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Evaluación experimental de una prueba para detección rápida de antígeno del virus de la enfermedad de newcastle

Publicado: 23 de octubre de 2012
Por: Ruben Merino, Salvador Noguez (Departamento de Medicina y Zootecnia de Aves, FMVZ, UNAM), Otilio Ortiz Garcia y Alejandro Garcia (Laboratorios Avilab SA de CV). México
Resumen

La enfermedad de Newcastle es una infección cuyo diagnóstico debe ser rápido para iniciar de inmediato las medidas de control. En este estudio se evaluó el funcionamiento de una prueba rápida de inmunocaptura que permite la detección del virus en menos de 10 minutos. Se desafiaron 15 pollos SPF de 25 días de edad con la cepa Chimalhuacán por vía ocular y nasal. El 60% de las aves desafiadas murió entre 4 y 7 días post desafío, a la necropsia se encontraron petequias en el proventrículo y tonsilas cecales. Se evaluaron muestras de orofaringe, tráquea, pulmón y bazo para detección del virus por aislamiento viral, PCR en tiempo real e inmunocaptura. El aislamiento y PCR fueron positivos en todas las aves muertas, la inmunocaptura fue positiva solo a los 5 días post-desafío. Se recomienda evaluar la prueba de inmunocaptura en aves comerciales vacunadas y desafiadas experimentalmente.

Palabras clave: enfermedad de Newcastle, inmunocaptura, cepa Chimalhuacán

Introducción
La enfermedad de Newcastle (EN) es una infección viral de distribución mundial, contagiosa y letal de las aves domésticas y silvestres, causa alta morbilidad y mortalidad en las mismas. Es una enfermedad que se incluye en la lista de enfermedades de la Organización Mundial de Sanidad Animal, OIE (2). Por muchos años ha sido una enfermedad devastadora de las aves domésticas y en muchos países permanece como uno de los mayores problemas que afectan las industria avícola, ya que puede causar mortalidad hasta del 100% (1, 2, 4). Desde los primeros brotes de la enfermedad en el país, ha sido un serio problema sanitario y de comercialización para la avicultura nacional; por lo que para elevar la producción y mejorar la calidad sanitaria de los productos de origen avícola, fue necesario establecer un control estricto, con la finalidad de lograr su erradicación para permitir a la avicultura nacional un desarrollo en mejores condiciones sanitarias.
Un factor esencial para el control de agentes altamente infecciosos es el tiempo que se requiere para la confirmación de los casos. Este tiempo depende de varios factores, incluidos el sistema de vigilancia efectivo, logística adecuada para la recolección y manejo de las muestras, y la velocidad y precisión de las pruebas diagnósticas. 
Hasta hace poco, en México no se utilizaba ninguna prueba rápida de diagnóstico como PCR o cualquier otra de caracterización molecular. Con la reciente incorporación de estas pruebas moleculares y la implementación de la caracterización viral, se puede llevar a cabo la rápida identificación del virus de EN y aplicar medidas rápidas de control (3); sin embargo, son pocos los lugares donde se llevan a cabo estas pruebas y pueden pasar algunos días antes de la confirmación del diagnóstico.
El objetivo de este trabajo fue evaluar una prueba de inmunocaptura para la detección rápida del virus de la enfermedad de Newcastle a partir de hisopos tomados de aves desafiadas experimentalmente con la cepa Chimalhuacán. 
 
Material y métodos
Aves de experimentación. Se emplearon 15 pollos libres de patógenos específicos, ALPES, de 10 días de edad, los cuales fueron alojados en una unidad de aislamiento en el Departamento de Medicina y Zootecnia de Aves (DMZA) de la FMVZ, UNAM. Las aves recibieron calefacción, iluminación, agua y alimento de acuerdo con los parámetros comerciales estándar.
 
