Uso actual de las técnicas moleculares en el análisis y tipificación de microorganismos patógenos

En el presente trabajo se aborda lo referente a las técnicas moleculares, tópico que en la actualidad reviste gran importancia debido tanto al gran avance científico como tecnológico en el mundo, el cual ha permitido avanzar a la ciencia en el diagnóstico, prevención, control y curación de las enfermedades que desde épocas pasadas han afectado tanto al hombre como a los animales, ocasionándoles incluso la muerte, debido a la carencia de instrumentos y equipo moderno para combatir y erradicar dichas enfermedades.

El documento está estructurado de la siguiente manera, primeramente se hace referencia a algunos antecedentes respecto al surgimiento de la biología molecular, su importancia y contribución en la medicina y la investigación en la actualidad, y posteriormente se aborda lo relacionado propiamente a las diferentes técnicas moleculares que desde la década pasada y hasta el momento actual han contribuido a través de la tipificación de microorganismos patógenos en la vigilancia y control epidemiológico de enfermedades que afectan tanto al hombre como a los animales.

Su objetivo, consistió en describir el uso actual de las técnicas moleculares en el análisis y tipificación de microorganismos patógenos causantes de enfermedades tanto en el hombre como en los animales.


Antecedentes

La biología molecular es una disciplina relativamente joven, originada en los años 30s y los 40s, e institucionalizada en los años 50s y los 60s. El período clásico de ésta comenzó en 1953 con el descubrimiento de la doble hélice del ADN por James Watson y Francis Crick. La relación científica de Watson y Crick unificó varios acercamientos disciplinarios: Watson, estudiante de Luria y el grupo fago, reconocieron la necesidad de utilizar la cristalografía para aclarar la estructura del ADN, por lo que hicieron un uso amplio de datos a partir del trabajo de cristalografía con rayos X en ADN realizado por Maurice Wilkins y Rosalind Franklin en el King´s College, de Londres (Darden y Tabery, 2005).

Con la estructura del ADN a disposición, la biología molecular cambió su enfoque por lo que la estructura de la doble hélice ayudó a la elucidación de los mecanismos de replicación y función genética, las claves para entender el papel de los genes en la herencia. Esta investigación subsecuente fue guiada por la noción de que el gen era una molécula informativa. La secuencia linear de las bases de los ácidos nucleicos a lo largo de una hebra de ADN proporcionó la información codificada para dirigir el orden linear de aminoácidos en las proteínas (Darden y Tabery, 2005).

Posterior a lo anteriormente expuesto, el código genético vino a ser caracterizado como la relación entre un sistema de tres bases en el ADN ("un codon") y uno de veinte aminoácidos, los bloques de construcción de las proteínas. Las tentativas para desentrañar el código genético incluyeron esfuerzos teóricos fallados, así como la competencia entre los genetistas y los bioquímicos. Una brecha importante surgió en 1961 cuando los bioquímicos Marshall Nirenberg y J. Heinrich Matthaei, en los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos, descubrieron que una secuencia única de las bases de los ácidos nucleicos se podía leer para producir un producto único del aminoácido (Darden y Tabery, 2005).

En la actualidad, la aplicación de la biología molecular al estudio de la genética humana ha dado lugar a un crecimiento sin precedente en nuestro entendimiento del mecanismo básico de la enfermedad y las bases del nuevo campo clínico de la medicina molecular, ya que las bases genéticas de un gran número de enfermedades se están identificando, lo cual tendrá un impacto importante para el diagnóstico, pronóstico, y manejo confidencial de pacientes. Por lo que, un gran desafío para los servicios de patología en esta nueva era es apoyar la medicina molecular para asegurarse de innovaciones técnicas y nuevos desarrollos que pueden ser realizados como un servicio rutinario de una manera oportuna, eficiente, rentable, en beneficio de un mayor número de pacientes (Boxer, 2000).


