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Longitud de las vellosidades intestinales y cantidad de clostridium perfringens en pollos de engorda de 6 semanas de edad aparentemente sanos

Publicado: 23 de agosto de 2012
Por: Guillermo Garcia Hernandez, Nestor Ledesma Martínez y odette urquiza bravo. Departamento de Medicina y Zootecnia de Aves, Universidad Nacional Autónoma de México, México, D.F.
Resumen

Se determinó la longitud de las vellosidades intestinales y la cantidad de Clostridium perfringens (Cp) en pollos de engorda de 6 semanas de edad aparentemente sanos. Se utilizaron 40 pollos de engorda (PE) Cobb 500, suministrándoles alimento base Sorgo (65%) Soya (25%) y bacitracina (0.030%) así como agua ad libitum. Las aves fueron sacrificadas al cumplir 6 semanas de edad y se tomaron muestras para bacteriología e histología. El estudio se llevó a cabo en dos grupos: 1) PE sacrificados con toma de muestras y procesado de las mismas directamente en granja y 2) PE sacrificados en laboratorio con procesamiento de las muestras en el mismo sitio. Sólo en las aves del segundo grupo se aisló Cp en promedio de 215 UFCs/g de muestra. No hubo correlación significativa entre el número de colonias y el tamaño de las vellosidades intestinales en ambos grupos con la dieta proporcionada. 

Palabras clave: Enteritis necrótica, Clostridium perfringens, Longitud de vellosidades intestinales.

INTRODUCCION
La enteritis necrótica (EN) es una enfermedad enterotoxémica que afecta principalmente al pollo de engorda de 4 a 8 semanas de edad o mayores aunque, también se ha descrito en pavos, patos y aves silvestres.1,2 Es causada por la infección de Clostridium perfringens (Cp) tipo A y C.3 La vía de transmisión es horizontal debido a que el Cp puede estar en la caseta, suelo, insectos, aves silvestres, roedores y alimento contaminado.
Los clostridios, al ser parte de la biota intestinal nativa de intestino grueso y sacos ciegos,4-9 son relativamente inocuos9,10 a menos que existan factores predisponentes como la coccidiosis,7,9,11-17 la impactación parcial del intestino grueso por ingestión de cama, grano o ambos, o la falta de provisión de piedras insolubles (grid), los cambios en la dieta,7,14,15 la restricción alimenticia prolongada.15 También el tamaño de la partícula del alimento menor a 4 mm puede predisponer al crecimiento de Cp,3 la formulación alimenticia basada en cereales como el trigo,1,4,14,15 centeno4,14 o cebada,1,4,14,15 dietas con alto contenido de harina de pescado,12,13 proteína con altos niveles de energía1,7,11 y el uso de proteínas de baja digestibilidad favorecen el crecimiento de Cp.4 Por otro lado se ha descrito que los agentes inmunodepresores como las micotoxinas4,14 y largos periodos de retiro del coccidiostato.3,4 también favorecen la disbiosis y por lo tanto la producción de sus toxinas.3,14,9
La EN comenzó a observarse con mayor frecuencia en Europa debido a la prohibición del uso de antibióticos promotores de crecimiento, ocasionando pérdidas por más de 2 billones de dólares anualmente a la industria avícola mundial,13 por decomiso de las canales al tener menor tamaño corporal y por las lesiones intestinales (hasta 4%) y hepáticas (hasta 12%) presentadas.14
La EN tiene 2 presentaciones, la subclínica, en la que las aves mueren sin haber mostrado ningún signo y la clínica en la cual las aves se reúnen en grupos, muestran el plumaje erizado, deshidratación,3,12 depresión, anorexia,1,7,13,14,16,18 se encuentran decúbito esternal,12 con pérdida de peso4 disminución en la velocidad de crecimiento y aumento de la conversión alimenticia1,7,14,15, y finalmente sobreviene la muerte.4
La mortalidad y la morbilidad puede llegar hasta 10% en parvadas sin tratamiento.6,19 El tiempo de incubación varía entre 7 a 10 días.7
Las lesiones macroscópicas que pueden ser observadas son: La mucosa intestinal presenta necrosis coagulativa14 lo que da una apariencia aterciopelada también conocida como toalla turca19 y puede estar completamente reemplazada por membranas diftéricas o pseudomembranas12,16 de color gris-café o amarillo-verde16 y restos celulares.5
El intestino puede encontrarse friable y distendido con gas.2,4,7,12,14,16 El hígado presenta focos necróticos de 2-3 mm en la superficie,4 aumento de tamaño y palidez.4,14 La vesícula biliar puede estar aumentada de tamaño, delgada y con contenido claro y viscoso,14 o inclusive puede romperse y causar peritonitis.7 Por otro lado, las lesiones microscópicas que se han descrito es que inicialmente se encuentran en el ápice de la vellosidad y se caracterizan por pérdida del epitelio, edema, necrosis coagulativa y colonización bacteriana de la lámina propia expuesta, infiltrado heterofilíco y de células mononucleares. Las lesiones secundarias se pueden apreciar en las criptas, capa submucosa y muscular del intestino.11,13,14 La mucosa intestinal presenta abundante fibrina mezclada con restos celulares adheridos a la mucosa necrótica4,14 dentro de este material se pueden observar bacterias Gram positivas.5,12,13
Aunque la cantidad de Cp detectada en intestinos de los PE es variable, no existen estudios en México precisos que demuestren cual es la cantidad normal de dichos microorganismos así como la relación que guarda con el tamaño de las vellosidades intestinales.
Por lo anterior, el objetivo del presente estudio fue determinar la longitud de las vellosidades intestinales y la cantidad de Clostridium perfringens en pollos de engorda de 6 semanas de edad aparentemente sanos, alimentados con una dieta comercial mexicana para conocer si existe relación entre estas variables.
 
