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XXII Congresso Latino-Americano de Avicultura 2011
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XXII Congresso Latino-Americano de Avicultura 2011

Metodos de diagnóstico y su importancia en el campo

Publicado el: 5/9/2011
Autor/es: Marìa Luisa Sandro Morales, Platalab SA. Buenos Aires, Argentina
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INTRODUCCIÓN
El Laboratorio de Diagnóstico es una valiosa herramienta para toda empresa avícola, ya que la información que genera, colabora con el logro de mejores performances de producción, que se traducen en más eficiencia con menor costo.
Contamos con Métodos de Diagnóstico que nos permiten controlar en forma eficiente la sanidad, la productividad de las aves y la inocuidad de los productos avícolas que llegan diariamente al consumidor. Al día de hoy la industria avícola ha modificado los sistemas de producción y ha puesto el énfasis en la protección del medio ambiente, la restricción al uso de antibióticos en las aves y el alimento, la atenciòn en el bienestar animal, y la preocupación constante de suministrar a la población de alimentos seguros y de muy buena calidad.
Para lograr un diagnóstico exacto es esencial aplicar un sistema eficiente de toma de muestras en granja, una rápida remisión de las mismas al laboratorio, acompañadas de un historial fidedigno, contar con equipamiento y conocimientos necesarios para la elección del método de diagnóstico más eficaz , hacer una correcta interpretación de los resultados, en relación a la problemática que presentan las aves en el campo y actuar en consecuencia.

Frecuentemente los problemas en el campo obedecen a múltiples factores y también múltiples son las medidas que debemos aplicar para solucionarlos.

En muchos casos las muestras suelen llegar al laboratorio sin un historial completo, que permita al profesional orientarse, y este solo cuenta con escasos datos, como consecuencia de ello, se dificulta la identificación al agente causal y no es posible obtener una respuesta correcta, para la solución de la problemática que presentan las aves en la granja.

Es frecuente observar, que lo resultados que informa el laboratorio no son analizados e interpretados en las empresas avícolas, no se establecen líneas de base, ni historiales, por lo que no se cumple con el objetivo de encontrar la solución, los informes del laboratorio se archivan y los problemas persisten indefinidamente.
 
PROCEDIMIENTO DE MUESTREO
La idea básica de utilizar el muestreo en pruebas de diagnóstico, es que la recolección de datos relativos de algunos elementos de la población y el respectivo análisis de los mismos, puede proporcionar información significativa, aplicable a toda la población. El muestreo está íntimamente relacionado con el proceso de investigación de anticuerpos o antígenos por verificación, investigación de una parte de la población, para inferir conocimiento para el total de la misma. Normalmente muestreamos una pequeña parte de la población, aun tratándose de poblaciones con grandes cantidades de aves y con los datos obtenidos en esa pequeña proporción de muestras, inferimos que en ella, están representadas todas las aves de la población.

La toma de muestras es de fundamental importancia para lograr resultados confiables, que sean el reflejo de lo que le ocurre a las aves en la granja. Una de las mayores inquietudes, que muchas veces no es tenida en cuenta en el campo, es la cantidad de muestras que deben remitirse al laboratorio. La determinación de la cantidad mínima de muestras es de vital importancia para que los resultados sean válidos.

La Muestra es como una parte cualquiera de una población y muestreo al proceso de toma de muestras de la misma.

El muestreo está basado en dos premisas:

La primera es que la similitud entre los miembros de la población es tal, que un pequeño número de ellos puede representar las características de todos.

La segunda es que, la diferencia entre los valores de las variables de la población (parámetros) y los valores de estas variables obtenidas de la muestra (estadística) son minimizados, porque mientras que algunas mediciones subestiman el valor del parámetro, en otras lo sobrestiman, pero si la muestra ha sido obtenida de manera correcta es representativa, entonces las variaciones en estos valores tienden a balancearse y anularse unas a otras, resultando en medidas de la muestra que son generalmente próximas a las de la población.


Características de una Muestra Representativa
Entendemos que la esencia de una buena muestra, consiste en establecer medios para inferir, en la forma más exacta posible, las características de una población a través de las medidas de las características de la muestra.
Una muestra representativa implica:

Precisión
Se refiere a la correspondencia de los resultados de las mediciones obtenidas de la muestra (estadística) con respecto a los resultados que se medirían en toda la población (parámetros). Precisión es la medida del error muestral, cuanto menor sea este error, más precisa será la muestra.

Eficiencia
Es la medida comparativa entre diversos proyectos de muestreo. Un proyecto es más eficiente que otros en sub-condiciones específicas, si se logran resultados más confiables y económicos con la misma precisión o mayor precisión con el mismo costo.

Corrección
Se refiere al grado de ausencia de errores que no son propios de la muestra. Una muestra es considerada correcta si las medidas sobreestimadas y las subestimadas son compensadas entre los componentes de la misma.


