C.-Técnicas de Cromatografía Liquida de Alta Resolución (HPLC)

Es válido el metodo HPLC para medir eficacia de distintos secuentrantes en dietas de lechones. Gracias Dr., por tanto aporte a la ciencia. Grace

Apreciado Roberto, Los métodos basados en HPLC para el análisis de micotoxinas son perfectamente válidos para medir la eficacia IN VITRO de los secuestrantes. La cuestión está en el método general utilizado para medir esa eficacia, visto que la HPLC es sólo la parte final del método, y sirve para analizar la concentración de micotoxina que no fue adsorbida por el secuestrante. Antes de ese análisis, está la forma como esa micotoxina entrará en contacto con el secuestrante, o sea: qué medio envolvente? cuál pH? qué tiempo de contacto?, y otros parámetros que en conjunto deben ser lo más parecidos al sistema gastrointestinal del animal, y por lo tanto, reproducir de la forma más fiel las condiciones naturales de la digestión y del tránsito intestinal. Ese es el gran problema. Un saludo. Gimeno

Estimado Dr Gimeno: Ultimamente varios secuestrantes de Micotoxinas han sido prohibidos en Europa y Asia, por su alto contenido de Dioxina. Se puede medir por HPLC el contenido de dioxina? Muchos Saludos. Dr Domingo Corbetto P.

Estimado Domingo Corbetto, Efectivamente, parece ser que existen métodos basados en HPLC para el análisis de dioxinas. Sin embargo, lo mejor y más recomendado es el uso de métodos que se basan en una combinación de Cromatografía de Gases y Espectrometría de Masas de Alta Resolución con un espectrómetro de masas de alta resolución y sensibilidad, caracterizado por una óptica de doble enfoque, y que permite medir concentraciones de dioxinas a nivel de ppt (partes por trillón, nanogramos/Kg) y ppq (partes por cuatrillón, picogramos/Kg). Un abrazo. Gimeno

Dr, me gustaría saber qué tan válido es diagnosticar una micotoxicosis, en especial causada por aflatoxinas por medio del HPLC, pero tomando en cuenta la cantidad de pigmento contenido en el hígado del pollo de engorda, es decir con el cromatograma, ver la concentración de monoésteres y diésteres, y a partir del comportamiento de éstos lograr el diagnóstico. MVZ ALFREDO CANELA HIDALGO MEXICO

Estimado Dr. Gimeno, Tengo dudas acerca de los porcentajes de recuperación de la micotoxina después de haber sido cuantificada por medio de HPLC. Yo me encuentro trabajando con Ocratoxina A, y tengo referencia de que ésta puede ser recuperada en un porcentaje mayor del 100, esto es posible? Por otro lado, durante el tiempo de corrido de la muestra, es posible que parte de la matríz o compuestos de la matríz se encuentren interaccionando con la molécula de tal manera que aparezcan en el cromatograma picos no correspondientes a la toxina en tiempos de retención cercanos a la toxina? En cuanto a sus trabajos, me han ayudado mucho a comprender el comportamiento de las micotoxina bajo ciertos parámetros. Me gustaría saber más acerca de métodos de genotoxicidad de las micotoxinas; si usted pudiese proporcionarme información, se lo agradecería. Gracias y buen día. Olaya Pirene

Estimado Dr. Gimeno: Existe la posibilidad de medir eficacia de secuestrantes adicionado en la dieta de lechones con algún método químico? He leido trabajos que miden índices productivos, crecimiento, lo cual es muy variable en el cerdo. Muchas gracias. Atte. Robert

