Evaluación de la efectividad de flavonoides cítricos en el control de eimeria spp. En pollos broiler desafiados experimentalmente

INTRODUCCIÓN

La coccidiosis aviar es una enfermedad parasitaria de las aves de corral, causada por una o más especies de protozoos del género Eimeria. El parásito coloniza las células intestinales del hospedador con un periodo de infección que oscila entre 4-6 días, los pollos manifiestan mala absorción, pérdida de peso, plumas erizadas y diarrea con sangre, en último caso la muerte del animal [1]. La mayoría de los fármacos anticoccidiales, como la monensina y el amprolio, inhiben el crecimiento, el metabolismo y la reproducción de los coccidios. Sin embargo, el uso generalizado de estos fármacos ha provocado la aparición de resistencias a dichos principios activos [2]–[4]. Por ello, se están desarrollando alternativas naturales y sostenibles para reemplazar los fármacos anticoccidiales convencionales. El uso de productos botánicos y sus metabolitos secundarios por sus propiedades antimicrobianas y antiparasitarias se remonta a siglos atrás [5], pero su papel potencial como agente anticoccidial es relativamente nuevo [6]. El presente experimento tuvo como objetivo evaluar la efectividad anticoccidial de flavonoides cítricos en pollos infectados experimentalmente con 6 cepas de Eimeria spp.

MATERIALES Y MÉTODOS

Animales
Para este estudio, se usaron 256 pollos de engorde machos (Ross 308) de 1 día de edad, distribuidos en 4 grupos con 8 jaulas (8 pollitos por jaula). El periodo experimental fue de 23 días. Los pollos fueron criados en baterías experimentales, en una sala de aislamiento. Las baterías contaban con un sistema de calefacción integrado, que permitió la regulación de la temperatura.
Se utilizó una dieta comercial sin anticoccidiales y formulada de acuerdo con los requerimientos nutricionales para pollos de engorde del NRC (1994). Las diferentes dietas fueron preparadas en las instalaciones de producción de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile. Las aves tuvieron acceso al agua y alimento “ad libitum” y criadas en las mismas condiciones.

Grupos experimentales
Los 4 grupos experimentales fueron:

- Control negativo: dieta sin ningún anticoccidial y sin desafío.
- Control positivo: dieta sin anticoccidial y con desafío coccidial.
- Eimex Active: dieta con flavonoides cítricos (Eimex Active, 1 kg/t, fitoquímico diseñado para el control de la coccidiosis en la avicultura) y desafío coccidial.
- Anticoccidial ionóforo: dieta con narasina y nicarbacina, a 0,06 kg/t y desafío coccidial.

Infección artificial
Para los grupos Control positivo, Eimex Active y anticoccidial ionóforo, se utilizó una superdosis de una mezcla de cepas vivas vacunales de Eimeria spp., provenientes de una planta de incubación comercial. Cada dosis contenía las siguientes cepas de Eimeria spp. (vacuna Coccivac D2-MSD):

- E. acervulina (600 ooquistes pordosis)
- E. brunetti (200 ooquistes por dosis)
- E. maxima (200 ooquistes por dosis)
- E. mivati (400 ooquistes por dosis)
- E. necatrix (400 ooquistes por dosis)
- E. tenella (200 ooquistes por dosis)

Según este modelo de desafío (metodología estandarizada en el laboratorio de la Universidad de Chile), cada pollo fue desafiado con 20 veces una dosis (4,0 x 104 ooquistes de Eimeria spp./ave). La infección fue efectuada a los 14 días mediante inoculación directa en buche.

Mediciones experimentales

1. Recuento de ooquistes
Se tomaron muestras de heces para recuento de coccidios a los 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9 días post inoculación.

2. Lesiones intestinales
A los 9 días post desafío (23 días de edad), se sacrificaron todas las aves para revisar los intestinos macroscópicamente en busca de lesiones en los segmentos duodeno, yeyuno-íleon y ciego según Jonhson y Reid (1970) y utilizando una escala de
0 a 4. Para realizar el análisis, se sumaron los puntajes de cada sección para obtener un valor único por pollo (puntaje máximo de 12 puntos). La fórmula utilizada fue: Puntaje total lesiones intestinales = puntaje duodeno + puntaje yeyuno/íleon + puntaje ciego.

