Impacto del monitoreo serológico para anemia infecciosa en la eficiencia productiva de las aves comerciales

El virus de la anemia infecciosa aviar (CAV) causa pérdidas económicas relevantes a la avicultura internacional. Estas pérdidas están asociadas a un incremento de la mortalidad, reducción del performance de las aves, menor uniformidad del lote e incremento en los decomisos al momento del faenamiento ^2,3. Además, la inmunodeficiencia inducida por CAV ha sido asociada entre otras con la ocurrencia y/o aumento en la severidad de hepatitis con cuerpos de inclusión, coccidiosis, dermatitis gangrenosa enfermedad infecciosa de la bolsa de Fabricio (EIBF), y bronquitis infecciosa aviar ^1,6,8,9.

CAV, un virus DNA no envuelto perteneciente a la familia Circoviridae y genero Girovirus, determina anemia aplástica severa, trombocitopenia, e inmunodeficiencia transitoria debido a panleucopenia en pollos de 2 a 4 semanas de vida ^3,10. CAV también replica en aves de mayor edad pero las consecuencias clínicas y patológicas de dicha replicación no están claras⁷. La capacidad de CAV para ser transmitido por la vía vertical, es decir desde la progenitora a su progenie y además por la vía horizontal (principalmente oral) permitió la diseminación del virus por todo el mundo. Además, su extraordinaria resistencia en el medio ambiente hace que su erradicación sea prácticamente imposible. Debido al continuo incremento en el tamaño de las empresas avícolas además de una mayor preocupación por el medio ambiente, la reutilización reiterada de la cama se ha vuelto un manejo rutinario en las granjas avícolas comerciales. La limpieza y desinfección de los pabellones se realiza más distanciadamente en lugar de hacerse después de cada lote. Estos factores contribuyen a que en el ambiente de las parvadas de aves comerciales su exposición a CAV sea inevitable.

El control de CAV se basa en el conocimiento de que aves positivas a inmunoglobulinas (o anticuerpos) contra CAV se encuentran protegidas contra el desafío de campo. Como la enfermedad afecta principalmente a aves jóvenes y el desafío se inicia inmediatamente luego que las parvadas de pollos han sido dispuestas en el pabellón de crianza y engorda, la estrategia de prevención está orientada a inmunizar las aves reproductoras y de esta manera, proveer anticuerpos maternos a la progenie que los protegerán durante las primeras semanas de vida. La exposición e inmunización de las aves reproductoras contra CAV se realiza de diferente forma en distintas regiones del mundo. En general, las líneas de aves pedigrí, vice-abuelas y abuelas son siempre vacunadas activamente contra anemia infecciosa. En cambio, en aves reproductoras, las estrategias de inmunización varían empleando infección natural, vacunación activa, o una combinación de ambas dependiendo de las circunstancias epidemiológicas y de manejo locales.

Debido a la importancia de los niveles de anticuerpos específicos contra CAV en la protección adecuada de las progenies para efectivamente reducir o eliminar las pérdidas económicas consecuentes a una infección con CAV, el monitoreo serológico permanente y acucioso es imprescindible. Existen diferentes opciones para realizar serología incluyendo por ejemplo la neutralización viral en cultivos celulares pero los ensayos de ELISA son indudablemente los más atractivos y efectivos al balancear costos, cantidad de trabajo, y representatividad de los resultados. ELISA permite obtener datos individuales en número suficiente para permitir la conducción de pruebas estadísticas que proveen una estimación representativa del estatus inmunológico de la población de aves.

En términos generales existen dos tipos de kit de ELISA disponibles en el mercado; un ensayo de ELISA competitivo y un ensayo indirecto. La prueba de ELISA competitiva tiene la mayor cobertura a nivel internacional y esencialmente se fundamenta en la competencia que se produce entre los anticuerpos presentes en el suero de las aves y anticuerpos específicos contra CAV marcados (provisto en el kit) por el antígeno contenido en la placa. Por lo tanto, mientras mayor sea la concentración de anticuerpos en las aves, menor cantidad de anticuerpo marcado se une al antígeno y la lectura de densidad óptica del medio es menor. Por el contrario, menores concentraciones de anticuerpos en las aves determinan mayor unión del anticuerpo marcado y detección de densidades ópticas mayores. Por supuesto la aplicación de procedimientos de matemática simple permite expresar las concentraciones de anticuerpos en forma de títulos de anticuerpos. Algunos autores indican que las pruebas competitivas en general exhiben menores problemas respecto a unión no especifica de los anticuerpos de los pollos a antígenos celulares.

4). En la prueba de ELISA indirecta la concentración de anticuerpos en las aves es directamente proporcional a la lectura de densidad óptica.

