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Panorama General de la Colibacilosis Aviar en los Altos Jalisco

Publicado: 30 de noviembre de 2012
Por: Carlos Rodriguez Molina (Laboratorio de Investigación Pecuaria y Patología SA de CV.), Navarro Ocaña Armando (Departamento de Salud Pública, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México) y Cecilia Rosario Cortes (Depto. Producción Animal: Aves, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México)
Resumen

RESUMEN

La colibacilosis aviar representa uno de los principales problemas económicos en la avicultura alrededor del mundo. Tradicionalmente, estas infecciones se han controlado mediante el uso de antimicrobianos, pero la resistencia de Escherichia coli a estos, dificulta su control. Otra alternativa para controlar estas infecciones ha sido mediante el uso de vacunas o bacterinas, pero debido a la gran diversidad que existe en E. coli, y a que no se lleva a cabo una protección cruzada entre los diferentes serogrupos, es imposible elaborar un biológico capaz de conferir protección cruzada contra serogrupos heterólogos. El criterio que se ha utilizado durante muchos años para diferenciar a las E. coli patógenas de las comensales, ha sido la determinación del antígeno somático, pero también es necesario conocer la fórmula antigénica completa, así como conocer si poseen genes de virulencia, que en la mayoría de los casos son más prevalentes en cepas patógenas, permitiendo así detectarlas y caracterizarlas. En este estudio, se caracterizaron 88 aislamientos de E. coli provenientes de aves reproductoras pesadas y ligeras, gallinas de postura pesadas y ligeras, así como de pollo de engorda. La caracterización consistió en la serotipificación de las cepas, prueba de sensibilidad antimicrobiana y detección por PCR de 6 genes de virulencia (iucD, cdtB, irp2, tsh, ipaH, iss). El resultado de la serotipificación arrojó que los serogrupos más frecuentes fueron O8 (16%), OND (10.2%) O19 y OR (4.5%), O11, O102, O2, O7, O78 y O9 (3.4%). En los resultados de los antibiogramas se encontró que el 100% de las cepas fueron resistentes a Penicilina, 97% a Kitasamicina, 96.6% a Oxitetraciclina, 94.9% a Sulfaclorpiridacina/Trimetoprim y el 94.7% a Eritromicina, además el 100% de las cepas estudiadas se consideraron multirresistentes al presentar resistencia a más de 1 antimicrobiano, incluso se encontraron cepas resistentes a todos los antimicrobianos empleados en el estudio. En la caracterización genotípica, se encontró que el 22% de las cepas estudiadas se clasificaron como patógenas al poseer al menos 3 de los 6 genes analizados, sin embargo el 63% de las cepas resultaron positivas al gen iss y el 38% al gen irp2, responsables del incremento a la supervivencia en suero y a la captura de hierro respetivamente, elementos esenciales para que la bacteria pueda sobrevivir en condiciones adversas dentro del hospedero. La constante investigación y la disponibilidad de análisis de PCR permitirán comprender mejor a E. coli y prevenir estas infecciones en un futuro.

Palabras Clave: Colibacilosis, Serotipificación,  Antibiograma, Genes de Virulencia, PCR.

INTRODUCCIÓN
Las cepas patógenas para aves se clasifican dentro del grupo APEC (Avian Pathogenic Escherichia coli) 1-7, las cuales pueden actuar como agente causal, o bien, como patógeno secundario en enfermedades inmunodepresoras o del tracto respiratorio.La Colibacilosis aviar es una enfermedad de importancia económica para la industria avícola, ya que se manifiesta como una infección localizada o generalizada. Es causada por Escherichia coli, cuya patogenia depende de la virulencia de la cepa, estado del hospedero y factores ambientales. La manifestación más severa de la colibacilosis aviar es la septicemia (colisepticemia) que ocurre frecuentemente en parvadas afectadas junto con otras infecciones respiratorias; se cree que E. coli puede actuar como patógeno oportunista después de la acción de Mycoplasma gallisepticum o de virus como el de la Bronquitis infecciosa o Laringotraqueítis8,9; sin embargo, la celulitis y otras lesiones causadas por E. coli han sido reproducidas experimentalmente en pollos sin la participación de otro agente10,11. Aunque la patogénesis de la colibacilosis es poca entendida, el desarrollo de una bacteremia parece ser esencial 12,13
 
