Serotipos prevalentes del virus de bonquitis infecciosa en México durante 2015, Alternativas de control

Introducción

La Bronquitis Infecciosa (BI) es una enfermedad de etiología viral que afecta a las aves comerciales, con elevada morbilidad y baja mortalidad. Su importancia radica en las pérdidas económicas que ocasiona cuando interactúa con agentes secundarios bacterianos o virales.

El virus de BI pertenece a la familia Coronaviridae , del género Coronavirus que es un virus ARN de cadena sencilla y tiene cuatro proteínas estructurales principales (S subdividida en S1 y S2, E, M y N), de las cuales la proteína S1 desempeña un papel importante en la variabilidad y antigenicidad del virus, así como para su identificación, determinación de cepas variantes y estrategias de control.

Los primeros reportes del virus de BI fueron en 1931 por Schalk y Hawn (Fabricant, 1998), pero fue hasta 1956 que se demostró que existían diferencias antigénicas entre los aislamientos de virus (Junherr, 1965). El factor más influyente para el diagnóstico y control de la BI es la gran variedad de serotipos reportados. Cabe mencionar que desde la década de 1960 se han encontrado más de 50 serotipos, siendo el más común en todo el mundo el serotipo Massachusetts identificado desde 1951. Tal variación se debe a la gran capacidad de mutación espontánea y recombinación genética del virus (Cavanagh y Gelb, 2008).

En México se confirmó la presencia del virus en 1962 en aves con signos de enfermedad respiratoria, desde entonces los serotipos de más frecuente presentación han sido el Massachusetts y Connecticut, sin embargo desde hace ya varios años que existen reportes que indican la presencia del serotipo Arkansas en el país (Marquez 1980), el cual aún es considerado como exótico por las autoridades mexicanas.

Durante 2015, el Laboratorio de Biología de Investigación Aplicada, S.A. de C.V. (IASA) identificó recurrentes problemas respiratorios en pollo de engorda de distintas zonas del país, generalmente en aves de 28 a 35 días de edad, con signología como: disnea, estertores, estornudos, tapón caseoso en la bifurcación de la tráquea, baja ganancia de peso, e incremento de la mortalidad. Se ha logrado identificar y confirmar que el virus de BI estuvo presente en estos casos clínicos, los cuáles a su vez se complican con otros agentes patógenos exacerbando los cuadros respiratorios y la mortalidad.

Está documentado que el uso de vacunas a virus vivo contribuye a la presentación de reacciones postvacunales severas, brotes de campo inducidos por virus vacunales, además de ser responsables del surgimiento de variantes antigénicas al ocurrir una recombinación entre las cepas vacunales y las cepas de campo. (Kusters, 1990). Para la protección del virus de BI, la respuesta inmune y la resistencia al desafío se da principalmente a nivel local por la presencia de IgA en mucosas (Toro et al , 1996), así mismo se ha puesto en duda si la inmunidad humoral es importante para la protección (Da Silva e t a l , 1991).

Material y Métodos

Investigación de los serotipos del virus de BI prevalentes en campo:

Durante el año 2015, fueron recibidos en el Laboratorio de Biología de Investigación Aplicada, S.A. de C.V. ubicado en Tehuacán, Puebla, muestras de órganos como son tráquea y pulmón de aves con signología clínica sugerente a BI, tales como son: disnea, estertores, estornudos, tapón caseoso en la bifurcación de la tráquea, baja ganancia de peso, e incremento de la mortalidad.
Las muestras de órganos fueron analizadas mediante la prueba de PCR (reacción en cadena de la polimerasa), a fin de determinar la presencia de material genético del Coronavirus causante de dicha enfermedad. De manera paralela, las muestras de órganos fueron destinadas al ensayo de aislamiento viral en embrión de pollo.
A todas las muestras positivas al aislamiento viral se les realizó la secuenciación genética, en la cual mediante la técnica de RT-PCR, el ARN viral fue amplificado empleando un conjunto de iniciadores o primers (oligonucleótidos) específicos para un segmento significativamente antigénico del gen que codifica para la proteína S1 del virus de la BI. El producto del PCR fue subsecuentemente secuenciado empleando el método T a q F S D y e T e r m i n a t o r C y c l e Sequencing Fuorescence - Based Sequencing . El análisis de las secuencias obtenidas fueron ensambladas y alineadas utilizando el programa bioinformático Geneious .