Técnicas moleculares

Las técnicas moleculares actuales han sido desarrolladas, en solo pocos años de investigación académica básica en muchos campos de la ciencia, de tal manera que en los últimos años, seis de éstas técnicas han surgido como los métodos para el análisis y tipificación de los aislamientos bacterianos. Ellas son la huella dactilar de plasmidos o PF, el análisis de endonucleasas de restricción de ADN de plasmidos o REA; el análisis de endonucleasas de restricción de ADN cromosómico utilizando enzimas de corte y electroforesis convencional; el Polimorfismo de largos fragmentos de restricción o RFLP utilizando análisis de pruebas de ADN; La electroforesis en gel de campos pulsantes o PFGE; y el AP-PCR y otras técnicas relacionadas con la tipificación basada en la amplificación de ácidos nucleicos (Tenover et al., 1997).

La tipificación puede proporcionar información sobre la distribución de tipos microbianos en poblaciones humanas y animales, lo cual puede ser aplicado en programas de vigilancia a nivel local, regional, nacional o global. De especial interés pueden ser el monitoreo de marcadores asociados con la patogenicidad, inmunogenicidad o resistencia a medicamentos, como se demuestra por ejemplo en la vigilancia del cólera con la emergencia de una nueva cepa epidémica en Asia.

En síntesis, esta aplicación puede incluir análisis periódicos para la detección de grupos de patógenos con tipos similares y de origen común en espacio y tiempo, para mejorar las advertencias anticipadas de brotes potenciales. Asimismo, puede ayudar en la planeación de servicios de salud e intervenciones preventivas como desarrollo de vacunas y programas de inmunización.

Estas técnicas también pueden ser usadas en estudios clínicos para la delineación de patrones de colonización y para la identificación de fuentes de transmisión de microorganismos infecciosos, lo cual puede contribuir a un entendimiento de la epidemiología y patogénesis ayudando con ello al desarrollo de estrategias de prevención de enfermedades (Struelens y MESGEM, 1996).


La Huella Digital de Plasmidos (PF)

La huella digital de plasmidos fue la primera técnica molecular utilizada como una herramienta de tipificación. Los plasmidos son elementos de ADN extracromosómico que están presentes en muchos aislamientos clínicos y pueden ser identificados por simples procedimientos de lisis de células seguidos de electroforesis en gel de los lisados. El número y tamaño de los plasmidos presentes es utilizado como base para la identificación de cepas. Esta técnica de tipificación de cepas ha sido utilizada con éxito en el análisis de brotes de infecciones nosocomiales y en infecciones adquiridas en comunidad causadas por una variedad de especies de bacterias gram-negativas (Tenover et al., 1997).

En general esta técnica es más utilizada para estudios epidemiológicos que están limitados tanto temporalmente como geográficamente y puede complementar otras técnicas como la PFGE, para proporcionar una base para diferenciar aislamientos que están relacionados genotípicamente pero que están separados epidemiológicamente por periodos moderados de tiempo, como a varios meses (Tenover et al., 1997).


Analisis de Endonucleasas de Restricción de ADN de Plasmidos (REAP).

En la actualidad esta técnica es utilizada principalmente como una alternativa para los aislamientos de estafilococos que contienen frecuentemente plasmidos múltiples, y para seleccionar especies de Enterobacteriaceae que tienen a menudo grandes plasmidos característicos. Algunas cepas de bacterias contienen solamente un plasmido grande, de un rango de tamaño de 100 a 150 Kilobases (kb). Debido a que es difícil de diferenciar plasmidos en este rango de tamaño, especialmente los que varían solamente de 10 a 15 kb, algunos investigadores han adicionado una endonucleasa de restricción para aumentar el poder de discriminación de la electroforesis en gel de agarosa. Esto puede ser útil cuando los plasmidos grandes producen muchos fragmentos de restricción que puede hacer la interpretación más difícil, especialmente cuando están presentes plasmidos múltiples grandes (Tenover et al., 1997).

Actualmente, la REAP ha mejorado en su reproducibilidad y poder de discriminación por lo que es la técnica preferida de tipificación de plasmidos y es de particular interés para la realización de estudios epidemiológicos de infecciones institucionales con organismos resistentes a múltiples antibióticos. Utilizado conjuntamente con delineación clonal por tipificación de ADN cromosómico, es esencial para localizar la diseminación de genes de resistencia antibiótica móviles como los que codifican los beta-lactamasa de amplio espectro (Struelens, 2001).