Epidemiología de la colibacilosis aviar
La mayoría de los cuadros clínicos de colibacilosis son de origen respiratorio14, aunque no se descarta que algunos sucedan al atravesar las bacterias la pared intestinal15,16,17. Al respecto Rosario et al. (2004) identificaron cepas portadoras de los genes ipaH, cdt  y eae, aisladas a partir de aves con infección del saco vitelino (ISV), estos genes codifican para el fenotipo de invasividad relacionadas con las cepas  enteroinvasivas (EIEC) de humanos, toxina citoletal distencionante y para la proteína intimina, respectivamente.
La colibacilosis suele ser considerada como una enfermedad secundaria, originada por un estado de inmunodepresión debida a otras enfermedades víricas como Bronquitis Infecciosa, Enfermedad de Newcastle, Enfermedad de Gumboro, o bacterianas como Micoplasmosis, Clostridiosis, etc 18,19,20.
A pesar de considerarse como una enfermedad secundaria, varios autores19,21,22,23 describen a la colibacilosis aviar como una entidad propia, definiendo a E. coli como un agente patógeno primario. Numerosos autores hacen referencia al origen cloacal de las cepas patógenas causantes de septicemias en aves. Las cepas patógenas presentan unas características diferenciales que no siempre poseen los aislados comensales ni aquellas cepas con baja o escasa patogenicidad. Existen estudios que indican que del 10-15% de la población de bacterias coliformes intestinales pertenece a serotipos patógenos19. Las cepas patógenas pueden diseminarse ampliamente por la formación de aerosoles a partir de las heces contaminadas, adherirse a las células del epitelio del tracto respiratorio superior mediante fimbrias F1, iniciándose la colonización bacteriana24,25.
 
Signos y lesiones
La característica clínica más importante de la colibacilosis aviar es la colisepticemia y se produce por la afectación de numerosos órganos internos, como el corazón, hígado, bazo, ovario26-32. Existe una gran diferencia entre las variedades de E. coli y su habilidad para causar enfermedad, entre los dos extremos se encuentran todos los rangos de patogenicidad. Los síntomas varían con el lugar preferente de localización de la infección, reconociéndose las siguientes formas:
 
Forma respiratoria
La colibacilosis aviar, suele iniciarse a nivel del tracto respiratorio. Cuando E. coli atraviesa la mucosa del tracto respiratorio y alcanza el torrente circulatorio, se origina una infección sistémica generalizada o colisepticemia, donde se observan lesiones como perihepatitis, peritonitis y pericarditis fibrinosa14,15,19,20,23,25,33. A nivel respiratorio las lesiones se localizan en la tráquea, pulmones y sacos aéreos, pudiendo presentar estos últimos un aspecto opaco y con exudado caseoso de, intensidad variable19. Suele afectar a animales jóvenes, de forma aguda, alcanzándose valores aproximados del 50% de morbilidad y del 5-10% de mortalidad. Entre los síntomas clínicos que se manifiestan, se puede observar disnea acompañada de estertores.
 
Forma reproductora
La principal vía de infección del oviducto suele producirse por contaminación fecal a partir de la cloaca. También están descritas otras vías de infección como la producida a partir del tracto respiratorio por invasión, diseminación y colonización de órganos internos e incluso por el paso de las bacterias a través del lumen intestinal34. Se han descrito casos de infecciones ascendentes desde el oviducto a la cavidad peritoneal, cursando con peritonitis35. Es una enfermedad crónica y de curso lento, con una mortalidad en torno al 2-3%. Los rendimientos productivos de las gallinas ponedoras disminuyen ya que se produce una leve caída de la postura23. El oviducto presenta una notable congestión y dilatación de la mucosa pudiendo encontrar un contenido purulento en el interior15, incluso masas caseosas, en animales mayores.
 