3. Histopatología
Además, se realizó histopatología a 1 pollo de cada repetición por tratamiento, donde se analizó la proporción de largo vellosidad:cripta en duodeno y yeyuno y altura de la mucosa del ciego. Las muestras fueron analizadas a través de 2 puntuaciones, las cuales se sumaron para dar un puntaje total que refleja daños producidos por coccidios en los tejidos.
Las muestras se prepararon y procesaron para análisis histológico con tinción de rutina Hematoxilina y Eosina y fueron analizadas en un microscopio óptico (Olympus CX31, con oculares de 10X y apertura de 20). De no observarse coccidios, se realizó una revisión de al menos 10 campos aleatorios con objetivo de 40X antes de dar por negativa la muestra (score 0 en cada parámetro). Los puntajes totales para la histopatología de los intestinos se componen del puntaje de “coccidios” (distribución y severidad) y del puntaje de “inflamación”. La fórmula utilizada fue: Puntaje total histopatología = (Puntaje distribución coccidios + Puntaje severidad de coccidiosis) + Puntaje de inflamación.

Donde:

- Puntaje distribución de coccidios (distribución en 4 campos de 10x) se estableció como: 0 = sin coccidios, 1 = 1 campo con coccidios, 2 = 2 campos con coccidios, 3 = 3 campos con coccidios y 4 = 4 campos con coccidios
- Puntaje severidad de coccidiosis (% de la vellosidad afectada) fue determinado con: 0 = sin coccidios, 1 = < 25%, 2 = 25-50%, 3 = 50-75%, 4 = > 75%.
- Puntaje inflamación se clasifico de la siguiente forma: 0 = sin lesiones microscópicas, 1 = infiltrado leve, 2 = infiltrado extensivo y edema, 3 = infiltrado extensivo y edema hasta la muscularis mucosa, y 4 = degeneración de glándulas, necrosis y hemorragia.

4. Parámetros productivos
Se evaluaron los siguientes parámetros productivos de las aves de forma semanal:

• Peso
• Ganancia de peso
• Consumo de alimento

La sintomatología clínica y mortalidad se revisó diariamente y se le realizó la respectiva necropsia para observar lesiones macroscópicas.

Análisis estadístico
Los datos fueron analizados de manera cualitativa, a través de la descripción de las variables, y cuantitativa, utilizando la prueba de ANOVA de R-Studio para determinar diferencias entre grupos y el test de comparación múltiple post hoc Tukey para determinar las diferencias entre los grupos experimentales. El valos de significacia se fijo en P< 0.05.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

1. Recuento de ooquistes
Los días 1, 2, 3 y 4 post infección, no hubo presencia de ooquistes en ninguna de las muestras. Asimismo, el Control negativo (sin desafío ni ningún tratamiento) obtuvo un valor de 0 en todos los días medidos, tal como se esperaba. El análisis del recuento de ooquistes nos indica que los pollitos que consumieron el anticoccidial convencional presentaron menor recuento de ooquistes los días 5, 6, 7 y 9 post infección, comparado con el Control positivo (P< 0.05). El grupo que consumió Eimex Active obtuvo menor recuento de ooquistes los días 6, 7 y 9 comparado con el Control positivo (P< 0.05) (Figura 1). El día 8 no se observaron diferencias entre tratamientos (P> 0.05). No obstante, a día 9, se detectó un repunte del recuento de ooquistes para el grupo Control positivo. Comparado con el anticoccidial convencional, Eimex Active no presentó diferencias estadísticas (P> 0.05) hasta el final del ensayo. Esto nos indica que Eimex Active presentó una actividad anticoccidial equivalente a narasina + nicarbacina (Figura 1)

^{Figura 1.}^{Recuento de ooquistes (ooquistes/gramo de heces) del día 5 al 9 post infección.}
^{Valores con una letra distinta son significativamente diferentes para el mismo día (P< 0.05).}

La difusión de ooquistes de Eimeria spp. en los excrementos de aves se considera generalmente como el principal parámetro para la estimación de la infección por coccidios. El análisis de los resultados del presente estudio mostró que los pollos infectados con un cóctel de Eimeria spp. y tratados, ya sea con el anticoccidial convencional o con Eimex Active, presentaron una reducción de la excreción fecal de ooquistes (P< 0.05) a partir del sexto día después de la infección artificial.
Esto demuestra que Eimex Active reduce eficazmente la excreción fecal de ooquistes en aves afectadas por coccidios.
Estos resultados son coherentes con varios estudios anteriores que han informado de una reducción eficaz de los ooquistes fecales en aves infectadas por coccidios en respuesta a productos naturales [7–9].
Los efectos positivos de productos botánicos no sólo se pueden observar en la eliminación de ooquistes, sino también en la disminución de la inflamación intestinal y mejora del estado oxidativo [10], [11]. La reducción de la invasión intestinal y la eliminación fecal de ooquistes se asocia a un daño de la fase asexual del parásito por los flavonoides que presentan propiedades antiinflamatorias, antioxidantes y antiparasitarias [8], [12]. Landi-Librandi et al. (2012) [13] indicaron que los efectos favorables ejercidos por polifenoles en animales parasitados se explican además por la reducción del estrés oxidativo como mecanismo de defensa del hospedador. De forma similar, Nweze y Obiwulu (2009) [14] observaron también que los flavonoides de Ageratum conyzoides, a razón de 1 kg/t, redujeron el estrés oxidativo, así como las lesiones intestinales causadas por E. tenella en aves de corral.

