Estudio comparativo para determinar los cambios producidos por tres vacunas elaboradas con diferentes tecnologías con el virus de la infeccion de la bolsa de fabricio.

Se conoce que en las aves neonatas la inmunidad puede ser pasiva adquirida por las madres o activa adquirida por la vacunación de esta progenie. Se consideraría como ideal una vacuna que fuera intermedia en su invasividad y que fuera capaz de sobrepasar los niveles de anticuerpos maternos. Sin embargo en 1992 Corley, M y col. demostraron que la vacuna 2512 causó atrofia de la bolsa impidiendo demostrar la protección conferida al ser desafiadas las aves a los 21 y 35 días después de la vacunación. Así mismo se han generado vacunas que contienen el complejo formado por la cepa viva Winterfield 2512 intermedia plus de IBD con inmunoglobulinas específicas con el fin  de disminuir la gravedad y duración de las lesiones producidas por este virus; la liberación del virus vacunal del complejo está influenciada por la diminución natural de los anticuerpos maternos, siendo contraindicada en huevos procedentes de gallinas no vacunadas frente a IBD.

En este estudio se compararon 3 vacunas con la cepa 2512 producidas con diferente tecnología, una producida en embrión de pollo Libre de Patógenos Específicos, la segunda producida en cultivo celular y la tercera una vacuna que contiene el complejo formado por la cepa viva Winterfield 2512 intermedia plus del virus IBD con inmunoglobulinas específicas tomando como parámetro primario los cambios histopatológicos a los 15 días postvacunación y como parámetro secundario el peso relativo de las bolsas de Fabricio, diámetro de estas y la respuesta serológica producida por la inmunización de las aves.


Materiales y Métodos

Para este estudio se utilizarán 80 aves SPF de 10 días de edad, las cuales serán distribuidas al azar en un total de 4 grupos cada uno de ellos con 20 aves de acuerdo al Diseño de estudio descrito en el Cuadro 1. 

Cada uno de los grupos fue instalado en las unidades de aislamiento independiente para recibir el Producto de Investigación Veterinaria (PIV) o el Producto Control (PC) de acuerdo a su grupo por vía gota en el ojo en un volumen de 0.03 ml. Las aves una vez instaladas dentro de las unidades permanecieron en ellas hasta el momento de ser eutanasiadas o después de su muerte. Las aves se encontraban sanas sin ningún signo clínico de tipo locomotor, nervioso, digestivo o respiratorio antes de la vacunación.

El investigador fue responsable de la salud de las aves durante la prueba. Las aves utilizadas en este experimento se mantuvieron desde el día de edad hasta la finalización de la prueba en las instalaciones del laboratorio de pruebas en animales de Boehringer Ingelheim Vetmedica S.A. de C.V. Las unidades de aislamiento en el laboratorio de pruebas en animales se mantuvieron bajo presión positiva a 130 Pascales con aire filtrado a la entrada y salida, con temperatura de 20-23°C y una humedad relativa de 37-42%. Las aves de todos los grupos fueron observadas diariamente y los datos de las observaciones fueron registrados. Las aves del grupo 1 recibieron el PIV1 que correspondía a la vacuna producida en embrión de pollo SPF, que recibió por vía gota en el ojo con un título de 103.7 _DIEP50/ml. con un volumen de 0.03 ml. Las aves del grupo 2 recibieron el PIV2 que correspondía a la vacuna producida en células por vía gota en el ojo en un volumen de 0.03 ml después de este haber sido reconstituido, con un título de 103.3 _DIEP50/ml. 

Las aves del grupo 3 que recibieron el PIV3 identificado como vacuna con complejo inmune por vía gota en el ojo en un volumen de 0.03 ml después de este haber sido reconstituido con un título de 102.8 _DIEP50/ml.

Las aves del grupo 4 recibieron diluente ocular sin ningún virus y fu administrado por vía gota en el ojo en un volumen de 0.03 ml. 

A los 15 días post vacunación a todas las aves de los grupos se les tomó una muestra de sangre para realizar la evaluación serológica de anticuerpos contra el virus de IBD por medio de la técnica de Ensayo de enzimas ligadas  inmunoabsorventes (ELISA por sus siglas en inglés Enzime Link Immunoasorbant Assay) la cual fue realizada por el Laboratorio externo de acuerdo a las instrucciones del comerciante IDEXX.