METODOS DE MUESTREO
Los muestreos más frecuentemente utilizados en avicultura son:

Muestreo Confirmatorio

Es el que utilizamos para confirmar un diagnóstico clínico, en este muestreo se toma un número pequeño de las aves con signos clínicos, que deberán ser representativos del lote, ya que en base al diagnóstico obtenido, deberemos tomar medidas acordes para solucionar el problema. En este muestreo debemos conocer a fondo el historial de la enfermedad de las aves, ya que es fundamental el momento en el que vamos a tomar la muestra, si se trata de una enfermedad infecciosa, debemos tomarla al comienzo de la misma, para lograr el aislamiento del agente causal, mientras que para visualizar la respuesta serológica, será necesario realizar un muestreo en etapas más avanzadas o durante la convalecencia, que nos permitirá detectar el aumento del nivel de anticuerpos, para ello necesitamos tomar muestras pareadas de sueros con intervalos de 15 a 20 días.

Este tipo de muestreo suele ser aplicable también materias primas, ingredientes y subproductos avícolas (carne, huevos y sus subproductos).

Muestreo Exploratorio
Este tipo de muestreo es utilizado para realizar chequeos de rutina o monitorear el estado de salud de las aves. Estos monitoreos deben realizarse en forma periódica, para poder controlar planes de vacunación, detectar estadios tempranos de enfermedad antes de la aparición de los signos clínicos, y poder así establecer las medidas correctivas rápidamente. La selección de las muestras se realiza al azar garantizando su representatividad, el tamaño y números de las mismas debe estar en relación directa con el tipo de muestras y de los chequeos que el laboratorio va a realizar, si hablamos de enfermedades infecciosas el número dependerá de la prevalencia y el porcentaje de acierto de la enfermedad en la zona y en el caso de ingredientes o de alimentos dependerá del volumen total del material a muestrear.

Se pueden realizar monitoreos serológicos, microbiológicos, parasitológicos y químicos. Los monitoreos serológicos y microbiológicos son utilizados en las campañas oficiales de control y erradicación de enfermedades en el caso de Argentina es el Plan Nacional de Sanidad Avícola del SENASA.

La frecuencia de un programa de monitoreo será establecido según el criterio de cada empresa de acuerdo a sus necesidades.
 
CONSERVACIÓN DE LA MUESTRA Y REMISIÓN AL LABORATORIO

Los métodos de conservación de las muestras tienen como objetivo preservar las características físico químicas y microbiológicas originales de las mismas, durante el período comprendido entre la toma de la muestra y su llegada al laboratorio, en algunos casos, estos métodos también nos posibilitan la preparación de las muestras para su procesamiento.

Los métodos de conservación dependen del análisis que vayamos a realizar y de la muestra remitida. De acuerdo con el método utilizado, las muestras conservaran sus características originales, no obstante, recomendamos que las mismas, sean trasladadas al laboratorio lo más rápido posible después de su recolección, y en un plazo no mayor de 24 horas.

Cuando remitimos aves vivas, éstas deben acondicionarse en contenedores adecuados, teniendo en cuenta condiciones de bienestar animal durante el transporte, cumplimentando medidas de bioseguridad para evitar contaminación y siguiendo las normas de la legislación vigente.

La remisión de aves vivas, nos asegura que las muestran no sufran alteraciones durante el transporte antes de ser procesadas en el laboratorio, pero tengamos en cuenta la distancia si las distancia son muy grandes, deberemos sacrificar a las aves y tomar las muestras en la granja, y remitirlas acondicionadas, de forma que nos asegure su conservación durante el trasporte.


Estudios Histológicos
Cuando remitimos muestras de tejidos para estudios histopatológicos, a efectos de una buena conservación, deben guardarse los cortes de tejidos inmediatamente despuès de la muerte de las aves, en especial tejidos cerebrales y renales que se deterioran con rapidez, el tejido pulmonar flota en la superficie del la solución fijadora debido al aire atrapado, para lograr una buena fijación de este órgano podemos colocar algún material absorbente sobre la superficie de dicho órgano para mantenerlo sumergido. Las trozos de órganos deben ser pequeños 0,5 cm de ancho para permitir la rápida penetración del fijador, incidirse con delicadeza con una hoja de bisturí afilado o una hoja de rasurar para conservar la estructura de los tejidos y sumergirlos en 10 veces su volumen de una solución de formol buferado al 10%, pH 7,0 - 7,5 remitidos en frascos de plástico herméticamente cerrados y debidamente identificados con marcador indeleble, detallando con claridad su contenido y colocados dentro de una bolsa de polietileno y luego en un contenedor apropiado, acompañados de un historial que sirva para orientar el diagnóstico

Estudios Serológicos
Las muestras de suero pueden tomarse de aves vivas o después del sacrificio. La forma más fácil y sencilla de obtener las muestras de sangre en condiciones de campo es por punción de la vena braquial, se puede obtener por punción cardiaca. En el caso de aves sacrificadas, si la muestra no se tomo previamente, esta puede tomarse durante la necropsia, mediante punción cardíaca antes de la coagulación de la sangre. Cuando establecemos una rutina de chequeos para ver cómo funciona el plan de vacunación o en caso de necesitar muestras pareadas, podemos hacer la extracción en la planta de faena, en la línea de sangrado.