2. Lesiones intestinales
Las muestras de intestino analizadas a los 23 días de edad (9 días post infección) muestran que el Control negativo obtuvo valores 0 en todas las mediciones, tal como se esperaba. No se observaron diferencias significativas en el puntaje total de las lesiones intestinales promedio entre los grupos experimentales (P> 0.05) (Figura 2). Sin embargo, el grupo Eimex Active presentó un valor numéricamente más bajo en cuanto al puntaje de lesiones intestinales comparado con los otros tratamientos. Esto refleja sus propiedades antiinflamatorias que permitieron reducir dicho efecto.

^{Figura 2.}^{Puntaje total de lesiones intestinales promedio por grupo. Valores con una letra común no son significativamente diferentes (P> 0.05).}

Las propiedades antiinflamatorias, antioxidantes y antiparasitarias de los flavonoides [8], [12] permiten reducir el estrés oxidativo [13] reduciendo las lesiones intestinales causadas por las especies de Eimeria spp. Las evidencias indican que los fitocompuestos de las plantas, como son los flavonoides de cítricos, pueden inhibir la multiplicación de Eimeria spp., ampliar el crecimiento de bacterias beneficiosas y/o reforzar la inmunidad, lo que permite controlar la infección por
Eimeria spp. en el intestino de las aves de corral [14].

3. Histopatología
Las muestras obtenidas a los 23 días de edad (9 días post infección) indican que el Control negativo, no presentaron lesiones macroscópicas (Figura 3). El grupo Eimex Active no presentó diferencias significativas con el Control positivo ni con el grupo anticoccidial ionóforo (P> 0.05), pero sí con el Control negativo (P< 0.05).

^{Figura 3.}^{Puntaje total de histopatología promedio por grupo a 9 días post infección.}
^{Valores con una letra común no son significativamente diferentes (P> 0.05).}

En general, se observó una cantidad escasa a moderada de coccidios en las muestras estudiadas. Las formas de desarrollo identificadas incluyeron esquizontes, microgametos y macrogametos. Estas formas estuvieron presentes en el epitelio, pero también se observaron ocasionalmente en la lámina propia. La inflamación observada en todos los casos fue mínima a leve. Ésta estuvo compuesta principalmente por heterófilos, un aumento de linfocitos en la lámina propia o por la presencia de linfocitos en transmigración epitelial. No se encontraron muestras con necrosis, hemorragia, edema o infiltrado con otros leucocitos distintos a los mencionados. Frecuentemente, se encontró hiperplasia leve del epitelio de superficie y glandular, caracterizada por aumento del número de capas, contorno irregular del epitelio y numerosas figuras mitóticas en las criptas (glándulas). Estos cambios estuvieron asociados usualmente a la presencia de coccidios. En el ciego se observó leve inflamación esporádica heterofílica sin presencia de coccidios. En estas muestras se observaron también bacterias filamentosas en la superficie y especialmente en el lumen de las criptas.

4. Parámetros productivos
En cuanto a los parámetros productivos como el peso corporal, ganancia de peso, consumo de alimento e índice de conversión, no se observaron diferencias estadísticas significativas entre los grupos (P> 0.05; promedio a los 23 días: Peso vivo = 800.5 g; Ganancia de peso = 761.5 g; Consumo de alimento = 993.8 g; IC= 1.31).

Respecto al control positivo, se hubiesen esperado peores resultados provocados por la infección artificial sin aplicar tratamiento. La infección experimental fue efectiva (ver recuento de ooquistes, Figura 1), pero no fue tan agresiva como para causar mortalidad o un impacto negativo sobre los parámetros productivos. Además, cabe destacar que, en instalaciones experimentales, los animales se encuentran en condiciones ideales (menos estrés, menos densidad, ambiente tranquilo, buen manejo). Esto les puede haber ayudado a superar más fácilmente esta infección sin que aparezcan repercusiones sobre el rendimiento productivo.

CONCLUSIONES
Del presente estudio se concluye que los productos naturales como son los flavonoides de cítricos resultaron ser efectivos en reducir la eliminación fecal de los ooquistes de Eimeria spp. y las lesiones intestinales. Eimex Active es una alternativa viable a los fármacos anticoccidiales para controlar la coccidiosis en aves sin afectar negativamente el rendimiento productivo de éstas.

AGRADECIMIENTOS
Agradecemos la labor del equipo del Laboratorio de patología aviar de Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile, en especial, a Paulina Torres y a Héctor Hidalgo.