Evaluacion de la eficacia de una vacuna a virus vivo modificado cepa lukert intermedia contra un virus muy virulento de la infección de la bolsa de fabricio administrada en pollos de engorda con anticuerpos maternos utilizando el analisis digital de deplesion linfoide.

La infección de la Bolsa de Fabricio (IBD por sus siglas en inglés Infectious Bursal Disease) es una enfermedad viral aguda y altamente contagiosa que afecta a las aves jóvenes, descrita por primera vez por Cosgrove, A. S.3 quien la denominó Enfermedad de Gumboro (EG). Winterfield, R. W. et al.20 habían descrito la patogenicidad, lesiones y la persistencia del virus de IBD en las gallinas. La inmunosupresión causada por el virus fue demostrado por diversos investigadores, entre ellos Sharma, J. M. et al. ¹⁷, quienes describieron el efecto inmunosupresor del virus empleando la toxina del tétanos y Brucella abortus, para demostrar como es afectada la inmunidad humoral, celular y natural. Los signos clínicos se presentan  el 10% al 20% de las parvadas afectadas y la mortalidad puede estar entre el 10% y el 20%.⁷ La IBD es endémica en las gallinas comerciales y es considerada una de las enfermedades infecciosas económicamente más importantes.15 La estabilidad del virus en el ambiente hace difícil su inactivación y la vacunación se considera la mejor manera de controlar la enfermedad.¹⁹

El Análisis Digital de Depleción Linfoide (ADDL) es una técnica en la cual se utilizan las redes neuronales artificiales, las cuales son herramientas de cómputo que se utilizan en la inteligencia artificial, que imitan la neurona humana y puede realizar el análisis de los fenómenos no lineales y complejos que son muy comunes en la biología o la medicina. Finalmente, los resultados generados por las tecnologías antes mencionadas, y también con las estadísticas tradicionales, hemos sido capaces de construir una serie de modelos matemáticos que faciliten la toma de decisiones de los veterinarios en razón de estar basada en criterios objetivos creados científicamente. 

Desde 1997, muestras altamente virulentas del virus de IBD habían sido detectadas en Brasil ⁴, causando alta mortalidad y grandes daños económicos. Ikuta, N., et al.⁵ examinaron 48 parvadas comerciales de gallinas en Brasil y encontraron muestras positivas para IBD usando RT-PCR, de las cuales una cepa era compatible con las cepas muy virulentas descritas en Europa y en Asia. 

Las reproductoras son hiperinmunizadas con vacunas vivas e inactivadas con adyuvante en aceite, confiriendo una buena protección a estas aves y, al mismo tiempo, pasando altos niveles de anticuerpos a la progenie.¹⁶ Naqi, S. A., et al.¹¹, trabajando con pollos vacunados  y no vacunados contra IBD con altos títulos de anticuerpos, verificaron que en los pollos vacunados a los 3 días de edad no tenían respuesta para la vacunación con cepas de virulencia intermedia y que las aves eran refractarias al desafío con una cepa clásica del virus de IBD. Tsukamoto, K, et al.¹⁸ usando  tres vacunas comerciales de Japón obtuvieron, con una de ellas, elaborada con cepa intermedia del virus, hasta 100% de protección cuando los pollos eran vacunados a los 20 días y desafiados 10 días después con una cepa muy virulenta del virus de IBD. También describieron, que cada parvada tiene cierto tiempo para la vacunación. En el campo, diferentes esquemas de vacunación se utilizan, pero brotes de la enfermedad ocurren en todo Brasil. El criterio más importante es que la cepa vacunal debe ser capaz de inducir una respuesta inmune, resultando en protección contra las consecuencias de la infección  or un virus muy virulento de este patógeno.
 

El diseño utilizado para el estudio se muestra en la Tabla 1.

Para este estudio se utilizaron pollos de engorda Cobb de 1 día de edad, hembras; estos pollos se eligieron de manera aleatoria y se revisaron de forma manual y visual para descartar que presentaran alguna alteración que pudiera estar relacionada con alguna patología, en base a la revisión de los Investigadores.