Evaluación de alternativas de control:

Esta evaluación fue realizada por el Departamento de Desarrollo de Nuevos Productos de Investigación Aplicada, S.A. de C.V.
Se empleó una vacuna experimental en solución acuosa conteniendo virus de BI serotipo Arkansas inactivado, de una cepa de campo del año 2010 identificado como Mex-02-10-IB-10, formulada con un adyuvante especializado para la estimulación inmunológica de las mucosas.
La vacuna a virus inactivado Arkansas fue comparada con una vacuna a virus vivo comercial conteniendo los serotipos Massachusetts y Connecticut del virus de BI.
Se alojaron 30 aves libres de patógenos específicos de 1 día de edad, en 3 Unidades de aislamiento tipo Horsfall Bauer (10 aves x unidad).
Al Grupo 1 (vacuna a virus inactivado Arkansas) al día 1 y 12 de edad se les aplicó la vacuna vía aspersión en gota fina de 20 micras de tamaño (aspersor marca Biofogger), a dosis de 0.5 mL/ aves. Al Grupo 2 (vacuna a virus vivo Mass+Conn) al día 7 de edad se les aplicó la vacuna por vía ocular. El Grupo 3 (control) no fue vacunado.
A los 33 días de edad todas las aves fueron desafiadas con 103.7 DIE por cada 0.03 mL por vía intranasal de cepa patógena Mex02-10-IB-10 de virus de BI cepa Arkansas, homóloga al virus contenido en la vacuna a virus inactivado aplicada por aspersión fina.
A los 4 días post-desafío se sacrificaron todas las aves, obteniéndose hisopos traqueales en condiciones estériles. De cada hisopo y de cada grupo, se inocularon embriones de pollo libres de patógenos específicos de 10 días de edad, para reaislamiento viral de BI. Se contabilizó la mortalidad causada específicamente por el virus de BI, así como los embriones con lesiones atribuibles al mismo virus como: enanismo, falta de emplume, hemorragias y lesiones en patas.

Resultados

Investigación de los serotipos del virus de BI prevalentes en campo:

Durante 2015 se obtuvieron 63 aislamientos positivos a partir de casos de campo con signología y detrimento en los parámetros productivos atribuibles al virus de Bronquitis Infecciosa.
De los 63 aislamientos: 52 aislamientos fueron identificados mediante secuenciación genética como serotipo Arkansas (82.5%), 3 aislamientos como serotipo Massachusetts (4.7%) y 2 aislamientos como serotipo BL-56 (3.1%). El resto, 6 aislamientos (9.7%), no pudieron secuenciarse por diferentes razones, por lo que no fue identificado el serotipo.
Los 52 aislamientos secuenciados e identificados como serotipo Arkansas guardan una similitud filogenética de la proteína S1 del 96.9 al 98.8% respecto a la proteína S1 de las cepas de referencia Ark99 y Ark DPI, así como de la cepa de campo Mex-02-10-IB-10 empleada para la vacuna experimental acuosa a virus inactivado Arkansas y empleada para la prueba de desafío y reaislamiento viral.

Evaluación de alternativas de control:

Se observaron signología leve como estornudos en las aves del Grupo 3 (control) después de 4 días post-desafío, en las aves de los Grupos 1 y 2 no se notó signología evidente.
Al obtener los hisopos traqueales, en el Grupo 3 (control) desafiado se encontró presencia de moco y petequias en el 60 % de las aves; en los Grupos 1 y 2 el número de aves con presencia de moco y petequias fue del 10 y 40 %, respectivamente.
Con respecto al reaislamiento viral de BI en hisopos traqueales después de 4 días postdesafío: El Grupo 1 (vacuna a virus inactivado Arkansas) tuvo 18%b de reaislamiento (82% de protección), el Grupo 2 (vacuna a virus vivo Mass+Conn) tuvo 60%a de reaislamiento (40% de protección), mientras que el Grupo 3 (control) tuvo 82.2%a de reaislamiento (17.8% de protección). Cuadro 1.
Existe diferencia estadísticamente significativa entre los resultados del Grupo 1, respecto a los Grupo 2 y 3, mientras que no existe diferencia estadísticamente significativa entre los Grupos 2 y 3 (prueba de Tukey, P<0.05, Statistix 9.0).