Análisis del Polimorfismo de Largos Fragmentos Amplificados (AFLP)

Una de las técnicas nuevas y más promisorias es el AFLP desarrollado por Keygene BV, Wageningen, de Nueva Zelanda. Este método combina una aplicabilidad universal con alto poder de discriminación y reproducibilidad. Un gran número de reportes describen el uso de esta técnica para plantas y mapeo genético animal, diagnósticos clínicos, estudios filogenéticos, y tipificación de bacterias (Savelkoul et al., 1999).

Está basada en la detección de fragmentos de restricción genomica por amplificación con reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y puede ser utilizada para ADNs de cualquier origen o complejidad. La técnica comprende tres pasos: 1) la restricción del ADN y la ligazón de adaptadores oligonucleótidos, 2) la amplificación selectiva de juegos de fragmentos de restricción, y 3) análisis del gel de los fragmentos amplificados (Vos et al., 1995; Savelkoul et al., 1999; Struelens, 2001).

El ADN es cortado con enzimas de restricción, y los adaptadores de la doble hebra están ligados al final de los fragmentos del ADN para generar la plantilla de ADN para amplificación. La secuencia de los adaptadores y el sitio de restricción adyacente sirve como sitios de unión de los primer para la subsecuente amplificación de los fragmentos de restricción (Vos et al., 1995).

Para el análisis del AFLP solamente se necesita una pequeña cantidad de ADN genomico purificado; este es digerido como ya se menciono con dos enzimas de restricción , una con una frecuencia media de corte (como la EcoRI) y una segunda con una alta frecuencia de corte (como la MseI o TaqI) (Savelkoul et al., 1999). La infrecuente restricción de los sitios de amplificación, o IRS-PCR, es otra variación de esta propuesta que esta basada en la amplificación selectiva de secuencias de ADN con sitios de restricción infrecuentes a los lados.

Tiene un alto poder discriminatorio que se ajusta fácilmente y un muy buen nivel del patrón de reproducibilidad para un amplio rango de bacterias patógenas tanto Gram positivas como negativas (Struelens, 2001).


Técnica de electroforesis en gel de campos pulsantes (PFGE)

La electroforesis en gel de campos pulsantes (PFGE por sus siglas en inglés) fue descrita en 1984 como una herramienta para examinar el ADN cromosómico de organismos eucariotas. Ha sido uno de los progresos más útiles de la epidemiología molecular en las décadas pasadas; emerge en los 90´s como una técnica de la huella dactilar considerada el estándar de oro para la tipificación molecular de microorganismos, ya que ha demostrado que es altamente efectiva para muchas especies bacterianas tanto gram-positivas como los estafilococos, enterococos, y mycobacterias y gram-negativas como la E. coli, otras Enterobacteriaceae, y pseudomonas (Maslow et al, 1993; Goering, 1993; Tenover et al., 1994; Struelens y MESGEM, 1996; Tenover et al., 1997; Goering, 2000; Struelens, 2001; Warner y Onderdonk, 2003).

En general, la PFGE es una de las técnicas de tipificación más reproducibles y altamente discriminatorias en comparación con otras técnicas moleculares (Maslow et al, 1993; Goering, 1993; Tenover et al., 1994; Struelens and MESGEM, 1996; Tenover et al., 1997; Warner and Onderdonk, 2003).

En esta técnica, el genoma bacteriano, que típicamente es de 2,000 a 5,000 pares de kb en tamaño, es digerido con una enzima de restricción que es relativamente de pocos sitios de reconocimiento y que genera aproximadamente de 10 a 30 fragmentos de restricción que van de 10 a 800 kb. Todos estos fragmentos pueden ser separados como un patrón de distintas bandas por PFGE, usando una cámara diseñada especialmente que cambia de posiciones en el gel de agarosa entre tres juegos de electrodos que forman un hexágono alrededor del gel (Tenover et al., 1997; Warner y Onderdonk, 2003).

La preparación del ADN genomico y la macrorestricción son llevados a cabo en bacterias que se ensamblan en los pozos de agarosa. Utilizando unidades de electroforesis programables especiales, los cambios de orientación periódica de los campos eléctricos o electroforesis en gel de campos pulsantes, permiten la separación y determinación del tamaño de los fragmentos de macrorestricción.