Los investigadores fueron responsables de la salud de los pollos durante la prueba. Los pollos fueron alojados en Unidades de Aislamiento en el sitio de estudio de acuerdo al diseño experimental desde el primer día de edad, donde tuvieron  libre acceso al alimento y al agua durante la prueba; la temperatura dentro de las unidades en la primera semana de edad de las aves fue de 23°C-33°C y de 20°C-30°C las semanas siguientes.

La vacuna utilizada para esta prueba se muestra en la Tabla 2.

Los pollos del grupo G1 fueron inmunizadas con 0.03 ml de la vacuna comercial con cepa Lukert Intermedia vía ocular al día de edad y los pollos del Control Negativo grupo G0 no se les administró ningún tratamiento. 

Virus para la inoculación:
La cepa de desafío fue aislada de campo y caracterizada a través de la prueba de PCR/RFLP correspondiente al tipo genómico 11 (G11) ⁵ y denominada GAR-1.⁸ La muestra fue pasada en aves de 21 días de edad y las Bolsas de Fabricio fueron retiradas y preparadas para el inoculo de acuerdo con Nunoya, T, et al.¹², con un titulo de 10⁴ DIE₅₀/ml. El inóculo fue evaluado por la técnica de PCR para descartar la presencia del virus de la Anemia Infecciosa y del Reovirus.
Los 2 grupos fueron desafiados con 100μl vía ocular dividida en partes iguales en los 2 ojos, por cada ave, de esta cepa.

Evaluación Serológica:
Al día de edad antes de la vacunación, a los 3, 6, 9, 12 y 15 días post-vacunación, y a los 5 y 10 días post-desafío, de los pollos eutanasiados fueron tomadas muestras de suero y procesadas para evaluar la respuesta inmunológica inducida  or medio del título de anticuerpos contra el virus de IBD, se utilizó la técnica de ELISA con el kit comercial Idexx de Gumboro de acuerdo al inserto del kit.

Signos clínicos y evaluación de las lesiones producidas por el Virus de IBD:
Durante el período experimental, los pollos fueron observados diariamente, los pollos muertos y los que presentaron signos clínicos atribuibles a la enfermedad como son diarrea, depresión, plumas erizadas fueron registrados. Después de  a evaluación del diámetro de la bolsa éstas fueron observadas para determinar las lesiones en la Bolsa de Fabricio incluyendo hemorragias, edema y exudado.

Evaluación de las bolsas:
Las evaluaciones de Peso relativo, diámetro y las tomas de muestras para histopatología y ADDL se realizaron a los 15 días de edad con 20 pollos del grupo G1 y 15 pollos del grupo G0; y siguiendo el mismo procedimiento se realizaron las mismas evaluaciones a 20 pollos de cada grupo a los 5 días postdesafío y el resto de los pollos de cada grupo a los 10 días post-desafío. 

Peso Relativo de la Bolsa de Fabricio y peso corporal del pollo: 

Los pollos fueron eutanasiados y pesados, posteriormente se les realizó la necropsia y se retiraron las Bolsas de Fabricio integras, las cuales fueron pesadas inmediatamente después de ser removidas. El peso relativo se calculó por la fórmula: Peso de la Bolsa (PB) ÷ Peso Corporal (PC) X 1000. 

Evaluación del Diámetro de la Bolsa de Fabricio:
Después de la evaluación del peso relativo se midió el diámetro de cada una de las Bolsas de Fabricio con un paquímetro y los resultados fueron registrados en centímetros. 

Evaluación Histológica de la Bolsa de Fabricio:
Todas las Bolsas de Fabricio inmediatamente después de la evaluación de lesiones fueron fijadas en formol buferado al 10%, para su posterior inclusión en parafina, seccionadas con micrótomo y fijadas en laminillas de cristal teñidas con la tinción de Hematoxilina Eosina (H-E) para el análisis histopatológico. 

