INTRODUCCIÓN.
Más de 100 años han transcurrido desde que Mycobacterium tuberculosis fue aislado por primera vez por Robert Koch, de donde se originó Mycobacterium bovis, el patógeno del ganado y muchas otras especies animales. La tuberculosis bovina (TBb) ocasionada por M. bovis, es una enfermedad infecciosa de distribución mundial y de relevancia en la salud pública debido al consumo de productos lácteos sin pasteurizar, y por las pérdidas económicas que ocasiona a la industria ganadera.
Para disminuir su prevalencia se han planteado técnicas como la vacunación (Milián et al., 2010) y la selección de animales resistentes (le Roex et al., 2013). Recientemente, estudios de asociación de genoma completo (GWAS) han mejorado la investigación de enfermedades complejas que identifican miles de variantes genómicas, incorporando marcadores moleculares tipo SNP (Polimorfismo De Nucleótido Único). Se ha logrado identificar loci genéticos asociados con la resistencia a TBb en genes candidatos como SLC11A1 en ganado cebú africano y TLR1 en Holstein chinos (Sun et al., 2012).
Por lo tanto en objetivo del presente estudio fue Identificar variantes genéticas asociadas con resistencia a la tuberculosis en ganado lechero usando un enfoque de casos y controles con un diseño experimental de agrupamiento selectivo de ADN.
MATERIALES Y MÉTODOS.
Se colectaron muestras biológicas de pelo y linfonodos ubicados en cabeza, cuello, tórax y pulmón de 375 animales adultos Holstein con y sin lesiones macroscópicas a TBb en rastros ubicados en el estado de Jalisco y Aguascalientes, zonas de alta prevalencia de M. bovis (≈16%). El análisis microbiológico se realizó en el laboratorio de Microbiología Animal de la Facultad de Ciencias Naturales de la UAQ. Los tejidos obtenidos fueron macerados y cultivados en medios específicos Stonebrink y Lowenstein-Jensen para confirmar la infección por aislamiento del patógeno.
DNA POOLING Y GENOTIPIFICACIÓN
La extracción de ADN se realizó mediante un kit comercial (Wizard® Genomic DNA Purification Kit). El control de calidad se realizó usando un nanodrop (NanoDrop ™ 2000 / 2000c) y en geles de agarosa al 1% para verificar la cantidad, pureza e integridad del ADN. Se usó un total de 75 muestras de ADN en la construcción de cada grupo. Los "casos" estuvieron compuestos por dos grupos independientes de 75 animales cada uno, con lesiones y aislamiento de M. bovis. Se realizaron dos repeticiones para cada grupo de casos. Los "Controles" estuvieron compuestos por tres grupos independientes de 75 animales sin lesiones y negativos al aislamiento de M. bovis. También se realizaron dos réplicas para cada grupo control. Para la construcción de los pools se tomaron cantidades equivalentes de ADN de cada muestra (20 μL). La concentración final para los grupos fue de 50 ng/μL, de acuerdo con los requisitos de Illumina. Cada grupo de DNA pooling se genotipo cuatro veces en BeadChips Illumina BovineHD diferentes (777,962 SNP), para un total de 30 posiciones de chips. La posición de los SNP fue de acuerdo con el ensamblaje bovino UMB 3.1.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE DNA POOLING
Se analizaron de acuerdo con el enfoque SDP (Selective DNA Pooling) utilizando las frecuencias de alelo B (BAF) para cada conjunto de réplicas obtenidas a partir del algoritmo del software Illumina BeadStudio®. Se realizó un análisis estadístico después de excluir SNP monomórficos, mapeados en Chr Y, mitocondriales, sin posición cromosómica, así como el 10% de los marcadores que mostraron la mayor variabilidad de los valores de BAF, como lo indica el tamaño de la desviación estándar (SD) entre las medidas de los ensayos replicados dentro de la cola. También retuvimos solo SNP con MAF ≥ 0.05, dejando para el análisis de asociación un total de 438,555 SNP (de los cuales 10,034 en Chr X). Se utilizó una prueba de marcador único para la asociación marcador-rasgo, y el P-value para cada marcador se calculó como:
Ztest = Dtest/SD(Dnull)
Donde; Dtest es la diferencia de las frecuencias del alelo B entre las colas y, Dnull es la diferencia de las frecuencias del alelo B dentro de las colas.
IDENTIFICACIÓN DE QTL (QUANTITATIVE TRAIT LOCI)
Se usó el promedio de -Log10 (P-value) para identificar regiones QTL (QTLR). La región QTL SNP líder se define como el que muestra el mayor -Log10 (P-value) entre todos los SNP dentro de un QTL específico. Se consideró una ventana de 16 marcadores, que corresponde a un tamaño de ventana promedio de aproximadamente 100 Kb. Se consideró un umbral para identificar QTLR a -Log10 (P-value = 2.53), (PFP de 10%).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se identificaron 154 QTLR al 10% PFP (Figura 1). En general, todas estas regiones se distribuyeron homogéneamente sobre todos los autosomas (excepto en Chr 15 y 17) y en el cromosoma X (n. 2), definido por 3.296 SNP. El cuadro 1, incluye información de aquellos QTLR en las que se identificaron genes de relevancia biológica en la respuesta inmune del huésped, de igual manera incluye información sobre el SNP líder para cada QTLR, su posición en el cromosoma y el número de SNP pertenecientes al 10%.
El gen DNER (delta/notch-like EGF repeat containing) dentro del QTLR_21 en Chr 2, se encuentra entre los expresados diferencialmente para enfermedades inflamatorias, trastornos del tejido conjuntivo y enfermedades inmunológicas en el ganado. Seis QTLR albergan siete genes que ya se han asociado con susceptibilidad y/o resistencia a la TBb: QTLR_12 en Chr 1 (CD80), QTLR_25 en Chr 3 (CTSS), QTLR_26 en Chr 3 (FCGR1A), QTLR_127 en Chr 23 (HFE), QTLR_133 en Chr 25 (IL21R) y QTLR_152 en Chr 29 (ANO9 y SIGIRR). Todos estos genes están involucrados en la respuesta inmune contra Mycobacterium spp (Newman et al., 2011). (Cuadro 1).
CONCLUSIONES.
Los resultados revelan nuevas regiones QTL y confirman loci mapeados para la resistencia a la TBb. Las nuevas regiones QTL ubicadas en Chr 1, 3, 5, 25 y 29 albergan genes relacionados con la respuesta inmune. Nuestros resultados confirman las regiones QTL previamente mapeadas en Chr 2, 6, 13, 21, 22 y 23 relacionadas con la resistencia a TBb. Las regiones genómicas y los genes identificados en el presente estudio con Selective DNA Pooling de casos y controles se asociaron significativamente con la resistencia a TBb.