Para la mayoría de los estudios serológicos es suficiente el suero de dos centímetros de sangre, aunque algunos chequeos pueden realizarse con el suero de un centímetro. La sangre deberá extraerse en la forma más aséptica posible y depositarse en un tubo de vidrio o plástico limpio y seco el cual se coloca en forma horizontal o casi, hasta que la sangre coagule, se lleva a estufa a 35-37º C y se deja entre 30 a 60 minutos, se extrae el coagulo y se mantiene refrigerado. Nunca debe refrigerarse inmediatamente una muestra de sangre recién extraída, ya que se retardará el proceso de coagulación y se puede provocar la hemólisis de la misma. No deben congelarse ni refrigerarse muestras de sueros con coágulos, ya que puede provocarse la hemólisis de los mismos e interferir con las reacciones. Si se van a realizar pruebas de aglutinación nunca debe congelarse el suero, ya que es posible que aparezcan reacciones falsas positivas.

Las muestras de sueros deben remitirse al laboratorio en bolsas de polietileno cerradas y debidamente identificadas con marcador indeleble, indicando con claridad el origen de las mismas señalando que chequeos que se solicitan, refrigeradas y dentro de un contenedor adaptado para tal fin.

Para pruebas serológicas como ELISA pueden utilizarse tiras de papel de filtro
La forma de extraer las muestras de sangre es realizando la punción de la vena braquial con un bisturí limpio o con aguja de inoculación, absorber la sangre con el extremo angosto de la tira de papel, toda la parte angosta debe estar llena de sangre. Dejar secar la tira de papel al aire y luego fijarla con algún medio adhesivo e identificar la tira con los datos de las aves. 
Metodos de diagnóstico y su importancia en el campo - Image 1

Deben tomarse algunas precauciones para que las muestras puedan ser procesadas en el Laboratorio:
No se deben remitir las tiras de papel en BOLSAS de POLIETILENO, por la proliferación de hongos, puede utilizarse un sobre de papel para su remisión.

Es muy importante evitar el contacto de las mismas con FORMALDHEIDO,porque la sangre no puede serre suspendida para recuperar los anticuerpos cuando se sumergen en salina fisiológica.

Estudios Microbiológicos
Las muestras para estudios de Microbiología (bacteriología, virología y micología) así como las muestras para biología molecular deben colocarse en recipientes de plástico estériles o en bolsas de polietileno estériles ( existen en el mercado varios marcas comerciales) y mantenerse refrigeradas o congeladas en contenedores adaptados para este fin,( evitando la proliferación de agentes saprófitos o contaminantes propios de las mismas y los que pueden agregarse durante su manipulación en la necropsia, el transporte y en el Laboratorio) acompañadas de un historial y un diagnóstico presuntivo que permita orientar el diagnóstico. En el caso de las muestras de hisopos estériles, los mismos deben conservarse sumergidos en medios de transporte específico (medios selectivos, adicionados con antibióticos etc.) y remitirse refrigerados en contenedores adaptados para este fin.

Como ya lo hemos expresado los procedimientos más utilizados para la conservación de las muestras son la refrigeración y la congelación, particularmente en aquellas muestras que por su naturaleza posean una flora bacteriana, ya que la multiplicación de dicha flora puede interferir con el crecimiento de los agentes patógenos. El aislamiento bacteriano o micótico requiere de muestras en refrigeración, mientras que para la mayoría de los aislamientos virales la congelación es el método más recomendable, el uso de sustancias crio protectoras, como la glicerina, puede prolongar la vida útil de las muestras. Existen medios de cultivo especialmente diseñados para la conservación y el transporte de las mismas y en algunos casos, tienen propiedades de inhibición de microorganismos contaminantes y de protección para las bacterias. Para el aislamiento de algunas bacterias las muestras pueden ser correctamente conservadas en medios de transporte, que pueden ser medios de cultivos selectivos preparados en el laboratorio.

Cuando se trata de muestras para aislamiento viral, las mismas pueden mantenerse en un medio protector como un caldo nutritivo, adicionado de un buffer para evitar cambios de pH, al que pueden adicionarse una mezcla de antibióticos de amplio espectro, para evitar la proliferación bacteriana de la muestra y remitirlas al laboratorio, refrigeradas en contenedores adaptados para tal fin y acompañadas de un historial y un diagnóstico presuntivo.

Estudios Parasitológicos
Para la remisión de muestras para estudios de Parasitología, estas deben mantenerse refrigeradas evitando la fermentación y la autolisis. Deben ser remitidas en recipientes de plástico hermético, correctamente identificadas con marcador indeleble, indicando claramente su contenido, colocadas dentro de bolsas de polietileno, acompañadas de un historial y refrigeradas en contenedores preparados para tal fin.