Después del muestreo serológico todas las aves fueron eutanasiadas por dislocación cervical y una vez extraídas de la unidad de aislamiento fueron pesadas y se procedió a la extracción de la bolsa de Fabricio y la determinación del peso de este órgano. Después de ser determinado el peso de la bolsa de Fabricio, estas fueron colocadas en envases de plástico de sellado hermético con una solución de Formol al 10% para su estudio histopatológico.

Para el estudio histopatológico el grado de lesión de la bolsa de Fabricio se evaluó de acuerdo a la siguiente escala descrita por la Farmacopea Europea y anexada como Cuadro 2.

Se consideró que los grupos son iguales si no existe diferencia estadística significativa entre las medias de los valores obtenidos de la escala del estudio histopatológico de cada grupo. Como parámetro secundario se consideró que los grupos son iguales si no existe diferencia estadística significativa entre las medias de los valores obtenidos del peso relativo, del diámetro de la bolsa y los títulos serológicos contra IBD determinados por la técnica de ELISA de todos los grupos. 

El ensayo no se considera válido si más del 10% de los resultados de las aves del grupo 4 son positivos al parámetro serológicos.

Toma de muestras serológicas
A los 15 días post vacunación de todas las aves de todos los grupos se obtuvo de 1 a 3 ml de sangre, la cual fue colectada en envases de plástico los cuales se mantuvieron a temperatura ambiente hasta separarse la fase sérica, la cual, fue nuevamente colectada en microtubos de centrífuga para ser enviados al laboratorio externo.

Para determinar si existió diferencia entre los grupos tratados, se realizó la comparación de las medias de los valores primarios y secundarios obtenidos. 

Se determinó la media de los valores de cada parámetro de cada uno de los grupos para determinar si existió diferencia estadística entre todos los grupos. 

La evaluación estadística se realizó comparando las medias de los valores por medio de un análisis de varianza correspondiente al diseño experimental completamente al azar con una comparación de medias de la prueba de Tukey (P≤ 0.05)
para ello se usó el programa estadístico SAS considerándose las siguientes hipótesis: 

Hipótesis nula: No existe diferencia estadísticamente significativa entre los valores de las medias de los grupos: 1, 2, 3 y 4.
Hipótesis alterna: Existe diferencia estadísticamente significativa entre los valores de las medias de los grupos: 1, 2, 3 y 4.

 

Histopatología
Los resultados obtenidos del estudio histopatológico por medio de la prueba de Tukey, muestran que no existió diferencia estadística entre el grupo que recibió el PIV1 la vacuna producida en embrión de pollo y el grupo que recibió el PIV3 la vacuna con complejo inmune mostrando daños histopatológicos similares después de realizar el análisis estadístico con una probabilidad (<0.0001).ç

Mientras que la media del daño histopatológico del grupo que recibió el PIV2 la vacuna producida en cultivo celular fue estadísticamente menor a los que recibieron las otras 2 vacunas. El grupo PC tuvo una media de 1 considerándose negativo a cambios ocasionados por el virus de la Infección de la Bolsa de Fabricio. Los resultados se describen en el Cuadro 3.

Serología
Los resultados serológicos mostraron que no existió diferencia estadística por medio de la prueba de Tukey con una P<0.0001 entre los 3 grupos que recibieron las diferentes vacunas. Encontrándose diferencia estadística significativa solamente en el grupo 4 manteniéndose los títulos negativos. Los resultados se describen en el Cuadro 4.

Peso relativo
Se realizó el análisis estadístico con la prueba de Tukey de las medias de los valores obtenidos del peso relativo sin encontrarse diferencia estadística entre el grupo que recibió el PIV1 y el grupo que recibió el PIV3 con una probabilidad (<0.0001).
Mientras que la media del peso relativo del grupo que recibió el PIV2 que corresponde a la vacuna producida en cultivo celular fue estadísticamente mayor a los que recibieron las otras 2 vacunas. El grupo PC tuvo una media de 4.2 considerándose negativo a cambios ocasionados por el virus de la Infección de la Bolsa de Fabricio y sirviendo como punto comparativo para determinar que el grupo que tuvo menor daño ocasionado por la vacuna considerando el peso relativo como parámetro fue el grupo vacunado con el PIV2. Cuadro 5. 