Discusión

En México, de manera tradicional, desde 1962 se considera que los serotipos prevalentes son Massachusetts y Connecticut, mismo criterio aceptado por las autoridades mexicanas, sin embargo, Márquez (1980) reportaba la presencia del serotipo Arkansas y de manera similar, Ramírez G. y cols. (2012) reportaron la presencia de aislamientos del serotipo Arkansas en muestras obtenidas a partir de aves de traspatio en Yucatán.

La presencia y hallazgos de cepas variantes ha sido una constante; Escorcia y cols. (2000) reportaron la presencia de cepas variantes en la región Bajío de México, determinando que no pertenecían a los serotipos Massachusetts y Connecticut, así como tampoco al serotipo Arkansas.

Respecto a hallazgos de cepas variantes, también Jackwood (2012), menciona que alrededor del mundo se han identificados diferentes serotipo y genotipos del virus y que en su mayoría no presentan protección cruzada; así como los nuevos tipos de virus surgen debido a mutaciones y recombinación en el genoma viral. Jackwood (2012), coincide en que la tipificación genética que implica la amplificación y análisis de secuencias del gen de la glicoproteína S1, permite comparar la relación de un gran número de virus aislados en un período corto de tiempo, mismo método empleado en este estudio para identificar y clasificar los aislamientos virales en campo como lo muestran los resultados de este estudio, en 2015 en México, el serotipo Arkansas es el serotipo de mayor presencia como agente etiológico hallado en problemas clínicos respiratorios en pollos de engorda en el campo con 52 de 63 aislamientos (82.5%) obtenidos. En Estados Unidos en la primera década del siglo XXI, 2000 a 2010 el serotipo Arkansas fue el mayormente presente en aves comerciales, Toro (2010), atribuye esta adaptación exitosa del serotipo Arkansas a una alta variabilidad genética y fenotípica, así como a un posible sinergismo con problemas de inmunodeficiencia en las aves. Así mismo, Toro les atribuye a las cepas de las vacunas a virus vivos, ser causa de parte del problema de la persistencia de este serotipo en campo e indica que la mejora de este tipo de cepas en las vacunas es necesaria para un control eficaz de la enfermedad.

En 2013, Roh y cols. Indican que el uso de una vacuna de serotipo homólogo al virus de desafío, incrementa la eficacia de la vacuna en el campo. El uso de cepas vacunales homólogas al virus de desafío, es importante debido a que las variaciones genéticas de las diferentes cepas, en la proteína S del virus, además de determinar diferencias en la capacidad de replicación viral, patogenicidad y tropismo tisular, determinan la antigenicidad e inmunogenicidad de cada cepa viral de acuerdo con Zhao y cols. (2014), y a lo ya señalado por Jackwood (2012) de la gran cantidad de variante virales que no presentan protección cruzada. En México, el control de la BI se basa en un esquema dual de vacunación empleando vacunas a virus vivo de las cepas Massachusetts y Connecticut, combinadas con vacunas a virus inactivado en emulsión de las mismas cepas vacunales con el elevado riesgo de surgimiento de variantes antigénicas al ocurrir una recombinación entre las cepas vacunales y las cepas de campo (Kusters, 1990).

La aplicación de virus vivo por aspersión no ofrece los mejores resultados de eficacia ante desafío como lo demostró Deville y cols. (2012) al solo obtener una protección del 60 a 70%, incluso empleando adyuvantes de las mucosas. Peeters y cols. (2015), demuestran que la inmunización empleando virus inactivado vía pulmonar, ofrece una protección del 100%. Lo que coincide con Coria (1973), quién aplicó una vacuna de BI inactivada aplicada por aspersión, encontrando una mayor protección empleando virus vacunal homólogo.

La vacunación con virus inactivado homólogo al virus de desafío aplicado aspersión fina, es una alternativa ante los desafíos actuales con el virus de BI de serotipo Arkansas, ya que tiene como beneficios principales: la aplicación masiva de la vacuna con la consecuente disminución de costos por mano de obra, disminución del estrés en las aves por un menor manejo, disminución de la excreción viral, ausencia de reacciones postvacunales y eliminación del riesgo de surgimiento de variantes antigénicas del virus.

Referencias

Cavanagh, D. & Gelb, J. (2008). Infectious bronchitis. D i s e a s e s o f P o u l t r y . 12th edition. Ames, IA. Blackwell Publishing, Ames, Iowa. Pp 117-135.