Estudios Toxicológicos
La muestras que remitimos para chequeo toxicológico serán conservadas de acuerdo al estudio que va a realizarse, no obstantes es de primordial importancia que sean conservadas en recipientes herméticos para evitar contaminación del medio ambiente.
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METODOS DE DIAGNOSTICO
Los métodos de diagnóstico utilizados en el Laboratorio de Avicultura deben estar estandarizados, validados, universalmente aceptados, y deben ser, específicos, sensibles, tener la capacidad de dar el mismo resultado cuando se repite el chequeo en forma reiterada y resultados similares cuando se realiza la prueba en diferentes laboratorios.

Las pruebas diagnosticas que utiliza el laboratorio deben ser accesibles, confiables, prácticas y el resultado de las mismas deben ser cuantificables, para ser analizadas en forma comparativa. Los usuarios del laboratorio, médicos veterinarios, granjeros, supervisores, y propietarios de las empresas, deben estar convencidos de la utilidad y la necesidad de rutinas de monitoreos e investigación, de agentes de diferente etiología que afectan a las aves
Los métodos de diagnóstico usados de rutina en avicultura son patología (necropsia e histopatología) serología, microbiología (bacteriología, virología, micología), biología molecular, parasitología y toxicología.

Necropsia
El objetivo de la necropsia es, determinar causa de mortandad de los signos clínicos para examinar tejidos y órganos y tomar las muestras más adecuadas, para efectuar pruebas microbiológicas, histológicas, serológicas etc.

Mediante la necropsia ponemos en evidencia las lesiones macroscópicas de los tejidos, especificando el tipo, su distribución, curso y grado de severidad. Es necesario que durante este proceso pongamos especial atenciòn y cuidado de no infectar a los seres humanos, a las otras aves y no contaminar el medio ambiente.

Podemos realizar las necropsias en el campo y en laboratorio con la mortandad de la granja, y con aves sacrificadas que presenten signos clínicos, porque es probable que al momento de la necropsia, las aves muertas presenten lesiones postmorten, que puedan obstaculizar la observación de las lesiones características del proceso que afecta a las aves. Con los resultados de la necropsia, podemos esbozar un diagnóstico presuntivo de la acción de algún agente o enfermedad, que puede ser o no concluyente y que debemos investigar.

MétodosHistopatológicos
Para describir las lesiones microscópicas nos valemos de la Histopatología
El estudio de los tejidos nos permite la identificaciòn de lesiones microscópicas

Esta técnica es de gran ayuda, en los casos de ciertas enfermedades virales, en los que la presencia de corpúsculos de inclusión es patognomónica y en otros casos, la presencia de células específicas en los tejidos de diferentes órganos, son orientativos de procesos virales y bacterianos. En otros procesos podemos observar en los tejidos al agente etiológico. En los que respecta a los procesos tumorales podemos determinar muchas veces el tipo de tumor al que estamos enfrentados.

En algunas ocasiones la histopatología sirve para cuantificar el grado de lesión que las aves están teniendo en algunas enfermedades, como en las micotoxicosis, la anemia infecciosa aviar y la enfermedad de Gumboro, donde incluso se puede determinar sí las aves están o no protegidas contra los desafíos de campo, en este caso se han desarrollado sistemas para cuantificar las lesiones de la bolsa de Fabricio, como un sistema que nos indica el grado de protección de las aves.

Métodos Serológicos
Los chequeosserológicos son métodos presuntivos,que permiten la detección de anticuerpos en el suero que las aves producen frente a diferentes agentes infecciosos. El objetivo de la serología NO es medir proteccion, la proteccion se mide en las aves, frente a un desafio, y se establece a través de índices de mortandad, sígnos y lesiones. La serología es una herramienta de monitoreo, donde el cambio significativo en las medias aritméticas, geométricas y coeficiente de variación pueden sugerir que hay una infección aguda, o crónica o una vacuna que no fue bien aplicada. La serología puede ser también empleada para detectar anticuerpos en yema de huevo y otros líquidos.

Los chequeos pueden ser cualitativos y cuantitativos. Las técnicas cualitativas como la aglutinación en placa y la inmudifusiòn en gel de agar expresan resultados positivos o negativos, son poco sensibles y muy específicas y el suero no se diluye para procesarlo. Existe en la actualidad un sistema llamado DIVA que sirve para diferenciar entre anticuerpos de enfermedad y de vacunación

En los chequeos cuantitativos como la inhibición de la hemaglutinación, virus suero neutralización y microaglutinaciòn los sueros se diluyen en diluciones seriadas dobles y el resultado se expresa en título de la muestra, que representa la dilución mayor, en la que se observa una reacción positiva y el título es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpos de la muestra.

