espermatozoides sean sometidos a diferentes métodos agresivos para alterar sus membranas y posteriormente, incubar los espermatozoides con un transgén para después inyectarlos dentro de un ovocito maduro para generar embriones genéticamente modificados (Perry et al., 1999; Moisyadi et al., 2009). En ratones, Sim et al., (2013) han reportado una alta tasa de embriones transgénicos con el uso de la estreptolisina (SLO) permeabilizando la membrana de los espermatozoides por medio SMGT-ICSI.

La SLO es considerada una de las toxinas más importantes que producen las bacterias estreptococcus pyogenes, esta se une al colesterol de la membrana plasmática de las células de los mamíferos y al unirse la toxina, forma poros estables sin dañar la célula (Atanassoff et al., 2014). Así, el uso de la SLO como permeabilizante ha sido extensamente utilizado para introducir diferentes moléculas exógenas tales como ADN, ARN y proteínas dentro de los compartimientos celulares (Brito et al., 2008; Sim et al., 2013). Por lo que lo hace un atractivo tratamiento para permeabilizar la membrana de los espermatozoides sin causar graves daños como ocurre con otros permeabilizante de membranas (Johnson et al., 1999). Este hallazgo propone una novedosa estrategia para mejorar la eficiencia en la producción de embriones bovinos transgénicos. Por esta razón, se planteó el objetivo de evaluar el efecto de la producción de embriones bovinos transgénicos por la inyección intracitoplasmática de espermatozoides tratados con estreptolisina-O.

 

Para este análisis se utilizaron 20 pajuelas de semen criopreservado de un toro comercial con fertilidad probada tanto in vivo como in vitro (Alta Genetics Inc., Alberta, Canada). Los espermatozoides congelados fueron descongelados en baño de agua durante 1 min a 38.5 °C y seleccionados por un gradiente de Percoll. Los espermatozoides se lavaron y manipularon en un medio HBSS de solución salina libre de Ca2+ y de Mg2+ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Los espermatozoides seleccionados fueron tratados con un método no permeable y uno permeable (Incubación en medio HBSS; grupo control y 10 U/ml de SLO) (Sim et al., 2013). Después de cada tratamiento, se agregó 500 ng/μl de un plásmido circular codificante para una proteina fluorescente verde (EGFP) a 1 x 106 espermatozoides y se incubó por 30 min a 37 °C incluyendo un grupo control con y sin el transgén (EGFP). Los espermatozoides fueron colocados posteriormente en microgotas de 3 μl de PVP al 10% e inyectados mediante ICSI en el interior de ovocitos madurados in vitro. Cada grupo de ovocitos inyectados fue posteriormente activado químicamente con 5 μM de ionomicina por 5 minutos, seguido por una incubación de KSOM que contenia 10 mg/μl de cicloximida por 5 horas (Io + CHX). Después de la activación, los ovocitos inyectados fueron colocados en gotas 50 μl de KSOM y cultivados en una estufa a 38.5 °C con una mezcla de gas del 5% de CO2, 5% O2, 90% N2 y 100% de humedad. Las variables de respuesta que se consideraron fueron la tasa de división y blastocistos analizados a las 72 hrs y 192 horas, respectivamente y la valoración de los embriones transgénicos que fueron evaluados a las 96 hrs y 192 hrs para detectar la expresión de la proteina fluorescente verde (EGFP) por medio de un microscopio de fluorescencia óptica con un rango de excitación de 395-470 nm y un espectro de emisión de 509 nm. Para el análisis estadístico se utilizó el programa SPSS (SPSS Inc; Versión 20). La comparación de las varianzas se realizó mediante un análisis de ANOVA. El análisis de la comparación múltiple para identificar las diferencias se realizó mediante la prueba de Scheffe. El nivel de significancia fijado para todas las pruebas estadísticas fue P<0.05.

