Estandarización de una PCR para detectar Fowl Adenovirus tipo 4 (FADV-4) en Farvet S.A.C.

1. INTRODUCCIÓN

El agente causal del síndrome de hepatitis-hidropericardio (HHS) es Fowl Adenovirus Tipo 4 (FAdV- 4) en aves de corral. Este virus es un miembro de la familia Adenoviridae, género Aviadenovirus y especie Fowl Adenovirus C.1 La cual se asemeja a la enfermedad llamada hepatitis por cuerpos de inclusión. El virus infecta el hígado y el riñón y causa la acumulación de un líquido de color pajizo en el saco pericárdico y un hígado y riñón pálidos y friables agrandados. Se trasmiten en forma vertical a través del tracto digestivo, los huevos pueden llegar a ser portadores del virus a partir del momento en el que la parte externa de la cáscara entra en contacto con las heces contaminadas restantes en la cloaca. La transmisión horizontal del virus ocurre cuando las heces contaminadas se diseminan a través del ambiente del galpón, para luego dar paso a la infección vía oral-fecal-oral. En este último tipo de transmisión ocasiona más de un 30% de mortalidad en pollos de engorde con 3 a 5 semanas de vida.

Actualmente, el diagnóstico presuntivo de la enfermedad HHS inicia en base a los criterios anátomo-patológicos, a través de la corroboración microscópica de la presencia de los cuerpos de inclusión intranucleares en hepatocitos. El diagnóstico definitivo se puede realizar de manera indirecta por medio de la detección de anticuerpos contra este virus. Sin embargo, el uso de estas pruebas serológicas para su diagnóstico requiere de un personal bien entrenado que ejecute correctamente la interpretación de los resultados. Todo esto debido a que se puede ocurrir también una reacción cruzada con otros anticuerpos en aves sanas.

Por las razones antes expuestas, existe la necesidad de llevar a cabo un proceso de estandarización de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para detectar el virus Fowl Adenovirus tipo 4 y una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) para cuantificar la carga viral que se encuentran en las muestras positivas dando resultados eficientemente, confiables y veraces. De esta manera se podrá actuar rápidamente para evitar pérdidas económicas en el sector avícola.

2. OBJETIVOS

2.1. GENERAL
i. Estandarizar la técnica de PCR para detectar Adenovirus aviar tipo 4 (FadV-4).

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
i. Estandarizar la técnica de PCR convencional para detectar FAdV- 4
ii. Seleccionar los sets de cebadores específicos para detectar FAdV- 4 en PCR convencional
iii. Determinar el porcentaje de sensibilidad y especificidad del set de cebador seleccionado y su concentración de amplicón en la fase de estandarización de PCR convencional.

3. METODOLOGÍA

El presente trabajo de investigación se realizó en la empresa Farmacológicos Veterinarios S.A.C. (FARVET S.A.C.) ubicada en la Panamericana Sur N° 766 Km 198.5. Chincha Alta – Ica – Perú, en el área de Cultivo Celular y Virología donde se llevó a cabo la preparación de nuestro Material de Referencia Interna (M.R.i) y en el área de Biotecnología Molecular y Genómica donde se realizó la estandarización de PCR convencional. La estandarización de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se procedió a ejecutarlo en dos (02) Fases en la empresa FARVET S.A.C. cumpliendo con los equipos de protección personal (EPP), con una temperatura ambiente menor a 25°C en cada área de trabajo y con el manual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ácido desoxirribonucleico (ADN).

3.1. FASE I: PREPARACIÓN DEL MATERIAL DE REFERENCIA INTERNA (M.R.i.)
En los ambientes del Laboratorio de Cultivo Celular y Virología, se realizó el cultivo celular en células EB66 (células madre de embrión de pato) en suspensión, se utilizó el medio GRO I (marca SIGMA) por un periodo de 48 horas a 37°C con 5% de CO₂. Una vez que el cultivo en el spinner alcanzó una cantidad de 6 x 10⁶ células/ml, se procedió a infectarlo con Fowl adenovirus tipo 4 (FAdV-4) a una multiplicidad óptima de infección (M.O.I) de 0.02. Posteriormente, el cultivo infectado se incubó a 37°C con 5% de CO₂ por un período de 6 días.