En el test de ELISA el suero se diluye una vez y se utiliza un antisuero marcado con una enzima y el resultado se basa en una reacción colorimétrica, que se mide con un espectrofotómetro, cuya intensidad es proporcional a la cantidad de anticuerpos presentes en la muestra. Los resultados son clasificados en grupos o perfiles en un histograma y el resultado se expresa en título y este es calculado matemáticamente, comparando con los títulos de los controles positivos y negativos de la prueba. La técnica de ELISA es altamente utilizada debido a su alta sensibilidad, fácil de realizar, con gran disponibilidad de reactivos estandarizados, rapidez de los resultados y fácilmente adaptable a un sistema computarizado para evaluar estadísticamente los resultados. Existen en el mercado varios Kits comerciales a disposición de los laboratorios.

En algunos kit comerciales de ELISA para anemia infecciosa aviar y Salmonella enteritidis se utiliza la técnica de ELISA de competencia o por bloqueo, donde el nivel de anticuerpos es inversamente proporcional a la reacción colorimétrica y los valores altos indican ausencia de anticuerpos y los valores bajos indican la presencia de anticuerpos. La técnica de ELISA de captura detecta antígenos a partir de muestras de líquidos corporales o triturados de órganos, como la detección del antígeno p-27 de los virus del grupo Leucosis -Sarcoma.

Técnica de ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) en Avicultura
La técnica de ELISA se ha convertido, en una de las herramientas más importantes con que cuenta la industria avícola, para establecer un programa de medicina preventiva. Los kits comerciales de ELISA se utilizan para enfermedades bacterianas, virales y micotoxinas.Muchos de los resultados que se obtienen con el uso de esta técnica, han sido subutilizados y por ende, vistos con poco valor en relación a la inversión en costos y los posibles beneficios, que pudieran ser obtenidos en las decisiones que deben tomar los médicos veterinarios y encargados de la producción avícola.
Muestreos para realizar el test de ELISA
En relación al objetivo de la serología en cuanto al tipo de muestreo, podemos considerar dos situaciones:

Detección de la enfermedad y determinación de la prevalencia de la enfermedad.

Vamos a analizar la detección de la enfermedad en animales vacunados.

La fórmula para calcular el tamaño de la muestra teniendo en cuenta la prevalencia de la enfermedad en una población infinita (>3000) es:

n = log (error) ÷ log (1- prevalencia de la enfermedad)

Cual es la estrategia de muestreo, para detectar una enfermedad en un lote de aves con 10% de prevalencia y 95% de confianza ?
N = log 0,05 + log (1-0,10) es igual n= 29

Esto significa que si tomamos un mínimo de 29 aves, tendremos la oportunidad de detectar por lo menos 1 animal infectado, con un nivel de confianza de 95%. El número de muestras necesario para obtener una confianza del 95% de detección de la enfermedad (esto es 95% de probabilidad de detección de la enfermedad), considerando una población con una tasa de infección de 10%, es 28. La diferencia entre 28 y 29 muestras, se debe a que la tabla se refiere a una población de 2000 individuos y el cálculo fue hecho para una población de 3000 individuos o más (infinita).
A continuación en la tabla se exhibe el tamaño estimado de muestras para detectar enfermedad en poblaciones con una gran cantidad de individuos (2000)2.
% Confianza
% Prevalencia
5%
10%
15%
99%
90
44
28
95%
58
28
18
90%
45
22
14
85%
37
18
12
80%
31
15
10
75%
27
13
9
Sabemos, que para detectar enfermedad, en poblaciones con una gran cantidad de aves (2000)2 se observa, que cuando se disminuye el número de muestras o se trabaja con menor porcentaje de confianza, debemos esperar que la prevalencia de la enfermedad aumente para ser detectada. En medicina preventiva, el objetivo es detectar laenfermedad lo antes posible, con el mayor índice de confianza. Por eso, cuando se quiere trabajar con 95% de confianza para detectar una infección con 10% de prevalencia, el número de muestras recomendable es 28.
En la tabla que se figura a continuación se exhibe el número de muestras, de acuerdo al tamaño de la población, para detectar infección con 95% de confianza, en una población con 5% de prevalencia y grado de confianza de detección, cuando el número de muestras se reduce a 10.
Tamaño de la Población
Número de MuestrasSugeridas
Confianza
Número Reducido de Muestras
Confianza Reducida
20
19
95%
10
50%
40
31
95%
10
44%
60
38
95%
10
43%
80
42
95%
10
42%
100
45
95%
10
42%
120
47
95%
10
41%
160
49
95%
10
41%
200
51
95%
10
41%
300
54
95%
10
40%
400
55
95%
10
40%
500
56
95%
10
40%
1000
57
95%
10
40%
2000
58
95%
10
40%
≥3000
59
95%
10
40%
Con solamente 10 muestras por población, la probabilidad de detectar cualquier infección disminuye a 40% asumiendo un 5% de prevalencia.
La justificación comúnmente encontrada en el campo para trabajar con un número pequeño de muestras, es la frecuencia de muestreo. En este caso hay que proceder con precaución, ya que el error no se corrige tomando muestreos repetidos con poco número de muestras.