MATERIAL Y METODOS
Se utilizaron 40 pollos de engorda estirpe Cobb 500 de 6 semanas de edad, con disponibilidad de agua limpia y fresca ad libitum. Las aves fueron alojadas en una caseta de ambiente natural desde el primer día de edad hasta el final del estudio para posteriormente dividirlos en dos grupos de 20 pollos cada uno. 
El alimento proporcionado fue con base Sorgo (65 %) Soya (25 %) y bacitracina (0.030%) como antibiótico promotor del crecimiento a libre acceso, hasta el final de la prueba.
Estudio Bacteriológico
Para la obtención de las muestras se amarraron 5 cm de la última porción del yeyuno junto con 5 cm de íleon de ambos grupos por separado en condiciones asépticas y se procesaron de la siguiente manera: Un gramo de cada muestra se maceró por separado y se depositó en 9 ml de Solución Amortiguadora de Fosfatos (PBS) estéril, para realizar diluciones décuples de 10-1 hasta 10-6.
Posteriormente se sembraron 3 gotas de 20 μl de cada dilución en agar gelosa sangre19,20 y se incubaron durante 24 a 48 hrs a 37ºC4,15, 19,20 en condiciones de anaerobiosis.*2*19,20 Una vez obtenidas las colonias con hemólisis doble se realizó la identificación por medio de pruebas bioquímicas1,21 glucosa, maltosa lactosa, sucrosa, indol, evaluación de la motilidad1,19,21 y leche tornasolada, además de observar morfología por tinción de Gram previamente. 
Estudio Histológico
De los mismos pollos utilizados en el estudio bacteriológico se tomaron 20 muestras de yeyuno y 20 muestras de íleon de ambos grupos, con un tamaño de 1 cm, obteniendo la muestra de la parte caudal del yeyuno, y la parte craneal del íleon de las muestras tomadas para bacteriología, introduciéndose en frascos con formalina amortiguada al 10% para su procesamiento22 y corte.
Se realizó un corte transversal de los segmentos de intestino obtenidos. Una vez obtenidas las laminillas se midieron 30 vellosidades intestinales de cada muestra, a partir de la cripta hasta el ápice de la vellosidad con un microscopio de luz** con el objetivo 4x y con el empleo de una cámara para la proyección de imágenes de microscopia en directo de alta resolución*** y un software especializado3.
Análisis estadístico
Para la comprobación de la hipótesis se utilizó la prueba de Coeficiente de correlación simple de Pearson.23