 

En la Cuadro 1 se muestran los resultados del efecto de la incubación de los espermatozoides permeabilizados con SLO sobre la tasa de producción de embriones y la producción de embriones bovinos transgénicos capaces de expresar el transgén EGFP por medio SMGT-ICSI. Al inyectarse un total de 497 ovocitos madurados in vitro no se encontraron diferencias significativas en la división embrionaria entre los grupos de espermatozoides tratados con SLO y sin SLO (control), pero al llegar a estadio de blastocisto la tasa disminuyó significativamente en los espermatozoides que fueron inyectados en presencia del transgén EGFP respecto cuando no se utilizó EGFP (P≤0.05). Sin embargo, la tasa de eficiencia en los porcentajes de división embrionaria y de producción de blastocistos que expresaban la proteína verde fluorescente (EGFP) aumentaron significativamente cuando los espermatozoides fueron permeabilizados con SLO a diferencia del grupo control (P≤0.05). Aunque la permeabilización de los espermatozoides con SLO mejoró las tasas de expresión de EGFP en los embriones de bovino. Altas concentraciones de EGFP pueden llegar a ser perjudicial tanto para el desarrollo embrionario como en la expresión del transgén en los embriones (Garcia-Vazquez et al., 2009; Shadanloo et al., 2010). Ya que, el mecanismo de maduración de la proteína EGFP requiere de la oxidación del oxígeno (O2) y la liberación de peróxido de hidrogeno (H2O2) (Tsien, 1998), lo que podría explicar en nuestros resultados el deterioro del desarrollo embrionario temprano con altos niveles de expresión de EGFP (Perry et al., 1999; Garcia-Vazquez et al., 2009; Shadanloo et al., 2010). Por lo que, una reducción en las concentraciones de EGFP y/o tiempo de exposición del transgén con los espermatozoides podría ayudarnos aumentar las tasas de desarrollo embrionario y expresión en la especie bovina (Li et al., 2010; Pereyra-Bonnet et al., 2011).

 

Los resultados demuestran que la permeabilización de los espermatozoides con SLO, incubados con el transgén EGFP mejoró la tasa de producción de embriones bovinos transgénicos por SMGT-ICSI. No obstante, grandes cantidades de EGFP unidas en los espermatozoides e inyectadas en los ovocitos, pueden ser perjudiciales para el buen desarrollo embrionario.

 

Anzar, M., and M. M. Buhr. 2006. Spontaneous uptake of exogenous DNA by bull spermatozoa. Theriogenology 65: 683-690.

Atanassoff, A. P. et al. 2014. Microvesicle shedding and lysosomal repair fulfill divergent cellular needs during the repair of streptolysin O-induced plasmalemmal damage. PloS one 9: e89743.
Brito, J. L., F. E. Davies, D. Gonzalez, and G. J. Morgan. 2008. Streptolysin-O reversible permeabilisation is an effective method to transfect siRNAs into myeloma cells. Journal of immunological methods 333: 147-155.
Garcia-Vazquez, F. A., E. Garcia-Rosello, A. Gutierrez-Adan, and J. Gadea. 2009. Effect of sperm treatment on efficiency of EGFP-expressing porcine embryos produced by ICSI-SMGT. Theriogenology 72: 506-518.
Hossain, A., J. Phelps, A. Agarwal, E. Sanz, and M. Mahadevan. 2016. A Review of The Society for Assisted Reproductive Technology Embryo Grading System and Proposed Modification. International journal of fertility & sterility 10: 141-147.
Johnson, L. R., S. B. Moss, and G. L. Gerton. 1999. Maintenance of motility in mouse sperm permeabilized with streptolysin O. Biology of reproduction 60: 683-690.
Lavitrano, M., R. Giovannoni, and M. G. Cerrito. 2013. Methods for sperm-mediated gene transfer. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 927: 519-529.
Li, C., E. Mizutani, T. Ono, and T. Wakayama. 2010. An efficient method for generating transgenic mice using NaOH-treated spermatozoa. Biology of reproduction 82: 331-340.
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Monzani, P. S., P. R. Adona, O. M. Ohashi, F. V. Meirelles, and M. B. Wheeler. 2016. Transgenic bovine as bioreactors: Challenges and perspectives. Bioengineered 7: 123-131.
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Perry, A. C. et al. 1999. Mammalian transgenesis by intracytoplasmic sperm injection. Science (New York, N.Y.) 284: 1180-1183.
Shadanloo, F. et al. 2010. Sperm status and DNA dose play key roles in sperm/ICSI-mediated gene transfer in caprine. Molecular reproduction and development 77: 868-875.
Sim, B. W. et al. 2013. Efficient production of transgenic mice by intracytoplasmic injection of streptolysin-O-treated spermatozoa. Molecular reproduction and development 80: 233-241.
Tsien, R. Y. 1998. The green fluorescent protein. Annual review of biochemistry 67: 509-544.