Diámetro de la bolsa
Se comparó por medio de la prueba de Tukey las medias de los valores del diámetro de la bolsa de Fabricio de los grupos, sin encontrarse diferencia estadística significativa entre el grupo que recibió el PIV1 producido en embrión de pollo y el grupo que recibió el PIV3 con complejo inmune con una probabilidad (<0.0001).

Mientras que la media del diámetro de la bolsa del grupo que recibió el PIV2 producido en cultivo celular fue estadísticamente mayor a los que recibieron las otras 2 vacunas con una media de 0.9. El grupo PC tuvo una media de 1.3 considerándose negativo a cambios ocasionados por el virus de la Infección de la Bolsa de Fabricio y sirviendo como punto comparativo para determinar que el grupo que tuvo menor daño ocasionado por la vacuna considerando el diámetro de la bolsa como parámetro fue el grupo vacunado con el PIV2. Cuadro 6. 

Los resultados muestran que no existió diferencia estadística entre el PIV1 producido en embrión de pollo y el PIV3 vacuna con complejo inmune en los parámetros evaluados en este estudio sin encontrarse ningún efecto favorable en aves SPF al administrarse la vacuna conteniendo suero hiperinmune aviar contra el virus de la Infección de la Bolsa de Fabricio. Sin embargo los resultados obtenidos en este estudio muestran que la vacuna producida en cultivo celular ocasionó menor cambio en las bolsas de Fabricio siendo mayor su diámetro, el peso relativo y menor valor en la escala histopatológica. Debido a que el PIV1 y PIV2 tuvieron el mismo título viral se sugiere que podría tener algún efecto positivo la producción de esta vacuna en cultivo celular disminuyendo los cambios ocasionados por la vacuna en la bolsa de Fabricio.

Al no encontrarse diferencia estadística significativa en los resultados serológicos entre los grupos vacunados se puede inferir que la inmunogenicidad de las 3 vacunas es similar. Los resultados negativos del grupo 4 que recibió el PC nos validan el estudio. Por lo tanto es necesario al elegir un programa de vacunaicón considerar los anticuerpos maternos y conocoer el tiempo de disminución de estos para poder elegir la vacuna adecuada considerando el tipo de tecnología para su producción.

1.-Block, H.; Meyer-Block, K.; Rebeski, D. E.; Scharr, H.; De Wit, S.; Rohn, K. et al. A field study on the significance of vaccination against infectious bursal disease virus (IBDV) at the optimal time point in broiler flocks with maternally derived IBDV antibodies. Avian Pathol., 2007, v. 36, n. 5, p. 401-409.

2.-Bublot, M.; Pritchard, N.; Le Gros, F. X.;Goutebroze, S. Use of a vectored vaccine against infectious bursal disease of chickens in the face of high-titred maternally derived antibody. J.Comp Pathol., 2007, v. 137 Suppl 1, p. S81- S84.

3.-Di Fabio, J.; Rossini, L.I.; Eterradossi, N. Toquin, M.D.; Gardin, Y. European-like pathogenic infectious bursal disease viruses in Brazil. Veterinary Record, 1999 v.145, n. 7, p. 203-204.

4.-Farmacopea Europea 01/2008:0587 Vacuna contra la Bursitis Infecciosa aviar, viva. 

5.-Ivan, J.; Velhner, M.; Ursu, K.; German, P.; Mato, T.; Dren, C. N. et al. Delayed vaccine virus replication in chickens vaccinated subcutaneously with an immune complex infectious bursal disease vaccine: quantification of vaccine virus by real-time polymerase chain reaction. Can.J.Vet.Res., 2005, v. 69, n. 2, p. 135-142. 

6.-Moraes, H. L. S.; Salle, C. T. P.; Nascimento, V. P.; Salle, F. O.; Rocha, A. C. G. P.; Souza, G. F. et al. Infectious Bursal Disease : Evaluation of Maternal Immunity and Protection by Vaccination of One-Day Old Chicks Against Challenge with a Very Virulent Virus Isolate. Brazilian Journal of Poultry Science, 2005, v. 7, n. 1, p. 51-57.

7.-Salle, C. T. P., Cé, M. C., Santos, C. H. C., Guahyba, A. D. S., & Nascimento, V. P. d. Use of statistical techniques on the interpretation of routine serological data produced by a poultry industry. In Abstracts of the 48th Western Poultry Disease Conference Vancouver -Canada.1999, pp 130.