Virus de desafío
Se empleó la cepa virulenta Chimalhuacán del virus de la enfermedad de Newcastle. 
Desafío. Las aves fueron desafiadas a los 25 días de edad por vía ocular y nasal, con dosis de 106.3 DIEP50/0.1 ml, 50 ul en un ojo y 50 ul en una narina. Después del desafío, las aves se mantuvieron en observación por 12 días  
se registraron los signos clínicos, mortalidad y hallazgos a la necropsia que se presentaron durante el periodo.
Prueba serológica. Se realizó la prueba de inhibición de la hemoaglutinación para la detección de anticuerpos contra el virus de la EN a los 10 y 25 días de edad de los pollos, de acuerdo con la metodología descrita (5).
Detección del virus
Aislamiento viral – RT-PCR. A partir de las aves muertas después del desafío se obtuvieron muestras de pulmón, tráquea y bazo para el aislamiento viral, el cual se llevó a cabo de acuerdo con la metodología descrita (5). Las mismas muestras se usaron para detectar, por PCR en tiempo real, el segmento del genoma del virus que codifica para la proteína de Fusión, de acuerdo con el protocolo descrito por (6). Las aves sobrevivientes fueron sacrificadas por dislocación de vértebras cervicales, se les realizó la necropsia y se tomaron muestras para aislamiento y PCR.
Inmunocromatografía. Se utilizó la prueba comercial Anigen NDV Ag (BioNOTE Inc., Gyeonggi-do, Corea, 445-170), la cual es un ensayo inmunocromatográfico basado en el método directo de sándwich que emplea dos anticuerpos monoclonales anti Newcastle, uno de captura y otro de detección. Se tomaron cuatro hisopos traqueales a los días 1, 3, 5, 7, 9 y 12 post desafío. 
Los dispositivos se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En breve: Después de dejar atemperar los reactivos, se retiraron los dispositivos del empaque y se colocaron en usa superficie plana y seca, con los hisopo que vienen incluidos en el estuche se obtuvieron las muestras a partir de la orofaringe y tráquea, posteriormente se insertaron los hisopos en los tubos que contienen 1 ml del diluyente y se mezclaron vigorosamente para extraer al virus, después de retirar los hisopos, con las pipetas-gotero incluidas en el estuche se obtuvieron las muestras de los tubos y se colocaron 4 gotas en el área correspondiente del dispositivo. Los resultados se leyeron en un periodo máximo de 10 minutos.
Interpretación. Aparece una banda de color en la zona distante al área de colocación de la muestra, lo que demuestra que la prueba corrió adecuadamente (banda control o “C”). La zona cercana al área donde se colocó la
muestra indica el resultado de la prueba (banda “T”). La presencia única de la banda “C” indica un resultado negativo. La presencia de dos bandas de color (“T” y “C”) indica un resultado positivo. 
Resultados

Serología. Todas las aves fueron negativas a la presencia de anticuerpos a la recepción en el DMZA y en el día del desafío. Signos clínicos. Empezaron a los 3 días post desafío (dpd) y se caracterizaron por pluma erizada, excesiva producción de moco, lagrimeo constante, inflamación de parpados y se escucharon estertores traqueales, la gravedad de los signos se acentuó rápidamente, por lo que las aves se postraron y dejaron de consumir agua y alimento. A partir de los 8 dpd inició la recuperación clínica de las aves; sin embargo, de las 5 aves sobrevivientes a los 12 dpd, 3 mostraron signos nerviosos caracterizados por incoordinación y epistótonos.
Mortalidad. Diez de las 15 aves desafiadas murieron durante el periodo de observación (67% de mortalidad), el mayor porcentaje de mortalidad se observó entre el 4° y 7° dpd (Cuadro 1).
Lesiones. Durante la necropsia de las aves muertas se observaron petequias en la mucosa del proventrículo y en las tonsilas cecales.
Detección del virus
Los resultados de las pruebas de aislamiento, PCR e inmunocromatografía se muestran en el cuadro 1. Todas las aves muertas resultaron positivas al virus por aislamiento y PCR, la inmunocromatografía resultó positiva sólo a los 5 dpd. Las aves que sobrevivieron y fueron sacrificadas a los 12 dpd resultaron negativas al virus Chimalhuacán por las 3 pruebas.