En los ambientes del Laboratorio de Biotecnología Molecular y Genómica, se extrajo 500 ml de dicho cultivo infectado para su distribución en tubos Falcon® de 15ml y 50 ml. Luego, se procedió alicuotar 13ml del cultivo infectado en tubos Falcon® de 15ml con el fin de llevar a cabo el método de purificación viral con polietilenglicol (PEG) siguiendo las especificaciones del fabricante (Abcam, Cambridge, MA, USA). Dicha metodología consistió en centrifugar las células infectadas a 3200 x g por 15 minutos a 4°C, para luego colectar el sobrenadante y agregar 2.5 ml de PEG por cada 10 ml de sobrenadante obtenido. Paso seguido, se incubó la mezclas toda la noche a 4° C, para después centrifugarlas a 3200 x g por 30 minutos a 4°C. Finalmente, se extrajo cuidadosamente el sobrenadante, el pellet viral obtenido por tubo se resuspendió en 1.5ml de buffer fosfato salino esteril 1X y se procedió a alicuotar el virus resuspendido en porciones de 500 ul en tubos de 2ml.

A partir de estas últimas alícuotas preparadas, se tomaron porciones de 200 ul y se procedió a extraer el ADN del virus resuspendido utilizando el manual de QIAamp MinElute Virus Spin Kit (de acuerdo a las especificaciones del fabricante) en las cabinas de bioseguridad. Dicho procedimiento se realizó de acuerdo al “PROTOCOLO” ya diseñado en FARVET S.A.C.

El ácido nucleico viral obtenido fue eluido en 60 uL de buffer AVE. Posteriormente, se cuantificó el ADN viral siguiendo las indicaciones del Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit (número de catálogo Q32854, Life Technologies), se utilizó el Fluorómetro Qubit 2.0 (Life Technologies - Figura 01). Esta metodología tiene la ventaja de presentar una alta sensibilidad analítica, alto rendimiento y una mayor tolerancia a los contaminantes para medir la cantidad del amplicón en el ADN extraído.

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Se calculó el grado de pureza por espectrofotometría, verificando el ratio entre las absorbancias 260 nm/280 nm , con la siguiente fórmula.

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En base a los resultados obtenidos por el método de fluorometría y el dato del tamaño total del genoma viral de FAdV-4 ?43.721 pb), se calculó el número de copias virales teóricas42 con la siguiente fórmula:

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A este ADN viral obtenido y cuantificado se denominó material de referencia interno (M.R.i.) el cual se almacenó en alícuotas de 7 ul en tubos de PCR a -80 ° C.

3.2. FASE II: ESTANDARIZACIÓN DE LA P.C.R CONVENCIONAL
En esta fase se realizaron las siguientes actividades:

3.2.1 SELECCIÓN DE CEBADORES (Primer´s) ESPECIFICOS
Para la elección de los cebadores, se realizó la búsqueda bibliográfica a partir de publicaciones en revistas científicas indexadas en la base de datos de National Center for Biotechnology Information (NCBI), las cuales fueron específicos para FAdV-4. La especificidad de dichos cebadores se evaluó con respecto a la secuencia genómica de FAdV-4 obtenidas de la base de datos del NCBI utilizando el programa bioinformático de libre acceso llamado SnapGene Viewer 4.0.3.

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Se adquirieron dichos sets de cebadores seleccionados por intermedio de la empresa IDT (Integrated DNA Technologies), éstos se encontraban liofilizados a una concentración de 100 umol/L de Molaridad, denominándolos sets de “cebadores madre” (C.M), se disminuyó la concentración de cada C.M hasta 10 umol/L a partir de la siguiente fórmula:

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Cada C.M contenía su propia cantidad de número de moles, se encontró la cantidad del volumen necesario del buffer TE 1X pH 8.0 para la elución de éstos.

3.2.2 PRUEBA DE GRADIENTE DE TEMPERATURA PARA LOS CEBADORES SELECCIONADOS
Se calculó la gradiente de temperatura de hibridación de los cebadores seleccionados, tomándose en cuenta su temperatura de fusión (Tm) se obtuvo en base a la siguiente fórmula Tm = 2(A+T) + 4(G+C).