Fig. 1. Anticuerpos contra CAV (expresados como razón S/N) detectados por ELISA competitivo (Idexx) en reproductoras broiler comerciales de 18-30 semanas sometidas a infección natural con CAV (Toro, H., datos no publicados). Lotes A a S pertenecen a una operación en el estado de Arkansas. Sueros (n=15-22/lote) fueron diluidos 1:10 en el laboratorio de la empresa. Valores S/N <0.2 considerados completamente protectivos y valores >0.6 negativos a anticuerpos específicos. En la figura 64% (11/17) de lotes muestran promedios S/N <0.2 y 41% (7/17) de lotes muestran porcentajes variables de individuos con S/N >0.6.

Algunos aspectos relevantes a tener en consideración al realizar monitoreo serológico por ELISA incluyen el tamaño de la muestra, la dilución de la muestra de suero y el momento en que se realiza el monitoreo.

Varios factores influyen el tamaño de la muestra en el monitoreo serológico y medición del éxito post-vacunación en aves comerciales. En general, la Asociación Americana de Patólogos Aviares (AAAP) sugiere un mínimo de 20 muestras en el caso de pollos broiler y un mínimo de Valores de S/N <0.2 indican niveles altamente protectivos y valores >0.8 indican ausencia de anticuerpos cuando se ocupa la dilución 1:100. Como se aprecia de los resultados, la dilución menor (1:10) sobrestima los niveles de anticuerpos.

Fig. 2. Niveles de anticuerpos expresados como razón S/N detectados mediante ELISA competitivo(Idexx) en 2 lotes de reproductoras broiler del estado de Arkansas. Las mismas muestras de suero fueron testeadas en dilución 1:10 y 1:100.

30 muestras de suero en el caso de lotes de gallinas reproductoras a ser empleado para obtener una adecuada representatividad del estatus serológico de aves comerciales (5). Estos números se fundamentan en la concentración de animales por metro cuadrado y las características de algunos agentes infecciosos. Ciertamente que la detección serológica de agentes infecciosos de muy baja prevalencia y/o muy baja transmisibilidad pueden requerir tamaños de muestra mayores.

Tamaños de muestra inferiores a los sugeridos, particularmente en el caso de CAV, pueden determinar la falta de detección de reproductoras negativas, que aunque fuera reducido, se infectará durante la etapa de postura y transmitirá verticalmente la infección a un porcentaje de la progenie. El aumento de pérdidas económicas en sólo unos pocos puntos porcentuales es relevante en empresas avícolas altamente eficientes y con altos estándares productivos.

El adecuado monitoreo serológico permite demostrar por ejemplo que el uso exclusivo de infección natural y la abstención de emplear vacunación en gallinas reproductoras desafortunadamente no produce los efectos de protección deseados. Efectivamente, y como se muestra en la figura 1, aunque los promedios de niveles de anticuerpos presentes en los lotes de reproductoras son adecuados, un porcentaje de ellas claramente presenta bajas concentraciones o incluso ausencia de anticuerpos contra CAV (los datos han sido presentados en forma de razón S/N y por lo tanto valores menores indican mayores títulos en las aves). En esta figura además se realizaron las mediciones de anticuerpos empleando una dilución del suero de las aves de 1:10 lo cual es inadecuado para la correcta determinación de anticuerpos cuando se emplea el kit de ELISA competitivo. Al emplear la dilución 1:10 se sobreestiman los valores (dilución del suero discutida más abajo) y por lo tanto el problema en estos lotes probablemente sea aún mayor. La falta de homogeneidad en los títulos de anticuerpos consecuentes a infección natural se debe fundamentalmente a la falta de homogeneidad de la concentración de CAV en el galpón. Las reproductoras con ausencia o bajas concentraciones de anticuerpos son proclives a infectarse durante la postura y producir progenies positivas a CAV. A su vez, los pollos progenie infectados verticalmente podrán transmitir la enfermedad a otros pollos progenie que presenten concentraciones de anticuerpos maternos sub-óptimos.

Otro problema frecuente es el uso de la correcta dilución del suero al realizar la prueba de ELISA. En otras palabras, se busca emplear aquella concentración antígeno-anticuerpo que permita la mayor formación y detección de complejos inmunes.

La relación entre la concentración de antígenos y anticuerpos favorece o desfavorece la formación de complejos inmunes en los fenómenos conocidos como “prozona” cuando hay exceso de antígeno, “postzona” cuando hay exceso de anticuerpo y “equivalencia” cuando las concentraciones de ambos son óptimas. El empleo de una dilución 1:10 del suero en ELISA competitivo comercial determina un aumento del número de falsos positivos y por lo tanto una sobrestimación de los niveles de anticuerpos de la población. Por ello se recomienda emplear esta dilución solo en planteles libres de patógenos específicos (SPF) en los cuales se espera encontrar completa negatividad. En la prueba de ELISA competitivo comercial la dilución 1:100 se aproxima a la zona de equivalencia y por lo tanto los valores de anticuerpos efectivamente representan a la población. En la figura 2 se muestran concentraciones de anticuerpos (presentados como razón S/N) de los mismos 2 lotes de aves comerciales que fueron chequeados en dilución 1:10 y 1:100. Como se muestra en esta figura, los datos obtenidos con la dilución 1:100 muestran una gran diferencia respecto de los datos obtenidos con la dilución 1:10.