Si se toman 10 muestras, para detectar una prevalencia de 15% en una población de 2000 individuos, esta decisión reduce su nivel de confianza de 99% a 80%. Si se toman 13 muestras por lote, galpón o plantel cada 5 semanas, se estará trabajando siempre con 75% de confianza para detectar enfermedad con 10% de prevalencia.


Programa de monitoreo serológico y Línea de Base
Para obtener información consistente y que pueda ser realmente utilizada, es necesario que se realice un programa de monitoreo. El programa de monitoreo deberá definir cuáles son los objetivos de la serología, establecer la línea base, hacer la interpretación de los resultados y utilizarlos en la estrategia del control de las enfermedades. Una vez que se hayan establecido las líneas base para la edad de procesamiento, la interpretación de los títulos debe ser hecha en conjunto con los dados de producción, mortandad, decomisos y otros resultados de laboratorio. Cada empresa adopta un criterio propio, lo que sea más adecuado para sus objetivos y realidad. Es importante que esos resultados sirvan de base para la estrategia de control de las distintas enfermedades, de manera que se incremente la productividad. Este programa debe contener el número de muestras a ser tomadas, la frecuencia de la recolección, los objetivos de la serología y las líneas base. Las líneas base son los resultados esperados, en títulos de anticuerpos para una determinada empresa a lo largo de un determinado tiempo. A partir de las líneas base, se hace la interpretación de los resultados de los lotes de rutina. Los resultados de ELISA junto a la información de productividad y datos de campo, son usados para la estrategia de control de las enfermedades analizadas. Los resultados deben ser analizados de manera integrada, porque las condiciones de campo son dinámicas y las interacciones entre los distintos agentes etiológicos ocurre en diferentes fases de la producción.
Es importante recordar que la respuesta immune es compleja y la serología mide un segmento específico de esta respuesta que son los anticuerpos. Algunas empresas creen que el hecho de establecer una línea base y mantener el mismo programa de vacunación asegura que la granja este protegida y no sea necesario hacer más chequeos, sin embargo, las condiciones de campo están cambiando constantemente, y el objetivo de la serología es detectar lo cambios en los anticuerpos, de ser posible antes de los cambios en la salud de las aves.
¿Cuáles son las razones de realizar un continuo monitoreo en las reproductores, ponedoras comerciales y parrilleros?

Reproductores y Ponedoras Comerciales
Obtener datos para evaluar la eficiencia de los vacunadores, ya que pueden quedar muchas aves a las que no se les aplico la vacuna, este dato podría ser monitoreado con el coeficiente de variación (CV), al igual que este se vera afectado si las vacunas inactivadas están siendo administradas muy frías, por debajo de 23 º C lo cual, ocasionará una reacción exagerada en el sitio de inoculación y la captura parcial de los 0.5 o 0.3 cc de vacuna y por consiguiente del antígeno, lo que determinará que existan títulos muy bajos de menos de 1000 y el CV se incremente.

Establecer una línea de base para confeccionar programas de vacunación y determinar cuando el desafío de campo se hace presente.

Determinar la relación entre las condiciones clínicas de las reproductoras y de su progenie.
Vincular los datos de rendimiento productivo con los títulos de ELISA de diferentes enfermedades, estos conceptos son muy importantes en lo que respecta a Gumboro, reovirus, bronquitis y Newcastle ya que nos permiten establecer la prevalencia y su asociación con condiciones clínicas o subclínicas, que pudieran estar afectando la productividad de la granja o de la empresa.

Establecer el día más adecuado de vacunación contra la enfermedad de Gumboro, la vía de aplicación y uniformidad de la misma y la cepa elegida, que tendrá como consecuencia una respuesta inmunitaria más adecuada a las vacunas con virus respiratorios, porque tendremos menos reacciones y más fáciles de controlar, evitando los efectos en cadena ya que el sistema inmunitario no se ha visto afectado.

Evaluar cuan eficientes son los "priming" que estamos realizando previo a las vacunas inactivadas, al igual que la aplicación de las vacunas vivas y si estamos estimulando en forma correcta el sistema inmune, para una buena respuesta con las vacunas inactivadas.

De no lograr un buen estímulo con las vacunas vivas, especialmente en lo que respecta a Gumboro, Newcastle, bronquitis, EDS y reovirus, no podremos esperar un perfil adecuado del nivel de anticuerpos producidos después de la aplicación de las vacunas inactivadas, si no se ha logrado una respuesta uniforme a la vacunación, se verán afectados los coeficientes de variación de las vacunas inactivadas.
Podemos comparar rutas de aplicación de vacunas, en la eficiencia y uniformidad de los niveles de anticuerpos de los lotes.
Nos permite ver la eficiencia en la aplicación de vacunas ya sea en aerosol o en el agua de bebida y determinar que tamaño de gotas o micro gotas es más eficiente para cada integración avícola y antígeno vacunal.
Nos permite facilitar el análisis retrospectivo de lotes o planteles anteriores y de programas de bioseguridad, que reflejaron o reflejan mejores rendimientos productivos para la granja o la empresa y compararlos con los perfiles de anticuerpos reflejados en los títulos de ELISA, para las diferentes enfermedades en esos lotes.