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A partir de la nueva concentración inicial (10 umol/L) de los stocks de los C.M, se prepararon nuevas alícuotas, se tomó 20 uL de cada C.M. y se agregó 180 ul de agua de grado PCR. Dichas proporciones se realizaron en base a la aplicación de la siguiente fórmula:

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Se prepararon más alicuotas y se almacenaron a -80°C hasta su siguiente uso. Luego, se realizó la creación del programa estándar de ciclado del PCR, para los sets de cebadores seleccionados: HHS*-1, HHS*-2, HHS*-3, HHS*-4 y HHS*-5, se obtuvo diferentes temperaturas para cada columna de la placa del termociclador Mastercycler proS con un rango de temperatura de hibridación de 52 °C hasta 72 °C.

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La prueba de la gradiente de temperatura se realizó en base a las especificaciones del inserto del kit de PCR Q5® High-Fidelity 2X Master Mix (Cuadro 03), la cual fue programada con los siguientes parámetros: la desnaturalización inicial a una temperatura de 98°C por 30 segundos, seguido por un paso de 30 ciclos de una etapa de desnaturalización a 98°C por 10 segundos, una etapa de hibridación los rangos de temperatura fueron desde 52°C a 72°C (previamente establecidos) y 30 segundos de una etapa de extensión fue a una temperatura de 72°C por 25 segundos. Posteriormente fue seguido el paso de extensión final de 72°C por 2 minutos y se culminó con una temperatura de enfriamiento a 4°C el cual continuaba hasta el momento de detener la corrida manualmente. El tiempo de programación en la etapa de hibridación se basó en el tamaño de amplicón que generaron los cebadores seleccionados (HHS*-2 con 738 pb), se usó la regla de tres simple para programar el tiempo (30 segundos para 1000 pb).

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Una vez programado se procedió a preparar el Mix de reacción (Cuadro 04) con las concentraciones establecidas por el mismo protocolo, éste procedimiento se realizó en cabinas de PCR.

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Una vez diluido el volumen total del Mix en tubos de PCR se procedió a colocar cada tubo en cada columna de la placa (de izquierda a derecha - columna 01 a columna 12) del termociclador Mastercycler proS con el fin de saber la temperatura ideal para cada sets de cebadores, se visualizaron las bandas de los productos de PCR obtenidos (amplicones) en el gel de agarosa al 2% a través de la electroforesis con una carga eléctrica de 80 voltios durante 65 minutos. Dicho procedimiento se realizó de acuerdo al “PROTOCOLO de preparación de GEL DE AGAROSA” ya diseñado en FARVET S.A.C (éste protocolo fue realizado en las siguientes pruebas)

3.2.3. PRUEBA DE CONCENTRACIÓN DE CEBADORES
Una vez visualizado las bandas de los productos de PCR obtenidos (amplicones) a través de la electroforesis se eligieron los sets de cebadores que pasaron la prueba de gradiente de temperatura presentando bandas sin inespecificidades (sets de cebadores HHS*-2, HHS*-3 y HHS*-4) siendo la temperatura de hibridación seleccionada de 60°C. Luego se procedió a la preparación del Mix de reacción a diferentes concentraciones de cada sets de cebadores seleccionados partiendo desde 1 umol/L, 0.75 umol/L, 0.5 umol/L, 0.25 umol/L hasta 0.20 umol/L, por duplicado y un control negativo para cada mix (Cuadro 05). La programación estándar para los sets de cebadores seleccionados se basó en el Protocolo Q5® High-Fidelity 2X Master Mix, fue la siguiente: un paso de desnaturalización inicial una temperatura de 98°C por 30 segundos. Seguido por 30 ciclos de una etapa desnaturalización a 98°C por 10 segundos, una etapa de hibridación a una temperatura de 60°C por 30 segundos y una etapa de extensión fue de 72°C por 25 segundos. Posteriormente continuó un paso de extensión final de 72°C por 2 minutos, y culminó con un paso de enfriamiento a 4°C continuo una vez terminado el procedimiento.

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De la misma manera, los amplicones resultantes fueron evaluados en una electroforesis en gel de agarosa al 2%, con una carga eléctrica de 80 voltios durante 65 minutos, para determinar la concentración ideal para cada sets de cebadores.