Problemática actual en las granjas avícolas
A pesar de ser o no considerada E. coli como un patógeno primario, es evidente que esun problema sumamente importante para las granjas avícolas. Es una enfermedad muy frecuente que puede llegar a ocasionar pérdidas económicas muy elevadas.  Actualmente, la manera de controlar estas infecciones es mediante el empleo de antimicrobianos como Ampicilina, Tetraciclina, Sulfonamida y Enrofloxacina; ésta última, es una de las quinolonas más usada en la industria mexicana de pollo de engorda36. Sin embargo, estos tratamientos representan un costo muy elevado en la producción avícola y tienen repercusiones importantes en la selección de bacterias resistentes, lo que a la postre, ocasiona un problema mayor.
Ante esta problemática, el diseño de vacunas ha sido objeto de un intenso trabajo de investigación en las últimas décadas; prueba de ello, es la gran cantidad de trabajos científicos publicados sobre el tema37-48. Una gran variedad de vacunas y métodos de vacunación han sido desarrollados, incluyendo inmunización activa y pasiva; para ello se han usado productos vivos o inactivados (bacterinas), vacunas recombinantes y la inmunización contra factores de virulencia específicos. Sin embargo todos estos inmunógenos han sido efectivos contra varios serotipos de E. coli, proveen protección contra serogrupos homólogos, pero no una protección cruzada significativa contra serogrupos heterólogos49.
En consecuencia, para lograr una vacunación satisfactoria es necesario inmunizar con las cepas bacterianas específicas de un brote o por la frecuencia de aislamiento del microorganismo. Por ello, es importante contar con estudios epidemiológicos que permitan identificar los serogrupos más frecuentes de cada región donde se desea utilizar algún tipo de inmunógeno. Según esta afirmación, resulta importantísimo caracterizar las cepas responsables de la colibacilosis. En este documento se presentan algunos de los resultados obtenidos en estudios realizados con cepas de E. coli de origen clínico, aisladas de aves remitidas al Laboratorio de Investigación Pecuaria y Patología SA de CV (LIPEPSA).
 
Caracterización de cepas patógenas de E. coli
 
Determinación del antígeno somático o serogrupo.
La tipificación serológica serealizó de acuerdo al procedimiento empleado en el Laboratorio de Bacteriología del Departamento de Salud Pública, de la Facultad de Medicina de la UNAM de acuerdo con Orskov y Orskov50, mediante la utilización de sueros específicos (SERUNAM) que fueron obtenidos de conejo Nueva Zelanda blanco, con los que se pudieron identificar 41 serogrupos y los más frecuentes fueron O8 (n=14), OND (N=9), O19 y OR (n=4), O11, O102, O2, O7, O78 y O9 (N=3), (Figura 1). En el análisis de la formula antigénica completa (O:H) se identificaron 62 serotipos diferentes, de los cuales se identifico a O8:H7 (n=4) como el serotipo más común, seguido de O8:H19(n=3) O8:H21 (n=3), O8:H42 (n=2) y O8:H51 (n=2). 
Figura 1. Frecuencia de serogrupos de cepas aisladas de diferentes granjas avícolas en la zona de los Altos Jalisco. 
Panorama General de la Colibacilosis Aviar en los Altos Jalisco - Image 1
En  México existen pocos estudios al respecto; sin embargo, se han realizado trabajos por Rosario et al. (2004) 51 y Ramírez et al. (2009) 52 en los que se identificóla presencia de los serogrupos O19, O84, O8, O78, así como de O2, O20, O100, O8, O131, O84, O25 y O78 respectivamente.
Cuadro 1. Distribución de los serogrupos más frecuentes por línea comercial
Panorama General de la Colibacilosis Aviar en los Altos Jalisco - Image 2
En el cuadro 1. se puede observar que de los serogrupos más frecuentes, con excepción de los serogrupos O2 y O78 se aislaron de Reproductoras Pesadas y el serogrupo O8 se aisló con mayor frecuencia en Reproductoras Ligeras.
 