Para la evaluación histológica se utilizó la siguiente escala de grado de daño en la bolsa de Fabricio de acuerdo a la Farmacopea Europea:

0 - Sin lesiones, bolsa normal.
1 - Del 1 al 25% de folículos muestran depleción linfoide e Infiltrado heterofílico.
2 - Del 26 al 50% de folículos muestran depleción linfoide, necrosis e infiltrado heterofílico.
3 - Del 51 al 75% de los folículos muestran depleción linfoide; necrosis e infiltrado heterofílico severo.
4 - Del 76 al 100 % de los folículos muestran casi depleción linfoide completa, necrosis e infiltrado heterofílico severo, hiperplasia y estructuras quisticas.
5 - El 100% de los folículos muestra casi una depleción linfoide completa con pérdida de estructura folicular y fibrosis. 

Análisis Digital de Depleción Linfoide (ADDL):
Se tomaron imágenes digitalizadas de las laminillas utilizadas para el examen histopatológico, el grado digital fue obtenido por medio de modelos matemáticos que utilizan redes neuronales artificiales, de acuerdo con la metodología descrita por Moraes.¹⁰

Métodos de Estadística:
El estudio fue aleatorio y la unidad experimental fue cada una de las aves. El método estadístico de cada uno de los  parámetros fue el siguiente:

a) Serología:
El análisis estadístico de los títulos de anticuerpos determinados por la prueba de ELISA fue realizada por la prueba Tukey de análisis de varianza entre los grupos con un nivel de probabilidad de 0.05. La comparación de las medias fue relacionada por medio del programa estadístico Sigmastat v 2.0, SPSS, Inc. y JMP™ v 6.0, Instituto SAS, Inc.

b) Mortalidad:
Se calculó y comparó el porcentaje de mortalidad de cada uno de los grupos. 

c) Peso relativo y diámetro de las Bolsas: 

El análisis estadístico del peso relativo y diámetro de la Bolsa fue realizado por la prueba Tukey de análisis de varianza entre los grupos con un nivel de probabilidad de 0.05. La comparación de medias fue relacionada por medio del programa estadístico Sigmastat v 2.0, SPSS, Inc. y JMP™ v 6.0, Instituto SAS, Inc.

d) Lesiones producidas por el virus muy virulento de IBD:

En base a los grados de lesión del ADDL y el examen histopatológico convencional se realizó la evaluación estadística por la prueba Tukey de varianza entre los grupos con un nivel de probabilidad de 0.05. La comparación de medias fue relacionada por medio del programa estadístico Sigmastat v 2.0, SPSS, Inc. y JMP™ v 6.0, Instituto SAS, Inc. 

Para todas las comparaciones estadísticas se consideró lo siguiente:

· La hipótesis nula es que los grupos de tratamiento son iguales.
· La hipótesis alternativa es que los grupos de tratamiento son diferentes. 

 

Evaluación Serológica:
Con los resultados obtenidos con la técnica de ELISA se evaluó si existe diferencia entre la respuesta inmune inducida por el grupo G1 y el grupo G0 antes del desafío y después del desafío considerando los anticuerpos maternos de los pollos. 

La Figura 1 revela que las curvas de anticuerpos entre los dos grupos fueron similares en la prueba de ELISA, no hubo una caída en la producción de anticuerpos antes del desafío indicando que la neutralización de anticuerpos maternos no fué suficientemente grande para ser percibida en la curva.

Peso Relativo de la Bolsa de Fabricio y peso corporal del pollo:

La media del peso relativo de las Bolsas de Fabricio y el peso vico del pollo de los 2 grupos experimentales fue comparada como parámetro para evaluar los cambios provocados por el virus de IBD. 

Las medias del peso relativo de los grupos no fueron estadísticamente diferentes, sin embargo a los 10 días post-desafío se encontró diferencia estadistica significativa (P≥0,05) entre los dos grupos teniendo la media del peso corporal más bajo en el control negativo G0 teniendo una diferencia de 99.5gr con el grupo G1 (Tabla 3).

Evaluación del Diámetro de la Bolsa de Fabricio:
La media del diámetro de las Bolsas de Fabricio de los 2 grupos experimentales fue comparada para evaluar los cambios provocados por el virus de IBD. 

No se observó diferencia estadística significativa entre los grupos.