La PFGE escanea más del 90% del cromosoma para reordenar fragmentos de gran tamaño tales como duplicaciones, cancelaciones, o inserciones de secuencias que se detectan como un cambio en el tamaño o número del fragmento (Struelens, 2001).

Los patrones de restricción del ADN de los aislamientos en estudio son comparados unos con otros para determinar sus relaciones. Algunos resultados con esta técnica pueden llevar a conclusiones diferentes entre laboratorios, como por ejemplo, que los aislamientos puedan ser designados como relacionados con brotes o no relacionados con brotes de alguna enfermedad (Tenover et al., 1995).

Las principales dificultades asociadas con esta técnica son las relacionadas a las demandas técnicas del procedimiento y costos iniciales del equipo. La preparación de ADN genomico apropiado requiere de 1 a 3 días, dependiendo de los organismos a examinar, y los costos del equipo requerido (incluyendo el aparato de electroforesis y el transiluminador) varia entre 10, 000 y 20,000 dólares. Sin embargo, el método es operacional en el laboratorio, y puede ser aplicado a un amplio rango de especies con solo un mínimo de modificaciones (Tenover et al., 1997).


La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) es una técnica que se utiliza comúnmente en los laboratorios de investigación médicos y biológicos para amplificar (crear copias múltiples de) el ADN, sin utilizar un organismo vivo, tal como la E. coli o una levadura. Asimismo, se emplea en una variedad de tareas, tales como la detección de enfermedades hereditarias, la identificación de huellas digitales genéticas, diagnóstico clínico, análisis forense del ADN, detección de patógenos en el hombre, animales, plantas, y alimentos, e investigación en biología molecular (Saunders et al., 2001).

La PCR fue inventada a principios de los 80´s por Kary Mullis, al cual le fue otorgado el premio Nobel en química en octubre de 1993 por este logro, siete años después de haber publicado sus primeras ideas. La idea de Mullis fue la de desarrollar un proceso a través del cual el ADN se pudiera multiplicar artificialmente a través de ciclos repetidos duplicados llevados a cabo por una enzima llamada ADN-Polimerasa.

La ADN-Polimerasa se produce naturalmente en los organismos vivos, donde funciona para duplicar el ADN cuando las células se dividen. Trabaja uniéndose a una sola hebra de ADN y creando una hebra complementaria.

El proceso original de PCR actualmente ha sido mejorado mediante el uso de la ADN-Polimerasa que procede de una bacteria termofilica que vive a temperaturas arriba de 110 °C (en aguas termales). La ADN-Polimerasa o Taq polimerasa tomada de estos organismos es termoestable (estable en las altas temperaturas).

Actualmente la Taq polimerasa se utiliza frecuentemente en la práctica de PCR. Una desventaja de la Taq es que incurre a veces en equivocaciones al copiar el ADN, conduciendo a mutaciones (errores) en la secuencia del ADN (Saunders et al., 2001).

La PCR que ha sido utilizada por varios años para la detección directa de muchos tipos de agentes infecciosos en muestras clínicas, ha sido adaptada para ser usada como una herramienta de tipificación. La ventaja de la PCR es su habilidad para producir literalmente millones de copias de un segmento de ADN particular con alta fidelidad en un tiempo de 3 a 4 horas (Tenover et al., 1997).

El procedimiento requiere una plantilla de ADN que puede estar presente en la muestra en pequeñas cantidades; dos primers oligonucleótidos que flanquean las secuencias de la plantilla de ADN que va a ser amplificado; y una DNA-polimerasa estable al calentamiento. Un ensayo típico de PCR requiere aproximadamente de 3 horas para completar 30 ciclos, donde cada ciclo consiste de una fase de desnaturalización, en donde la doble hebra de ADN es fundida en hebras únicas; una fase de alineación, en donde los primers se unen a las secuencias blanco en las hebras separadas; y una fase de extensión, en donde la síntesis de ADN procede de los primers a partir de cada hebra de la plantilla de ADN, generando dos nuevas copias de la doble hebra de la plantilla original. Después de cada 30 ciclos , una sola copia inicial de la plantilla de ADN teóricamente puede ser amplificado a 1 billón de copias (Tenover et al., 1997; Saunders et al., 2003).