Discusión
México está próximo a ser declarado libre de la enfermedad de Newcastle en la avicultura comercial; sin embargo, la presentación de focos en aves de traspatio y de combate representa un riesgo de introducción de la infección en la avicultura industrializada. Las pruebas rápidas de diagnóstico como PCR y la caracterización molecular se han establecido recientemente en el país para identificar rápidamente al virus, caracterizarlo y aplicar medidas inmediatas de control (Heneidi, 2011). Sin embargo, hay poca disponibilidad de pruebas que puedan llevarse a cabo in situ, que sean económicas y de alta confiabilidad.
En este estudio, se observó que la prueba de inmunocaptura evaluada solo pudo detectar al virus de desafío a los 5 dpd, mientras que al aislamiento viral y PCR lo detectaron en todas las aves muertas entre los 4 y 7 dpd. La incapacidad del dispositivo para la detección del virus en periodos más tempranos o tardíos de la infección puede estar asociada con la carga antigénica que se necesita en la muestra para que esta resulte positiva.
A pesar de su relativa baja sensibilidad, la facilidad de uso de la prueba la hace candidata a ser utilizada en lugares donde la velocidad para la obtención del resultado sea crítica, por ejemplo en el caso de parvadas de aves con manifestaciones clínicas compatibles con la infección, o durante la inspección sanitaria en las plantas de procesamiento, cuando se examinan las vísceras o cavidades corporales y se detectan lesiones sugestivas de la enfermedad de Newcastle, ya que el dispositivo ha sido validado por el fabricante para ser empleado en suspensiones de 20% a 50% de tejidos como el bazo o el riñón.
Los programas intensivos de vacunación estimulan la alta producción de anticuerpos circulantes, los cuales pueden enmascarar los signos clínicos en parvadas infectadas y facilitar la circulación del virus (Heneidi, 2011), 
la utilización de esta prueba rápida de inmunocaptura en intervalos regulares de tiempo, puede ser auxiliar para la identificación de estas infecciones, por lo que se recomienda realizar estudios en pollos de engorda y gallinas de postura vacunados y desafiados experimentalmente, para evaluar su valor diagnóstico. 

Referencias
1. Alexander DJ. Newcastle disease and other avian paramyxoviruses. Rev Sci Tech, 2000, 9: 443-462.
2. Alexander DJ. Newcastle diseases, other avian paramyxoviruses, and pneumovirus infections. In: Saif YM, editor. Diseases of poultry. 12th edition. Ames, Iowa: Blackwell Publishing, 2008: 75-100. 
3. Heneidi A. Lineamientos técnicos para la prevención, control, erradicación y vigilancia epidemiológica de la enfermedad de Newcastle. Memorias del Curso pre-congreso: Vigilancia epidemiológica de la enfermedad de Newcastle. Septiembre 26 y 27. San Andrés Cholula, Puebla. SENASICA – ANECA – AMEV. 2011. 
4. Kouwehoven B. Newcastle disease. In: McFerran JB and McNulty MS, editors. Virus infections of birds. New York, United States of America: Elsevier Science Publishers, 1993: 341-361. 
5. Norma Oficial Mexicana NOM-013-ZOO- 1994, Campaña nacional contra la enfermedad de Newcastle presentación velogénica. México (DF): 7 de febrero de 1995. 
6. Wise MG, Suarez DL, Seal BS, Pedersen JC, Senne DA, King DJ, Kapczynski DR, Spackman E. Development of a Real-Time Reverse- Transcription PCR for detection of Newcastle disease virus RNA in clinical samples. J. Clin. Micro. 2004, 42:329-338. 
 
Evaluación experimental de una prueba para detección rápida de antígeno del virus de la enfermedad de newcastle - Image 1
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Autores:
Ruben Merino
UNAM - Universidad Nacional Autónoma de México
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Otilio Ortiz Garcia
Asociacion Nacional de Especialistas en Ciencias Avícolas de Mexico (ANECA)
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Alejandro Garcia
Asociacion Nacional de Especialistas en Ciencias Avícolas de Mexico (ANECA)
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Cesar Torres
24 de octubre de 2012
Estimados Amigos. Agradezco gentilmente la publicación de este artículo, para los criadores y enrazadores de aves, es de mucha importancia.
Pablo Orlando Hernandez Garcia.
24 de octubre de 2012
Saludos Este articulo es muy importante para los criadores de traspatio que no contamos con el servicio rapido de laboratorios, ademas nos permitira establecer medidas de bioseguridad, aunque nuestra producción sea a baja escala, ya que se trata de una enfermedad ( Newcastle) muy desvastadora. Gracias a los autores y a Engormix por hacernos llegar esta información.
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