RESULTADOS
Estudio bacteriológico
Los resultados del análisis bacteriológico de las aves a las 6 semanas en los dos grupos no mostraron algún agente patógeno significativo en ninguno de los órganos.
En el estudio del grupo 1 no fue aislado Clostridium perfringens en ninguna de las aves, únicamente fueron encontradas bacterias de biota intestinal (Staphylococccus aureus y Actinomyces sp). En el grupo 2 fue aislado Cp en 6 muestras de intestino en la región de yeyuno e íleon. El promedio de colonias por gramo de heces fue de 215UFC/g (Cuadro 1). Así mismo fueron aisladas bacterias de biota intestinal (Staphylococccus aureus, Actinomyces sp, Acinetobacter calcoaceticus, Alcaligenes faecalis).
Estudio histopatológico
En el grupo1 la longitud promedio de las vellosidades de yeyuno fue de 1284.452 μm con un rango entre 905.7333 μm y 1488.153 μm. La desviación estándar fue 38.418, mientras que la longitud promedio de las vellosidades de íleon fue de 1299.388 μm con un rango entre 805.933 μm y 1563.8 μm. La desviación estándar fue 1299.388.
En el grupo 2 la longitud promedio de las vellosidades de yeyuno fue 1478.434 μm con un rango entre 1311.36 μm y 1631.41 μm. La desviación estándar fue 103.193 y la longitud promedio de las vellosidades de íleon fue de 1384.295 μm con un rango entre 1190.076 μm y 1486.316 μm. La desviación estándar fue 111.952 (Cuadro 2, Figuras 1 a 4).
Estudio estadístico
No se encontró relación estadísticamente significativa entre la longitud de las vellosidades intestinales y la cantidad de Clostridium perfringens en ambos grupos del experimento.

Discusión y Conclusión
Con la propuesta de regulación del uso de antibióticos promotores de crecimiento en México24 y el crecimiento de la demanda del consumidor por adquirir productos libres de APC es de vital importancia para los Médicos Veterinarios especialistas en aves conocer los valores esperados de UFC de Clostridium perfringens así como el tamaño de las vellosidades intestinales en PE sanos para poder tener una herramienta diagnostica para prevenir  la Enteritis necrótica.
Los resultados obtenidos en la grupo 1 del estudio fueron negativos a Cp, lo anterior es compatible con lo encontrado por Long JR et al., (1974)25 en un estudio realizado con pollos sanos, aves con signos de EN y aves muertas, en este estudio también se separó en 2 grupos, 1) aves enviadas al laboratorio y 2) casos de campo.
En el presente estudio en el grupo 2 se encontraron 215UFC/g de muestra, pero durante la obtención de las muestras no se observó ninguna lesión en intestino delgado o grueso. Batalle M et al., (2009) mostraron que sólo los PE que presentaban valores por arriba de 107UFC/g presentaban lesiones, así mismo, encontraron en el 82% de las muestras obtenidas un recuento de Cp menor o igual a 106, además encontraron que no había relación significativa entre las edades de las aves y el contenido intestinal de Cp.26 
Por otro lado, Long JR et al., (1974)25 encontraron que los valores normales en PE sanos es de 0 a 105 UFC /g y Svobodovà I et al., (2007) en un estudio en la república Checa donde muestrearon PE sanos Cobb 500, alimentados con pellet comercial con coccidiostato los resultados encontrados fueron de 0 a 105UFC/g.27 
Con relación en los resultados del estudio bacteriológico en ambas fases de este estudio, se observó que son compatibles con la literatura anteriormente citada, ya que no hubo factores predisponentes para favorecer un crecimiento excesivo de Cp como lo podría haber sido con coccidiosis u otros factores.
En cuanto a los resultados del estudio histológico, el tamaño en las vellosidades intestinales es considerado como un primer estudio que refleja el tamaño de las vellosidades intestinales en México, en pollo de engorda de 6 semanas de edad sanos alimentados con una dieta comercial y antibiótico promotor de crecimiento, ya que la información disponible solo cita el efecto de los estimuladores del crecimiento de vellosidades intestinales, además, actualmente no existe información precisa que relacione el tamaño de las vellosidades intestinales y la presencia de Cp bajo las condiciones anteriormente citadas.
Longitud de las vellosidades intestinales y cantidad de clostridium perfringens en pollos de engorda de 6 semanas de edad aparentemente sanos - Image 1
Longitud de las vellosidades intestinales y cantidad de clostridium perfringens en pollos de engorda de 6 semanas de edad aparentemente sanos - Image 2
Longitud de las vellosidades intestinales y cantidad de clostridium perfringens en pollos de engorda de 6 semanas de edad aparentemente sanos - Image 3
Agradecimientos
MVZ Félix D. Sánchez Godoy, MVZ María de Jesús Jiménez Flores, MVZ Israel Monroy Becerra, EMVZ Salvador Noguez Torres, Tec. José G. González López, Tec. Alfredo A. Díaz Estrada. 
 
