Rápida identificación por PCR de Salmonella enteritidis, detección de Salmonella SPP. y de algunos serovares patógenos de importancia veterinaria y bromatológica

Introducción

*Salmonella es un importante agente etiológico de enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs) al contaminar la carne, huevos y productos derivados. Su detección en alimentos antes de que estos sean consumidos prevendría muchos brotes y permitiría implementar controles previos a la ocurrencia de enfermedad. Los métodos de diagnóstico bacteriológico son laboriosos, requieren tiempo y no todas las cepas aisladas pueden ser identificadas, contrariamente, la técnica de PCR es una metodología rápida, específica y muy sensible para detectar, identificar y caracterizar a las bacterias de dicho Género.

Objetivos

Detectar la presencia del Género Salmonella e identificar mediante subtipificación molecular a la serovariedad Enteritidis.

Identificar a S. Enteritidis, S. Dublín, S. Gallinarum, S. Typhimurium y S. Cholerasuis portadoras de plásmidos de virulencia.

Implementar la técnica de PCR como sistema de detección e identificación de Salmonella en muestras de Gallus gallus.

Metodología

Se extrajo DNA [1] de cepas liofilizadas de 25 diferentes serovariedades de Salmonella y de otros 20 Géneros bacterianos.

Se inocularon gallinas por vía oral con dosis de entre 1 y 5 x108 CFU de una cepa vacunal de S. Enteritidis (RifampicinaR + Ac. NalidixicoS) y se desafiaron a distintos tiempos post-vacunación con 5x108 CFU de una cepa S. Enteritidis patógena (RifampicinaS + Ac. NalidixicoR).

Las aves se sacrificaron a los 5, 10 y 15 días después del desafío, macerados de bazo, hígado, ovario y ciego se incubaron a 37°C en caldo Luria durante 24 hrs. Después de la incubación se centrifugaron y del precipitado celular se extrajo DNA [1].

Para control bacteriológico se usaron placas de Agar Verde brillante + 100µg de rifampicina + 100µg de estreptomicina para aislar la cepa vacunal y Agar Verde brillante + 100µg de ácido nalidíxico para aislar la cepa de desafío.

Las condiciones de la reacción de PCR y de los primeros empleados [2,3,4] fueron modificadas para:

a) Detectar Salmonella spp. (Foto Nº I).

b) Detectar cepas portadoras del plásmido de virulencia Spv (Foto Nº II y N° III).

c) Identificar a la serovariedad Enteritidis (Foto Nº IV).

d) Detectar y diferenciar las cepas de S. Enteritidis vacunal y de desafío (Foto N° V y N° VI).

Los productos amplificados fueron detectados en geles de agarosa común (1,5% ) con bromuro de etidio (10 mg/ml).

Resultados

Para Ver Fotos I-II-III-IV-V y VI: CLICK AQUÍ

Conclusiones

Detectar al Género Salmonella.

Detectar al plásmido Spv, específico de las serovariedades patógenas Enteritidis, Typhimurium, Dublín, Gallinarum y Cholerasuis.

Identificar a la serovariedad Enteritidis.

Detectar y diferenciar la cepa de S. Enteritidis desafío de la cepa vacunal.

Demostrar la inocuidad de la cepa vacunal cuyo DNA desaparece totalmente de los órganos de las aves vacunadas 2 días después de la inoculación oral.

Perspectivas

Se está estandarizando un método de diagnóstico rápido para el envío de muestras a distancia mediante la utilización de papeles absorbentes como soporte de muestras de macerados de órganos o suspensiones de hisopados cloacales.

Referencias Bibliográficas

[1] Lagatolla et al. (1996). Journal of Clinical Microbiology. 34: 2440-2443.

[2 ] Way et al. (1993). Appl. Environ. Microbiol. 59:1473-1479.

[3 ] Agron et al. (2001). Appl. Environ. Microbiol. 67:4984-4991.

[4] Chiu, C., & J. T. Ou. (1996). Journal of Clinical Microbiology. 34:2619-2622.

[5] Linde et al. (1997). Lohmann Information N°20:23-31.