Apreciado Roberto, No existe esa posibilidad que me indica. Para medir de una forma fiable y completa, “in vivo”, la eficacia de un secuestrante adicionado al alimento compuesto se deben realizar una o varias pruebas en granja experimental, donde en varios grupos de animales se deberán comparar las sintomatologías (lesiones, síndromes y demás), producidas a niveles macro y micro durante un período de suministro del alimento compuesto y consonante a: 1.- Alimento compuesto no contaminado con micotoxinas (asegurarse por HPLC) Y SIN SECUESTRANTE. 2.- Alimento compuesto no contaminado con micotoxinas (asegurarse por HPLC) Y CON SECUESTRANTE. 3.- Alimento compuesto contaminado (ver más abajo en c) con micotoxina (en concentración tal que pueda provocar en un tiempo lo más corto posible, una micotoxicosis crónica muy patente o de preferencia, una micotoxicosis aguda), Y SIN SECUESTRANTE. 4.- Alimento compuesto contaminado (ver más abajo en c) con micotoxina (en concentración tal que pueda provocar en un tiempo lo más corto posible, una micotoxicosis crónica muy patente o de preferencia una micotoxicosis aguda), Y CON SECUESTRANTE. a) En esas pruebas los animales deberán estar en perfecto estado de salud y sometidos a una nutrición equilibrada. Durante la prueba no deberá haber infecciones bacterianas, virales o parasitarias. Las condiciones de “hábitat” (temperatura, humedad, ventilación, manejo en general) deberán ser las más adecuadas. Los animales no serán sometidos a ningún proceso de vacunación y no se utilizarán fármacos. (b) Paralelamente se podrán hacer otras pruebas con otras concentraciones de micotoxina y de secuestrante. Y así para cada micotoxina con la que se quiera poner a prueba la eficacia del secuestrante. (c) La contaminación del alimento compuesto con la micotoxina en cuestión, se podrá realizar obteniendo una fuente concentrada de contaminación en el LABORATORIO a base de escoger una cantidad de sustrato, por ejemplo 10 o 15 Kg de maíz o más, exento de micotoxinas, e inocular a ese maíz una estirpe del moho altamente productora de esa micotoxina y dar las condiciones adecuadas (humedad, actividad de agua, temperatura, tiempo... etc) para el crecimiento de ese moho, proliferación y producción de la micotoxina en su máximo rendimiento. (d) Después de analizar por HPLC la concentración de micotoxina en ese maíz se calculará la concentración de maíz contaminado que habrá que mezclar homogéneamente en los alimentos compuestos en cuestión para dar la concentración de micotoxina que se desea. Antes de la prueba se analizarán por HPLC los alimentos compuestos contaminados para saber la concentración de micotoxina que realmente está presente. Todo lo expuesto es en líneas generales sin entrar en otros detalles. Un saludo. Gimeno

Estimados lectores y amigos, Como seguramente ya habrán podido observar, en el índice de mi artículo completo “Métodos de Análisis de Micotoxinas en Piensos Compuestos y Materias Primas (Revisión I)”, publicado en www.engormix.com (sección micotoxinas, ver listado completo de artículos técnicos), además del capítulo C.-Técnicas de Cromatografía Liquida de Alta Resolución (HPLC) que es el que se está tratando en este foro, hay otro capítulo referente a HPLC y que es: D.- Técnicas de Análisis que utilizan una Columna de Inmunoafinidad, seguido de una Determinación por Medio de la Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (HPLC); en él podrán ver o ya habrán visto que están los métodos para el análisis de aflatoxina B1, aflatoxina M1, deoxinivalenol o vomitoxina, zearalenona y ocratoxina A. Un abrazo a todos. Gimeno

Apreciado Dr. Alfredo, No creo que con lo que me habla de lo del pigmento y la concentración de monoésteres y diésteres sea una característica tan especifica como para diagnosticar una aflatoxicosis después del análisis por HPLC. La ocratoxina A, a pesar de ser eminentemente nefrotóxica, puede ocasionar también en el hígado anomalías como las que me menciona, aparte de una acumulación de glucógeno en los tejidos hepático y muscular. Le quiero indicar es que los pollos de engorde sólo son muy sensibles a la aflatoxina B1 cuando son muy jóvenes. A partir de una cierta edad, esa sensibilidad disminuye notablemente. Así pues: Contaminaciones con AFB1 de 75 a 800 ppb (microgramos/Kg) en alimentos compuestos, suministrados a pollitos de 1 día de vida en períodos de 3 á 10 semanas, provocaron una inhibición del desarrollo con las concentraciones más bajas, y lesiones hepáticas graves y muertes con las concentraciones más altas. Con 500 ppb y a las 3 semanas se observaron también problemas de hígado graso y aumento de su tamaño. Con 308 y 610 ppb, las mortalidades fueron de 8 y 11, respectivamente, entre las 0 y 9 semanas. Sin embargo, cuando dietas contaminadas con 2500 y 5000 ppb de AFB1 fueron dadas a pollos de 23 días de edad durante 32 días, no se observaron mayores problemas que los de un hígado ligeramente friable, y una reducción de la concentración de calcio en el suero, las lesiones histológicas fueron una vacuolización de los hepatocitos y una infiltración grasa (Fernandez et al, 1994). Estos resultados coinciden con los obtenidos por otros autores (Lanza et al, 1980). Vea Ud como con la edad los pollos son más resistentes a la acción tóxica de las aflatoxinas, ya que como habrá podido observar, esas últimas concentraciones de Aflatoxina B1 son muy elevadas. Fernández, A., Verde, M.T., Gascon, M., Ramos, J., Gomez, J., Luco, D.F., and Chavez, G. (1994). Avian Pathology, 23: 37-47. Lanza, G.M., Washburn, R.W., and Wyatt, R.D. (1980). Poultry Science, 59: 282-288. Un abrazo. Gimeno