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3.2.4. PRUEBA DESENSIBILIDAD
Una vez cuantificado el número de copias virales del M.R.i. se procedió a tomar un vial y se realizaron diluciones sucesivas, con el fin de saber hasta qué concentración llega la sensibilidad de cada sets de cebadores partiendo desde 10 ng/uL hasta 1ag/uL (Figura 04), este procedimiento se hizo en base a la fórmula de concentración – volumen ya mencionada:

Se procedió a colocar las diluciones sucesivas de cada sets de cebadores seleccionados HHS*-2, HHS*-3 y HHS*-4 en el termociclador Mastercycler proS el cual fue programado, se procedió hacer la electroforesis ya programada y se visualizaron las bandas en gel de agarosa al 2% con una carga eléctrica de 80 voltios durante 65 minutos. Para este procedimiento no fue necesario hacerlo a diferentes concentraciones para cada sets de cebadores, se escogieron las mejores y menores concentraciones (0.50 umol/L y 0.25 umol/L), pero finalmente se optó por trabajar con la menor concentración ideal (0.25 umol/L)

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3.2.5. PRUEBA DE ESPECIFICIDAD
Esta prueba nos permitió saber si los sets de cebadores seleccionados son específicos únicamente para detectar FAdV-4, para ello se utilizaron varias muestras positivas para diferentes virus y bacterias aviares. Los patógenos utilizados fueron: el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), virus de la bronquitis infecciosa (IBV), virus de laringotraqueítis infecciosa (ILTV), metapneumovirus aviar (AMPV), Adenovirus de aves tipo 4 (FAdV4), virus de la enfermedad de bursitis infecciosa (IBDV), virus de la anemia aviar (CAV), síndrome de caída de la postura (EDS, por sus siglas en inglés), ADN puro de células de fibroblasto de pollo (DF1), Pasteurella spp, Salmonella gallinarum, Mycoplasma spp y como blanco (agua).

Para determinar la Sensibilidad y Especificidad de cada sets de cebadores seleccionados (HHS*- 2, HHS*-3 y HHS*-4) se procedió a usar las siguientes fórmulas:

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De esta manera de determinó la proporción de muestras correctamente diagnosticada con el virus de interés por la prueba diagnóstica en estudio (PCR).

4. RESULTADOS

4.1. FASE I: PREPARACIÓN DEL MATERIAL DE REFERENCIA INTERNA (M.R.i.)
La cantidad promedio de amplicón del ADN extraído fue de 46.3 ng/ul, siendo éste el resultado del promedio entre la cantidad de amplicón en el ADN extraído y el número de veces (03) cuantificado. El ratio de la muestra de ADN fue de 1.91 teniendo un 60% de ácido Nucleico y 40% de proteínas. La cantidad del número de copias virales fue de 9.662* 107 copias virales.

FASE II: ESTANDARIZACIÓN DE LA P.C.R CONVENCIONAL

4.1.1. Se colocaron los sets de cebadores en el genoma del virus FadV-4 como se muestra a continuación:

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Ubicación en la que los cebadores se unen a su secuencia blanco. Fuente: Programa Bioinformático SnapGene Viewer 4.0.3.

4.1.2. Las corridas en geles de agarosa al 2%, en la prueba de especificidad de los cebadores seleccionados. En el siguiente cuadro se resume la expresión de las bandas del amplicón, para cada sets de cebadores con los diferentes controles patógenos.

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Las pruebas de sensibilidad y especificidad, para cada sets de cebadores HHS* -2, HHS* -3 y HHS* - 4 (Ver el procedimiento en el anexo, Cuadro 24 – Cuadro 26), fueron:

i. Para el sets de cebadores HHS* -2, su sensibilidad fue de 100% mientras que su especificidad fue de 46.15%, hasta una concentración del amplicón ≥1ng/ul.
ii. Para el sets de cebadores HHS* -3, su sensibilidad fue de 100% mientras que su especificidad fue de 100%, hasta una concentración del amplicón ≥1pg/ul.
iii. Para el sets de cebadores HHS* -4, su sensibilidad fue de 100% mientras que su especificidad fue de 91.67%, hasta una concentración del amplicón ≥1ng/ul.

4. CONCLUSIONES

i. Se logró estandarizar la técnica de PCR convencional para detectar FAdV- 4
ii. Los sets de cebadores que se seleccionaron para la detección de Adenovirus aviar tipo 4 fueron: 52K-F/52K-R (HHS* -2), 52K-fw/52K-rv (HHS* -3) y HEX-S F/HEX-S R (HHS* - 4),
iv. El sets de cebador que se seleccionó para la detección de Adenovirus aviar tipo 4 fue 52Kfw/52K-rv (HHS* -3), con una sensibilidad y especificidad de 100%, hasta una concentración del amplicón ≥1pg/ul.

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