Signos clínicos y evaluación de las lesiones producidas por el Virus de IBD:
Los pollos de los dos grupos experimentales hasta antes del desafío no presentaron signos clínicos, tres días después del desafio los pollos del grupo control (G0) presentaron depresión, plumas erizadas y diarrea que se prologaron por tres días. Los pollos vacunados, no presentaron signos visibles de la enfermedad. Ninguno de los dos grupos mostró mortalidad (Tabla 4). 

La observación de las lesiones macroscópicas de las bolsas de Fabricio reveló que todos los grupos experimentales estaban sin lesiones aparentes en el momento del desafío con el virus muy virulento. Esta situación se modificó a los 5 días después del desafío, cuando los pollos tenían 20 días de edad, donde el grupo control (G0) tenía seis pollos con edema peribursal en la bolsa de Fabricio y el resto estaban con bolsas aparentemente normales, y en el grupo G1 se observaron
nueve bolsas con edema peribursal, una con hemorragia y diez sin lesiones visibles. 

Al final del experimento, a los 25 días de edad (10 días después del desafío), en las bolsas de los pollos del grupo control (G0) se observó una con edema peribursal y otra con hemorragia, el resto no presentaron lesiones macroscópicas detectables, en el grupo G1 ninguna de los pollos desafiados presentó lesión en la bolsa.

Evaluación Histológica de la Bolsa de Fabricio:
Los valores de la evaluación histológica de las Bolsas de Fabricio de los 2 grupos experimentales fue comparada como parámetro para evaluar los cambios provocados por el virus de IBD antes y después del desafío, considerando que a mayor número de grado de lesión, mayor es el daño ocasionado por este virus. 

En la Figura 1, que revela los grados de lesión de las bolas, muestra que hubo diferencia estadística significativa (P≥0,05) ente las medias de grado de lesión del grupo no vacunado y el grupo vacunado a los 10 días post desafío, teniendo el grupo una media de grado de lesión de 3.05 la cual es aceptable de acuerdo a la Farmacopea Europea, a diferencia del grupo no vacunado que obtuvo una media de grado de lesión de 4.08. ç

Análisis Digital de Depleción Linfoide (ADDL):
Los valores de la evaluación de las Bolsas de Fabricio por medio del ADDL de los 2 grupos experimentales fue comparada como parámetro para evaluar el daño provocado por el virus de IBD considerando que a mayor número de grado de lesión mayor es el daño ocasionado por este virus.

En la Figura 2 se muestra que no hubo diferencia estadística significativa (P≥0,05) entre la depleción linfoide de los animales vacunados grupo G0 y los no vacunados G1 post-desafío.

DISCUSIÓN

La diferencia estadística significativa (P≥0,05) observada en los pesos corporales a los tres días de edad de los pollos desapareció a los seis días, sin haber diferencia hasta los 15 días al momento del desafío con el virus muy virulento de la enfermedad de Gumboro. Tampoco se observa diferencia estadística significativa (P≥0,05) a los 5 días post-desafío, pero a los 10 días post-desafío hubo una diferencia de peso entre los dos grupos. La diferencia de la media de peso de 99.5   a los 10 días post-desafío entre los grupos G1 y G0 representa un incremento en la ganancia de peso de aproximadamente 10%. Tal vez este fenómeno este asociado a la mayor severidad de la enfermedad en las aves no inmunizadas (G0) que tendrían menor apetito post-desafío y por consiguiente una reducción en la ganancia de peso.

El peso relativo, el diámetro y el diámetro relativo de la bolsa de Fabricio no presentan diferencias estadísticas significativas (P≥0,05) entre los grupos tanto antes como después del desafío. Corley et al.² consideran protegidos a los pollos  esafiados que tienen la media del peso relativo de la bolsa menor que la media de los controles no desafiados más dos desviaciones estándares.

La serología analizada por medio de ELISA de los 40 pollos con 1 día de edad, tomados aleatoriamente antes de dividirlos en los grupos, presentó una media de títulos de anticuerpos de 5902±244, con una desviación estándar de 1541 y  coeficiente de variación de 26%. Se observó que la dinámica de los títulos de anticuerpos de los grupos experimentales es muy similar y que, no hay evidencia mensurable de formación de anticuerpos en el grupo vacunado hasta el momento del desafío. Block et al.1 mencionan que la estrategia correcta para el control de IBD y el grado de éxito en condiciones de campo depende de la higiene, la presión ejercida por el virus de campo, nivel, la variación de los anticuerpos maternos y de la cepa de la vacuna contra IBD utilizada. Los autores realizaron estudios de campo donde aplicaron la “fórmula Daventer” y observaron que en los pollos que recibieron la vacunación antes del punto estimado no se desarrollaba una  cantidad de anticuerpos detectables transcurridos 14 días de la vacunación.