Efectivamente en ambos lotes la dilución 1:10 indica que todas las aves son altamente positivas mientras que la dilución 1:100 muestra que ni los promedios ni los valores individuales son óptimos para la efectiva prevención de CAV.

Finalmente, el momento del monitoreo en reproductoras es relevante dependiendo del tipo de vacuna a emplear. En general la vacunación parenteral con cepas altamente atenuadas induce anticuerpos sistémicos antes que la vacunación oral con vacunas de baja atenuación. La razón es obvia por cuanto el virus aplicado por la vía oral debe vencer varias barreras defensivas antes de alcanzar una concentración viral tal que permita la inducción de defensas. Sin embargo su ventaja es que inducirá respuestas en un mayor número de órganos inmunes que la vacunación parenteral. Por lo tanto la medición de anticuerpos sistémicos por ELISA luego de vacunación oral deberá realizarse 5 a 6 semanas después de la vacunación mientras que puede realizarse 3 a 4 semanas después de la vacunación parenteral. También es importante recordar que dependiendo del programa de vacunación empleado, las reproductoras tienden a producir progenies negativas a anticuerpos contra CAV a medida que envejecen. Por lo tanto, es aconsejable monitorear las reproductoras entre las 20 y 40 semanas y nuevamente después de las 40 semanas para tener una idea clara sobre el nivel de protección que están recibiendo las progenies.

Anemia infecciosa es una enfermedad insidiosa a diferencia de enfermedades catastróficas. Sus pérdidas económicas se hacen relevantes en planteles avícolas que mantienen buen manejo y altos parámetros productivos. La optimización de la producción y beneficio económico en estos planteles tiene relación con vacunación que induzca inmunidad alta y duradera en las reproductoras así como un seguimiento serológico efectivo que permita monitorear el éxito de los programas de vacunación empleados.

 

1. Bülow, v. V., B.F.R. Rudolph. Folgen der Doppeltinfektion vom Küken mit Adenovirus oder Reovirus und dem Erreger der Infektiösen Anemie. J. Vet. Med. 33:717-726. 1986.
2. Hoerr, F. J., H. Toro, S. F. Biligi, P. Mohylia. An investigation of undersized broilers condemned at processing as septicemia-toxemia. 2004 Annual AVMA/AAAP Meeting, pp. 86. Philadelphia, Pennsylvania; 2004.
3. McNulty, M. S. Chicken anaemia agent: a review. Avian pathology 20:187-203. 1991.
4. McNulty, M. S., D. Todd. Chicken anemia virus. In: A laboratory manual for the isolation, identification and characterization of avian pathogens. L. Dufour-Zavala, D. E. Swayne, J. R. Glisson, J. E. Pearson, W. M. Reed, M. W. Jackwood, and P. R. Woolcock, eds. Am. Assoc. Avian Pathol., Athens, GA. pp 124-127. 2008.
5. Thayer, S.G., C.W. Beard. Serologic procedures. In: L. Dufour-Zavala, D. E. Swayne, J. R. Glisson, J. E. Pearson, W. M. Reed, M. W. Jackwood, and P. R. Woolcock (eds.), A laboratory manual for the isolation, identification and characterization of avian pathogens, pp. 222-229. Athens, GA: Am. Assoc. Avian Pathol.; 2008.
6. Toro, H., C. González, L. Cerda, M. Hess, E. Reyes, C. Geisse. Chicken anemia virus and fowl adenoviruses: Association to induce the inclusion body hepatitis/hydropericardium syndrome. Avian Diseases 44:51-58. 2000.
7. Toro, H., A. M. Ramirez, J. Larenas. Pathogenicity of chicken anaemia virus (isolate 10343) for young and older chickens. Avian Pathology 26:485-499. 1997.
8. Toro, H., V. L. van Santen, F. J. Hoerr, C. Breedlove. Effects of chicken anemia virus and infectious bursal disease virus in commercial chickens. Avian Diseases 53:94-102. 2009.
9. Toro, H., V. L. van Santen, L. Li, S. B. Lockaby, E. van Santen, F. J. Hoerr. Epidemiological and Experimental Evidence for Immunodeficiency Affecting Avian Infectious Bronchitis. Avian Pathology 35:1-10. 2006.
10. van Santen, V. L., K. S. Joiner, C. Murray, N. Petrenko, F. J. Hoerr, H. Toro. Pathogenesis of chicken anemia virus: comparison of the oral and the intramuscular routes of infection. Avian Diseases 48:494-504. 2004.