Pollos Parrilleros
Conocer el nivel de anticuerpos maternales que presenta el pollito BB al nacer, es muy importante para prevenir reacciones respiratorias a las vacunas de Bronquitis y Newcastle.

Determinar si el lote o plantel que está saliendo a planta de faena, ha sufrido el desafío de algún agente infeccioso, lo cual debe servir como guía para realizar modificaciones en el intervalo entre lotes o planteles, eficiencia y tipo de desinfección necesaria para el siguiente lote o plantel que será alojado, el tratamiento que debería darse a los desechos avícolas de ese lote, tales como adecuada disposición de los cadáveres o mortandad, el tratamiento térmico de la cama de las granjas, para evitar la diseminación de los agente virales involucrados en la elevación de los títulos de NDV, IBV, anemia infecciosa aviar IBV, REO etc.
Realizar ajustes en seleccionar la ruta de aplicación de vacunas, cobertura vacunal, días de aplicación, realizar seguimientos de las reacciones respiratorias en cadena que pudieran ser las causas principales de los problemas respiratorios dentro de la granja.

Monitorear la posibilidad de procesos asociados con inmunosupresión de las aves, donde los títulos de respuesta vacunal contra antígenos vacunales como Newcastle, no se estén comportando de manera normal, con respecto a lotes que hayan mostrado rendimientos productivos adecuados y sistemas inmunes normales.

Establecer el día más adecuado de vacunación contra la enfermedad de Gumboro, la vía de aplicación y uniformidad de la misma y la cepa elegida, que tendrá como consecuencia una respuesta inmunitaria más adecuada a las vacunas con virus respiratorios, porque tendremos menos reacciones y más fáciles de controlar, evitando los efectos en cadena ya que el sistema inmunitario no se ha visto afectado.

Métodos Microbiológicos
Estas pruebas son definitivas ya que revelan la presencia de bacterias, hongos o virus que son los agentes productores de la enfermedad, ya sea por medio de su aislamiento, identificación y tipificación o bien por la demostración de sus antígenos, comúnmente se realizan a partir de los órganos, tejidos, líquidos, exudados, secreciones seleccionados para este propósito, también pueden realizarse aislamiento a partir de muestras de cama, nidos, polvillo de galpón, materias primas, alimento, agua, equipos, instalaciones etc.
Bacteriología
En bacteriología para la identificación de las bacterias utilizamos medios de enriquecimiento, específicos, selectivos preparados en el laboratorio o artificiales preparados por laboratorios comerciales, pruebas bioquímicas y serología con sueros anti estandarizados. La preparación de frotis con los gérmenes aislados, nos posibilita ver su comportamiento ante la técnica de Gram y su morfología. El resultado, lo expresamos en presencia del o de los gérmenes aislados con el género, especie, subespecie, biotipo, etc. Las pruebas biológicas como inoculación de animales de laboratorio, son de gran utilidad en algunos casos, en los que estamos en presencia de cultivos en los que aparecen contaminantes secundarios.
Virología
Para la identificación de los agentes virales, podemos inocular suspensiones centrifugadas o filtradas de tejidos, órganos, líquidos corporales, secreciones y exudados sospechosos en cavidad corioalantoidea, saco alantoideo y saco vitelino de embriones SPF( libres de gérmenes específicos y anticuerpos) en varias etapas de la incubación, en relación con el agente que queremos identificar.

Algunos laboratorios poseen microscopio electrónico que permiten la visualización de las partículas virales previo a una tinción específica.

La inoculación en cultivos celulares primarios y en líneas celulares con extractos de tejidos y líquidos corporales de las aves enfermas y también de muestras de hisopos de diferentes órganos, exudados, secreciones, cloacales, de cama, de nidos y de medio ambiente, también nos permite realizar aislamiento viral. Cuando tenemos un aislamiento viral debemos identificarlo y serotipificarlo, ya sea por sueroneutralización con antisueros, inoculación de cultivos celulares y embriones, hemaglutinación, tiempo de mortandad embrionaria, prueba de patogenicidad intracerebral en pollos, patogenicidad intravenosa en pollos de 6 semanas.

Con técnicas cualitativas como la inmunoflorescencia y la inmunoperoxidasa se pueden identificar subtipos antigénicos o cepas variantes en los tejidos macerados de órganos, líquidos corporales y frotis, con antisueros marcados con sustancias que permiten visualizarlo en el microscopio.
Micología
Podemos efectuar frotis de raspados de las áreas afectadas y agregar hidróxido de sodio al 10% para visualizar las hifas de los hongos al microscopio. Las técnicas de Gram, Giemsa y Wright pueden ser valiosas para visualizar hongos. Para aislamiento e identificación podemos utilizar medios específicos, selectivos preparados en el laboratorio y comerciales con el agregado de antibióticos para evitar el crecimiento de bacterias contaminantes.