Prueba de sensibilidad antimicrobiana.
La determinación de la sensibilidad a los agentes antimicrobianos es una de las principales funciones de un laboratorio de diagnóstico clínico y responsabilidad del médico de granja. Esta función se vuelve de especial relevancia en una época como la actual, en la que las resistencias a los agentes antimicrobianos son elevadas y existe una gran discusión sobre la utilización de antimicrobianos en  los animales. Por ello es fundamental que el laboratorio pueda aportar la información necesaria para llevar a término un tratamiento  adecuado.
En relación a la resistencia antimicrobiana, en México se han realizado algunos estudios sobre el papel de E. coli en la infección del saco vitelino por Rosario et al. (2005) 36yRamírez et al. (2007)53. En el primero, el 55 % de las cepas fueron resistentes a Enrofloxacina, 65 % a Ampicilina y el 88 % a Tetraciclina; mientras que en el segundo, el 88 % de las cepas fueron resistentes a Tetraciclina, 87 % a Doxicilina, 62 % a Sulfametoxazol/Trimetoprim y 61 % a Ampicilina.
En este estudio se realizaron antibiogramas utilizando 21 diferentes antimicrobianos empleados de forma rutinaria en la avicultura. Los resultados se resumen en la figura 2. 
Figura 2. Sensibilidad a los diferentes antimicrobianos utilizados en la industria avícola.
Panorama General de la Colibacilosis Aviar en los Altos Jalisco - Image 3
Los resultados indican que el 100% de las cepas fueron resistentes a Penicilina, 97% a Kitasamicina, 96.6% a Oxitetraciclina, 94.9% a Sulfaclorpiridacina/Trimetoprim, y el 94.7% a Eritromicina, además el 100% de las cepas estudiadas se consideraron multirresistentes al presentar resistencia a más de 1 antimicrobiano, incluso se encontraron cepas resistentes a todos los antimicrobianos empleados en el estudio.
 