El uso válido de esta técnica es crítico para mantener la calidad de muchas bases de datos de ADN producidas. Es un hecho establecido que diversos factores pueden influenciar la validez de los resultados obtenidos por PCR, incluyendo la presencia de componentes inhibitorios, la calidad de la plantilla de DNA, y la carencia de optimización con respecto a componentes de la reacción y las condiciones de los ciclos termales.

Todos estos factores pueden comprometer la especificidad y sensibilidad de la reacción, pudiendo llevar a resultados falsos-negativos, falsos-positivos, o no reproducibles. Pero menos conocido, sin embargo, es la variación de los resultados en la PCR atribuidos debido al subóptimo funcionamiento de los termocicladores, siendo este el aspecto particular de la técnica que constituye las bases de los estudios interlaboratorios (Saunders et al., 2003).


La Reacción en Cadena de la Polimerasa con Primers Arbitrarios (AP-PCR)

Esta técnica simple y rápida ha sido sucesivamente aplicada para la delineación de cepas genotípicas y análisis de poblaciones genéticas de un amplio rango de patógenos microbianos, incluyendo bacterias, hongos y protozoarios (Struelens, 1998).

La discriminación es buena y puede correlacionarse con otras técnicas de genotipificación. El poder discriminatorio es variable de acuerdo al número y secuencia de los primers arbitrarios y a las condiciones de amplificación. Aunque requiere de varios factores técnicos para ser estrictamente estandarizado para una reproducibilidad óptima.

La tipificación con esta técnica, y con métodos similares como el RAPD y el DAF, están basados en la amplificación por PCR de baja astringencia utilizando un primer simple de secuencia arbitraria, típicamente de 10 pares de bases. Después de varios ciclos adicionales, se obtiene una cepa específica de segmentos de ADN amplificados de varios tamaños (Struelens, 1998).

Los productos resultantes del PCR pueden representar una variedad de fragmentos de ADN de diferentes tamaños que son visualizados a través de electroforesis en gel de agarosa. Reportes recientes han descrito condiciones y primers específicos para analizar aislamientos de Staphylococcus aureus (Ternover et al., 1997).

En la actualidad es considerado el método más adecuado para una tipificación comparativa rápida, pero inadecuado para bibliotecas de tipificación en programas de vigilancia epidemiológica.


Análisis de la secuencia de los nucleótidos

La secuenciación de nucleótidos de genes amplificados por PCR es el medio más preciso y sensitivo de indexar el polimorfismo del ADN localizado para la tipificación de cepas bacterianas. Sin embargo, el tiempo requerido y los costos del procedimiento actualmente limitan el uso de este método cuando se ha aplicado a varios tipos de virus como el de la hepatitis y el VIH, pero también a bacterias como los Streptococcus pyogenes. Con el rápido progreso de la automatización, es probable que en los siguientes años la resecuenciación con PCR pueda ser utilizada para la tipificación epidemiológica de virus, bacterias y otros patógenos (Struelens, 1998).


Conclusiones

El continuo crecimiento exponencial de la comprensión de las bases genéticas moleculares de la enfermedad humana y animal ha sido apoyado por los progresos tecnológicos en el desarrollo de nuevas técnicas moleculares que han venido a substituir los métodos intensivos de trabajo empleados previamente.

Estas nuevas técnicas moleculares en la actualidad le han permitido a los científicos tener un gran avance en el área de la medicina como de la investigación, ya que gracias al desarrollo de estas técnicas es que se ha logrado llevar a cabo la producción de medicamentos y vacunas para combatir una serie de enfermedades, incluso incurables, que afectan desde hace tiempo tanto al hombre como a los animales de manera individual como colectiva.

Si bien es cierto pues, los avances en la comprensión de las bases biológicas de la biodiversidad microbiana a nivel de subespecies puede mejorar el marco conceptual requerido para una apropiada interpretación epidemiológica de los resultados de tipificación. Por lo que una adecuada y más amplia aplicación de estas técnicas puede dar luz a la epidemiología de infecciones adquiridas por el hombre y/o animales, permitiéndole con ello tener un control más eficaz de estas, así como llevar a cabo mejores estrategias de prevención.


Referencias