Métodos Parasitológicos
Los métodos parasitológicos nos posibilitan la identificación y el número de parásitos existentes en las aves, que pueden ser internos o externos.
Si podemos remitir las muestras inmediatamente al laboratorio después de su colecta, debemos remitirlas refrigeradas, sin que se haga necesario el agregado de ningún conservador. En los pollos parrilleros la parasitosis más importante es la coccidiosis y se establecen de rutina programas de control de la misma, utilizándose medicamentos preventivos y vacunas o ambos. En la necropsia podemos establecer el grado de lesiones en el intestino y su localización. La prueba de McMaster nos permite diferenciar las especies de Eimeria identificándolas por su morfología, esta prueba detecta al parásito es su fase de oocisto y puede realizarse con materia fecal, contenido cecal o cama.

En el caso de reproductoras y ponedoras comerciales, es posible encontrar infestación por cestodos y nematodos, cuyos huevos se pueden detectar en materia fecal por la prueba de flotación, aunque la evaluación del grado de parasitosis es más confiable si se observa la cantidad de parásitos adultos a la necropsia.

A los ectoparásitos los identificamos morfológicamente con el microscopio y el grado de infestación puede interpretarse como leve, moderado o severo dependiendo del número de parásitos y de los signos clínicos que observamos en las aves.
Biología Molecular
Las pruebas moleculares para los patógenos aviares, nos permiten realizar la detección del material genético (DNA o RNA) de los microorganismos (virus y bacterias). Para poder realizar la identificación se requiere tener una cantidad suficiente de material genético, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permite ampliar la cantidad de DNA hasta niveles detectables y poder hacer la identificación específica del material genético por diferentes técnicas. Las pruebas de detección incluyen PCR, RT-PCR, PCR en tiempo real y PCR anidada. En las pruebas clásicas de PCR se amplifica e identifica una porción conocida del DNA. La identificación se realiza por tamaño y peso molecular en geles de agarosa o por hibridación con una sonda marcada para ser identificada. En la prueba RT-PCR el genoma de los virus RNA es convertido en DNA con una enzima Retrotranscriptasa para luego ser amplificado.
Para la cuantificar y determinar la composición exacta de los fragmentos de DNA se recurre a una técnica más especializada y costosa que es la Secuenciación, que se utiliza en todos aquellos casos que necesitamos saber si estamos en presencia de un virus de campo, una cepa vacunal o una cepa variante.
Métodos Químicos y Toxicológicos
Los métodos desarrollados tienen como objetivo poner a punto técnicas muy sensibles como la espectrofotometría de masas infrarrojas y absorción atómica, cromatografía de gases y de líquidos de alta resolución que permiten la detección de picogramos o nanogramos. Estas técnicas son altamente sensibles, precisas y reproducibles.
Bibliografia
  • A Laboratory Manual for the isolation and identification of Avian Pathogens. Fourth Edition 1998. The American Association of Avian Pathologists. BioChek Interpretation Manual 2010 BioChek Vaccination Date Prediction Manual 2010
  • Cardoso, B. Serologia y interpretación. In XXI SEMINARIO AVICOLA INTERNACIONAL, 2000, Bogotá, Colombia
  • Dra. Silvia Said, Dr Ricardo Muñoz Vigilancia de Poblaciones Vacunadas Mediante la Interpretación y Análisis de los Resultados Serológico (muestreo y tamaño de la muestra).
  • Mattar, N. F: Pesquisa de Marketing "Amostragem, Confiança e Número de Elementos da Amostra". Editora Atlas Sao Paulo, 2001. Enfermedades de las aves, 2da edición, México Editorial El Moderno, 2000. BioChek Newsletter. 2010/2011
  • Martin SW, Meek AH, and Willeberg P. (1987) Veterinary epidemiology - principles and methods. Iowa State University Press, Ames, Iowa. ISBN 0-8138-1856-7.
  • Nestor Mossos C. DMV, PhD, Trabajo complejo del diagnóstico en avicultura, exige responsabilidad del técnico que toma y envía las muestras al Laboratorio de Diagnóstico y de este que lo realiza. Laboratorio Nacional de
  • Diagnóstico del Instituto Colombiano Agropecuario ICA.
  • Sayd, S. Utilización del Elisa como importante herramienta en el control estratégico de las enfermedade aviares. In XXIV SEMINARIO AVICOLA INTERNACIONAL, 2003, Bogotá, Colombia
  • Silvia Zimmerman, DVM, MS IDEXX Laboratorios INC. Uso de la Serología, ELISA en la Industria Avícola, Medicina Preventiva, IDEXX.
 
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