Detección por PCR de factores de virulencia
Mucha de la investigación que se realiza actualmente implica la determinación de los factores que hacen que algunas E. coli sean patógenas, utilizando técnicas de reacción en cadena la polimerasa (PCR)para determinar los diferentes genes contenidos en cualquier E. coli en particular, genes que se han encontrado que son más abundantes entre las cepas APECque entre las comensales. Si se identifican más de tres genes de virulencia, se considera que el aislamiento es una cepa patógena.
En este estudio se caracterizaron 32 cepas de las más frecuentes usando como marcadores de virulencia los siguientes genes; iucD (Aerobactina) sideroforos para capturar y transportar hierro en medios adversos, cdtB (Toxina Citoletal Distencionante) actividad de DNAsa I, bloquea la mitosis, irp2 (Proteína de Captura de Hierro)  asociado con la yersiniabactina, tsh (Hemaglutinina Sensible a la Temperatura) permite a la E. coli adherirse a la células de epitelio respiratorio, ipaH (Mecanismo Enteroinvasivo) penetración celular y supervivencia intracelular, iss (Incremento a la Supervivencia en Suero) proteína de membrana externa, asociada a la resistencia al complemento. (Iniciadores y tamaño del producto amplificado ver Anexo 1).
Los resultados muestran que el 22% de las cepas son patógenas, dentro de las cuales se encontraron los serotipos 078:H9 (n=1), O8:H21 (n=2), O19:H51(n=1), O6:H10 (n=1), O103:H7 (n=1) y OND:H24 (n=1), ya que presentaron de 3 a 5 genes de virulencia, sin embargo el 63% de las cepas resultaron positivas al gen iss .y el 38% al gen irp2, responsables del incremento a la supervivencia en suero y a la captura de hierro respetivamente (figura 3).
Figura 3. Porcentaje de cepas positivas a los diferentes genes de virulencia utilizados para la caracterización genotípica mediante la técnica de PCR.
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DISCUSIÓN
A pesar de que no existen estudios sobre el impacto económico de la colibacilosis en México, las infecciones asociadas a E. coli representan pérdidas de millones de dólares al año en los Estados Unidos 7,54.  Aunque en México no se tienen estudios sobre el impacto económico de esta enfermedad, se estima que son cuantiosos con tan solo considerar los costos por la aplicación de antimicrobianos, que en ocasiones se han llegado a administrar hasta tres tratamientos. La problemática para el control de la colibacilosis mediante el uso de antimicrobianos es la selección de cepas resistentes, que se genera al no realizar un antibiograma antes de dar un tratamiento a las aves ante un problema infeccioso. Hecho que al parecer va en aumento, ya que cada vez es más el porcentaje de cepas resistentes a los diferentes antimicrobianos usados en la industria avícola, tal como se puede observar al comparar los resultados de Romo et al, (2005)55, en donde el 85% de las cepas fueron resistentes a Tetraciclina, 82% a Eritromicina y el 71% a Estreptomicina, contra el 94% de resistencia a Tetraciclina, 94% a Eritromicina y 93% a Estreptomicina obtenidos en este estudio. Además en estudios realizados por Blanco et al, (1997)56, Filali et al, (1998)57 y Geornaras et al. (2002)58, demostraron que el 100% de los aislados clínicos presentaron perfiles de sensibilidad a la Colistina. Sin embargo, en este estudio se encontró 13 % de cepas resistentes a colistina confirmando la tendencia a la alza en cuanto a la resistencia en cepas de E. coli.
Lo anterior ha dado a que resurja el interés por métodos alternativos para el control de esta enfermedad. Se han elaborado bacterinas 40-42,vacunas subunitarias43,44 o incluso antígenos vivos atenuados45, todas han inducido buena protección contra la colibacilosis aviar, la cual en muchos casos se atribuyó a la producción de anticuerpos en suero. Pero debido a que usualmente no se observa protección cruzada con los serogrupos de E. coli responsables de la enfermedad41,59,muchos de estos inmunógenos sólo han sido efectivos contra desafíos homólogos. En trabajos realizados por Melamed et al. (1991)42 y Kwaga et al. (1994)60, sugieren la conveniencia de elaborar una vacuna que contenga los serogrupos más comunes asociados a la colibacilosis aviar.
Es por ello que en el presente trabajo se expone un panorama general de la colibacilosis aviar en la zona de los Altos Jalisco, con el objeto de saber cuáles son los serogrupos más frecuentes, que características de resistencia y que genes de virulencia portan estas bacterias. Con la ayuda de estos estudios podemos saber con detalle si un cepa aislada es la que esta ocasionando primariamente el problema o si se trata de una infección donde E. coli está actuando como un patógeno secundario.
Como se pudo observar en los resultados de la serotipificación, los serogrupos más frecuentes fueron O8 (16%), OND (10.2%) O19 y OR (4.5%), O11, O102, O2, O7, O78 Y O9 (3.4%), algunos de ellos (O8, O19, O2 Y O78)ya han sido reportado anteriormente en México por Rosario et al. (2004) 51 y Ramírez et al. (2009) 52. El análisis de la formula antigénica completa (O:H) mostró que O8:H7 fue el serotipo más común en aves comerciales. En un estudio realizado por Morales et al, (2010)61 se identifico al serotipo O8:H11 como el más común pero en aves de traspatio. Cabe mencionar que lo más importante en estos cuatro estudios es que el O8 es el serogrupo más común aun en diferente tipo de producción  y en diferente  zona geográfica. Estos serogrupos podrían ser buenos candidatos para la selección de antígenos para la elaboración de inmunógenos.
Los estudios moleculares para la detección de genes de virulencia han sido de gran ayuda para diferenciar a las cepas APEC de las comensales. Muchos investigadores han desarrollado una serie de paneles utilizando técnicas de PCR para detectar diferentes genes que se ha encontrado que son más frecuentes entre las APEC que entre las comensales. Si se identifican más de tres genes de “virulencia”, se considera que el aislamiento es una APEC 62.
Los resultados obtenidos en este estudio indican que el 22% de las cepas estudiadas fueron patógenas, dentro de estas se encuentran los serotipos 078:H9 (n=1), O8:H21 (n=2), O19:H51(n=1), O6:H10 (n=1), O103:H7 (n=1) y OND:H24 (n=1), la mayoría de estos se aislaron de gallinas de postura ligeras y dos de reproductoras pesadas, así mismo se pudo observar 8 diferentes patotipos (Anexo 2), se define patotipo como una combinación diferente de genes contenidas en una cepa14.
El gen denominado iss, permite a E. coli sobrevivir en el torrente sanguíneo y se ha descubierto que ésta es una característica frecuente en las APECpero no en las comensales63. En este trabajo se encontró que el 63% de las cepas portaban el gen iss, diversos investigadores han publicado datos que demuestran que la presencia de iss en una E. coli de aves es un buen indicador de su potencial de causar enfermedad 37,63-66.
Además el 38% de las cepas fueron positivas al gen irp2 (sistema de adquisición de hierro mediado por yersiniabactinas), elemento importante en la captura y concentración  del hierro libre, ya que resulta limitante para el crecimiento bacteriano. Los genes responsables de estos sistemas de incorporación forman parte de una isla de patogenicidad adquirida mediante transferencia horizontal67. Este hecho ha sido demostrado en humanos y en aves68,69. Se trata de un factor claramente vinculado con la virulencia de los aislados70,71.
Además, resulta muy importante el hecho de que muchos investigadores han encontrado que estos dos genesestán relacionados con plásmidos63-67. Los cuales pueden albergar islas de patogenicidad (PAIs, por sus siglas en inglés) que pueden contribuir a causar enfermedad. Sugiriendo un papel altamente importante de estos dos factores en la patogénesis de la colibacilosis aviar.
 