Coria, M.F. (1973). Protective effect of an inactivated avian coronavirus vaccine administered by aerosol. A r c h i v e s o f V i r o l o g y . Vol. 41, Pp 66-70.

Da Silva, M.N.R., Mockett, A.P.A., Barrett, A.D.T., Cook, J.K.A. (1991). IgM responses in chicken serum to live and inactivated infectious bronchitis virus vaccines. Avian Diseases . Vol. 35, Pp 470-475.

Deville, S. Arous, J., Bertrand, F., Borisov, V., Dupuis, L. (2012). Efficacy of intranasal and spray delivery of adjuvanted live vaccine against infectious bronchitis virus in experimentally infected poultry. Procedia in Vaccinology . Vol. 6, Pp 85-92.

Escorcia, M., Jackwood, M.W., Lucio, B., Petrone, V., Lopez, C., Fehervari, T.,.Tellez, G. (2000).

Characterization of Mexican strains of avian infectious bronchitis isolated during 1997. Avian Diseases . Vol. 44, Pp 944-947.

Fabricant, J. (1998). The early history of Infectious Bronchitis. Avian Diseases . Vol. 42, No. 4 (Oct. – Dec., 1998), Pp 648-650.

Jackwood M.W. (2012). Review of infectious bronchitis virus around the world. Avian Diseases . Vol. 56, Pp 634-641.

Junherr, E.L., Chomiak, B.S., Luginbuhl, R.E. (1956). Inmunologic differences in strains of Infectious Bronchitis. U.S.L.S.A. A n n u a l M e e t i n g Proc . 60: 203-209.

Kusters, J.G., Jager, E.J., Niesters, H.G.M., Zeijst, B.A.M. van der. (1990). Sequence evidence for RNA recombination in fields isolates of avian coronavirus infectious bronchitis virus. Vaccine . Vol. 8, Pp 605-608.

Márquez, M.A. (1980). Diagnóstico de las cepas variantes del virus de la Bronquitis Infecciosa Aviar.

Peeters, B., Tonnis, W., Murugappan, S., Rottier, P., Koch, Guus., Frijlink, H., Huckriede, A., Hinrichs, W. (2015). Pulmonary immunization of chickens using non-adjuvanted spray-freeze dried whole inactivated virus vaccine completely protects against highly pathogenic H5N1 avian influenza virus. Central Veterinary Institute Wageningen, Netherlands. Póster presentado en el 9th International Symposium on Avian Influenza, Athen, GA.

Ramirez, G.S., Gutierrez, E., Arana, F., Rodriguez, R., Bolio, M. (2012). Isolation and antigenic characterization of infectious bronchitis from backyard chickens in Yucatan, Mexico. I n t e r n a t i o n a l R e s e a r c h J o u r n a l o f A g r i c u ltural

Science , Soil Science. Vol. 22(2), Ps 63-67.

Roh, H., Hilt, D., Williams, S., Jackwood, M. (2013). Evaluation of infectious bronchitis virus Arkansas-type vaccine failure in commercial broilers. Avian Diseases . Vol. 57, Pp 248-259.

Toro, H. (2010). Infectious bronchitis virus: Dominance of ArkDPI-type strains in the United States broiler industry during the last decade. Revista Brasileira de Ciência Avícola . Vol. 12 (2), Pp 79-86.

Toro, H., Godoy, V., Larenas, J., Reyes, E., Kaleta, E.F. (1996). Avian Infectious Bronchitis: viral persistence in the harderian gland and histological changes after eyedrop vaccination. Avian Diseases . Vol. 40, No. 1 (Jan. – Mar., 1996), Pp 114-120.

Zhao, F., Han, Z., Zhang, T., Shao, Y., Kong, X., Ma, H., Liu, S. (2014). Genomic characteristics and changes of avian infectious bronchitis virus strain CK/CH/LDL/971 after serial passages in chicken embryos. Intervirology . Vol. 57, Pp 319-30.

Figura 1. Árbol esquemático que muestra la relación filogenética de la proteína S1 de aislamientos de campo del virus de BI respecto a aislamientos de años anteriores y cepas de referencia.

Serotipos prevalentes del virus de bonquitis infecciosa en México durante 2015, Alternativas de control - Image 1

Serotipos prevalentes del virus de bonquitis infecciosa en México durante 2015, Alternativas de control - Image 2

Serotipos prevalentes del virus de bonquitis infecciosa en México durante 2015, Alternativas de control

Special Nutrients

ADM Aditivos