Referencias
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Temas relacionados
Autores:
Nestor Ledesma
Asociacion Nacional de Especialistas en Ciencias Avícolas de Mexico (ANECA)
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Guillermo García Hernández
UNAM - Universidad Nacional Autónoma de México
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Odette Urquiza Bravo
UNAM - Universidad Nacional Autónoma de México
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Manuel Pizarro
Universidad Complutense de Madrid (UCM España)
7 de junio de 2013
Interesante estudio, aunque las diferencias histológicas entre duodeno caudal y yeyuno craneal son muy escasas o nulas.
Benjamin Barrientos Rangel
Nutrypollo
5 de junio de 2013
Muchas feliciades, un trabajo muy interesante,que bueno encontrarlos por estos foros. Reciban afectuosos y coordiales saludos desde Matehuala SLP. México.
Marianela Morales
15 de febrero de 2014
Hola, leí su trabajo y me pareció muy interesante!!! Quería contarle que estoy trabajando con un grupo de investigación sobre el agregado de probióticos y omega-3 en la dieta de pollos de engorde (sobre los beneficios que tiene sobre el crecimiento y la respuesta inmune), es parte de mi trabajo final de tesina. Nos gustaría poder medir la longitud de las vellosidades intestinales, por eso le quería pedir si me puede proporcionar información de la técnica que utilizaron para medirlas. Le agradecería mucho si me puede ayudar, sería muy importante agregar esta información. Muchas gracias!!!
 Dr. Gregus Zoltan
Phytobiotics
13 de agosto de 2013

Estimados Senores
Nuestra empresa no tiene el remedio para "deshacerse" de Clostridium pero si para disminuir el numero de los mismos? Un concentrado de fibra insoluble tambien ayuda el crecimiento de la vellosidad intestinal. Y se consigue tampien una cama hasta 10% mas seca.

Saludos

Luisa Alejandra Hernandez Aya
7 de agosto de 2013
Cordial saludo doctores, Excelente trabajo, sin embargo tengo una duda sobre la patogénesis del Clostridium, a parte del proceso enterotoxemico donde el clostridium se une células epiteliales del tracto gastrointestinal llegando al intestino grueso y ciego produciendo toxinas. También hay un proceso invasivo como lo hace la salmonella el campilobacter, entre otras bacterias?
Fabián Astudillo Riera
Universidad de Cuenca
5 de junio de 2013
Felicitaciones, es un exelente trabajo investigativo. Tengo una inquietud, si me pueden ayudar por favor, existe alguna relación con el consumo de maiz molido, vacunacion de newcastle y edad de 21 días con la presencia de Cp en forma patogena. Saludos Fabian Astudillo
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