CONCLUSION
Aunque los métodos moleculares para identificar genes específicos de virulencia están disponibles actualmente, la serotipificación sigue siendo una herramienta muy útil para los estudios epidemiológicos. La serotipificación provee los medios para relacionar trabajos previos con trabajos nuevos. También es muy importante conocer el serotipo en una cepa APEC por que la respuesta inmune en aves, principalmente va dirigida directamente contra el antígeno O.
Con los resultados de serotipificación obtenidos en este trabajo, se pueden seleccionar los serogrupos más frecuentes (O8, O19, O2, O78 y O9) para la elaboración de inmunógenos para poder prevenir casos de colibacilosis aviar. Para ello es necesario realizar más estudios de caracterización de las cepas, para monitorear las cepas responsables de la colibacilosis aviar.
Tanto la serotipificación, pruebas de sensibilidad antimicrobiana e identificación de genes de virulencia por PCR, son pruebas muy útiles que el médico de campo debe utilizar para poder tener un mejor control de la colibacilosis aviar.
 
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ANEXO 1
Panorama General de la Colibacilosis Aviar en los Altos Jalisco - Image 5
ANEXO 2
 
Trabajo presentado en el CONGRESO REGIONAL AVECAO DE JALISCO
Temas relacionados:
Autores:
Carlos Rodríguez Molina
LIPEPSA
Cecilia Rosario Cortés
Asociacion Nacional de Especialistas en Ciencias Avícolas de Mexico (ANECA)
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Eligio Ramiro Lòpez Gonzàlez
28 de febrero de 2013
Una felicitaciòn a los mèdicos que nos han compartido este trabajo. Vale la pena este tipo de investigaciòn por que se nota la profundidad de la misma. Tarde o temprano este tipo de investigaciòn va a dar frutos. Felicidades nuevamente.
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