La inmunidad humoral no es la única responsable por la protección contra la enfermedad de Gumboro. Rautenschlein, et al.¹³mencionaron que pollos timectomizados y vacunados contra IBD no fueron capaces de resistir al desafío, indicando  el importante papel de la inmunidad celular en la protección. Algunos años después, Khatri & Sharma⁶ publicaron que además de los linfocitos B, el virus IBD infecta y replica en macrófagos produciendo mediadores proinflamatorios y citoquinas. El interferon - gama es significativamente aumentado por el virus IBD. Afirmaron que la respuesta por anticuerpos sola no es suficiente para proteger las aves.

Sólo fueron observados signos clínicos en el grupo G0, mientras que en el grupo G1 no se presentaron signos aparentes. Por otro lado, se pudo observar lesiones en la bolsa de Fabricio en todos los dos grupos a los cinco días post-desafío, sin embargo las lesiones del grupo vacunado no se presentaron a los 10 días post-desafío.

La media de grado de lesión, generado a través de la ADDL, de los pollos, a los 15 días de edad antes del desafío, del grupo vacunado G1 fue significativamente mayor que el grupo control no vacunado G0, pero estuvieron por debajo del grado de lesión 3 esperado en pollos vacunados. A los cinco y diez días después del desafío los pollos del grupo vacunado (G1) conservó la misma media de grado de lesión observado antes del desafío, iguales o menores que 3, pero los animales del grupo control no vacunado (G0) sufrieron daños en las bolsas y la media de grado de lesión a los 10 días post desafío estuvo arriba de 3. En este punto del experimento ya no había diferencias estadísticamente significativas entre los grupos. 

La evaluación histológica convencional reveló lesiones semejantes a la evaluación digital pero hubo discordancia a los 10 días post-desafío. Sin embargo, vale la pena mencionar que trabajos recientes reportan que esta metodología aunque es aceptada por organismos internacionales tiene menor repetibilidad comparada al ADDL.¹⁴

En aves SPF todos los animales controles no vacunados suelen morir ante un desafío con un virus muy virulento. En el experimento actual, con la presencia de anticuerpos maternos, los daños bursales fueron menores y todas las aves sobrevivieron. Este resultado ya era esperado basado en experimentos anteriores.⁹ Pero el hecho que más llama la atención es la ganancia de peso en los pollos vacunados. Los pollos no vacunados, pero con anticuerpos maternos, aunque  resistieron al desafío y no murieron, fueron afectados por el virus muy virulento ya que claramente tuvieron menos peso.

 

1. Block H, Meyer-Block K, Rebeski DE, Schar H, De Wit S, Rohn K. et al. A field study on the significance of vaccination against infectious bursal disease virus (IBDV) at the optimal time point in broiler flocks with maternally derived IBDV  ntibodies. Avian Pathol. 2007; 36: 401-409. 
2. Corley MM, Giambrone JJ, Dormitorio TV. Evaluation of the immune response and detection of infectious bursal disease viruses by reverse transcriptase-polymerase chain reaction and enzyme-linked immunosorbent assay after in ovo vaccination of commercial broilers. Avian Dis. 2002; 46:803-809. 
3. Cosgrove, A.S. An apparently new disease of chickens: avian nefrosis. Avian Dis. 1962; 6:385-389. 
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Tabla 1. Diseño del estudio

Tabla 2. Vacunas

Tabla 3. Peso corporal

 

Tabla 4. Lesiones Bolsa de Fabricio.

Figura 1. Curvas de las medias de títulos de ELISA para los distintos tratamientos.

 

Figura 2. Grados de lesión de acuerdo a la Farmacopea Europea.

 

Figura 3. Grados de lesión ADDL