Muchas gracias, doctor, por su respuesta. Esa información que me dio, en qué artículo puedo encontrarla completa, porque me interesaría conocer más acerca de los experimentos que ha realizado. De antemano, muchas gracias. Mvz Alfredo Canela H

Apreciado Dr. Alfredo,

En www.engormix.com (micotoxinas, artículos técnicos de Alberto Gimeno, ver listado completo de artículos técnicos), consulte mis artículos titulados:

“Aspergillus Micotoxicosis Comparativa Entre Pollos, Gallinas, Cerdos, Vacas Lecheras y Conejos”.

“Fusariomicotoxicosis comparativa entre pollos, gallinas, cerdos, vacas lecheras y conejos”.

En el primero encontrará la información que le he dado, y también bibliografía que le permitirá ampliar el tema, además de la bibliografía que ya está indicada en mi respuesta.

Un saludo.

Gimeno

Apreciada Olaya, Respecto a lo de la recuperación y a las interferencias, no se qué método está a utilizar para el análisis de Ocratoxina A, ni en qué tipo de productos aplica ese método. Hay metodologías en donde recuperaciones superiores al 100 pueden provenir de desvíos del método o de interferencias (a depender del sustrato) que el método no consigue eliminar. Si consulta el otro capítulo titulado “Técnicas de Análisis que utilizan una Columna de Inmunoafinidad, seguido de una Determinación por Medio de la Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (HPLC)” y que forma también parte de mi artículo completo titulado “Métodos de Análisis de Micotoxinas en Piensos Compuestos y Materias Primas (Revisión I)”, verá en ese capitulo que para el análisis de Ocratoxina A en cebada se utiliza (previo al HPLC) una columna de inmunoafinidad con anticuerpos monoclonales especificos de la Ocratoxina A. El método también va bien para maíz, trigo y piensos de cerdos. Las recuperaciones van por el orden de 93 a 95. Respecto a lo que me dice de métodos de genotoxicidad, no dispongo de suficiente información que le pueda ser útil. Un saludo. Gimeno

Dr. Gimeno: Aprovechando su amplia experiencia en el tema, ¿tiene información sobre si hay transferencia de aflatoxina B1 o alguno de sus metabolitos al huevo en gallinas que consumen dietas contaminadas con Aflatoxinas? Atte. MVZ. Mauro Arrieta / Estado de México.

Apreciado José,

Si lee mi artículo titulado “Residuos de Aflatoxinas y Ocratoxina A en Alimentos de Origen Animal (Leche, Huevos, y Tejidos Comestibles)” publicado en www.engormix.com (sección: micotoxinas, idioma: español, artículos técnicos de Alberto Gimeno, ver listado completo de artículos técnicos), encontrará en la Tabla 2 y después de está, una amplia respuesta a su pregunta.

Un saludo.

Gimeno

Estimado Ing. Gimeno: Leí su artículo y me causó mucho interés, en la ciudad que vivo el daño a granos por micotoxinas se está siendo frecuente y las empresas elaboradoras de alimentos balanceados para animales tienen problemas principalmente con aflatoxinas, como estudiante universitario el conocimiento de esta manera de determinar micotoxinas me da un conocimiento nuevo sobre determinación de aflatoxinas, mis mas sinceras felicitaciones a usted por compartir sus conocimientos con su servidor. Gracias.

Apreciado Daniel, Gracias por sus felicitaciones. Un saludo. Gimeno

Les dejo el link de lo último en el tema. https://www.eae-publishing.com/catalog/details//store/es/book/978-3-659-06900-0/metodolog%C3%ADa-para-minimizar-la-incertidumbre-de-calibradores-en-hplc Saludos!

Me ayudara tanto con mi tesis, como lo cito? Mil gracias =D. Saludos desde Chihuahua, Mexico.