Estudio de reversión a la virulencia para la evaluación de una vacuna comercial contra la enfermedad de newcastle y bronquitis infecciosa en aves libres de patógenos específicos.

La Enfermedad de Newcastle (ND) es causada por un Paramixovirus (PMV-1) del género Avulavirus. Esta enfermedad llega a producir mortalidades hasta de un 70%, dependiendo de la cepa de campo involucrada; de ello también depende la presentación de signos clínicos, aunado a la patogenicidad del virus, edad de las aves, integridad del sistema inmune, factores ambientales y microorganismos complicantes de otras enfermedades. Sin embargo, a veces sólo se presentan signos respiratorios difíciles de diferenciar de la bronquitis infecciosa o influenza aviar(1, 6).

La Bronquitis Infecciosa aviar (IB) es una enfermedad causada por un virus RNA de la familia Coronaviridae. La enfermedad suele definirse como aguda y altamente contagiosa en las aves y se caracteriza fundamentalmente por la presencia de signos respiratorios. Sin embargo, las infecciones por este agente causal también pueden originar nefritis (aguda o crónica) y problemas en la producción de huevo de las aves de postura. La gravedad de las infecciones respiratorias causadas por este virus puede aumentar mucho debido a la presencia de otros patógenos del tracto respiratorio(3,7).

La inmunización en las aves es el principal método utilizado en el control de ND e IB. Las vacunas deben prevenir la enfermedad en pocas semanas con una sola administración(2); también necesitan ser seguras y no causar alguna reacción adversa, así como inmunodepresión o interferencia de inmunidad con otras vacunas administradas de manera simultánea(10). Las vacunas vivas son aquellas que pueden ser capaces de replicarse en animales. La estabilidad genética debe estar presente para asegurar la ausencia en la reversión a virulencia de los organismos de vacunas vivas, los cuales pueden causar la enfermedad(11).

Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue determinar si existe reversión a la virulencia de las semillas de una vacuna comercial bivalente contra la enfermedad de Newcastle (ND) cepa LaSota, y la bronquitis infecciosa (IB) cepas Connecticut y Massachusetts, en aves libres de patógenos específicos (SPF) de un día de edad, de acuerdo a las pruebas de seguridad y secuencia de aminoácidos para el caso de ND, y en base a la prueba de seguridad de tracto respiratorio y riñón para el caso de IB. Este estudio fue diseñado para evaluar la tendencia de esta vacuna para revertir a la virulencia, ya que es un requisito el cual solicitan las regulaciones internacionales.

Se utilizaron un total de 560 aves libres de patógenos específicos sanas de 1 día de edad, de acuerdo en lo establecido en la Farmacopea Europea 2011. La evaluación fue dividida en 2 fases:
 

Para esta primera parte fueron utilizadas 320 aves libres de patógenos específicos de un día de edad. Inicialmente fueron distribuidas al azar 80 aves en los grupos experimentales 1, 2, 3 y 4, con 20 aves cada uno, para la inoculación inicial con cada una de las semillas (PIVs) y el placebo, respectivamente. 

Posteriormente, fueron realizados pases sucesivos después de la inoculación inicial, hasta completar 6 inoculaciones de cada semilla de la vacuna. Al grupo control negativo sólo se le aplicó diluente ocular como placebo y se le realizaron 5 pases sucesivos del mismo modo que a los PIVs. 

A partir del segundo pase, fueron formados los grupos experimentales siguientes y fue determinado el número de aves de cada grupo para cada pase sucesivo. Cada ave recibió un tratamiento de acuerdo a lo descrito en el cuadro 1, “Diseño del estudio”. 

Las aves fueron eutanasiadas después de 4 días post-inoculación. Se realizó la colección de las muestras para la elaboración del inóculo del siguiente pase, correspondiendo a tráquea y encéfalo para ND, y tráquea y tonsilas cecales para cada una de las cepas de IB. Las muestras de órganos correspondientes a cada semilla fueron tomadas en pool y resuspendidas con TPB para el macerado en morteros estériles. El sobrenadante fue extraído con jeringa estéril y filtrado a través de una membrana con poro de 0.2 μm para obtener el nuevo inóculo del siguiente grupo de aves, utilizando la misma vía de administración.

El investigador fue responsable de la salud de las aves durante la prueba. Los grupos de los tratamientos y el grupo control fueron asignados al azar y por separado en unidades de aislamiento. Las aves tuvieron libre acceso
al alimento y al agua durante la prueba. 

El pase inicial y final de cada cepa fueron utilizados para la evaluación de la efectividad de acuerdo a los parámetros establecidos en la Farmacopea Europea 2011: 

· Secuenciación de aminoácidos para el gen de la glicoproteína F

A los pases final e inicial se les realizó la técnica de RT-PCR de acuerdo a lo descrito por Merino et al(4), con los inciadores que amplifican un fragmento de 563 pb para el gen de la glicoproteína F del genoma del virus de ND. Posteriormente, el producto de PCR fue purificado para su posterior secuenciación.

· Porcentaje de mortalidad en la prueba de seguridad

Fueron formados 3 grupos experimentales, cada uno con 20 aves. Cada grupo fue considerado como una unidad experimental, para comparar la mortalidad. Al grupo A se le aplicó 10 veces el título máximo vacunal de la semilla ND LaSota inicial, administrando 0.03 ml vía gota ocular a cada ave. Al grupo B se le aplicó en misma dosis y vía de administración el pase final ND. El grupo C solamente recibió en misma cantidad y vía de administración el
placebo (ver cuadro 2). Las aves fueron observadas diariamente durante 21 días y registrando la mortalidad existente.

· Porcentaje de mortalidad en la prueba de seguridad

Fueron formados 5 grupos experimentales, cada uno con 20 aves. Cada grupo fue considerado como una unidad experimental, para comparar la mortalidad. Al grupo D se le aplicó 10 veces el título máximo vacunal de la semilla IB Mass inicial, administrando 0.03 ml vía gota ocular a cada ave. Al grupo E se le aplicó en misma dosis y vía de administración el pase final IB Mass. Al grupo F se le aplicó 10 veces el título máximo vacunal de la semilla IB Conn inicial en misma dosis y vía de administración. Al grupo G se le aplicó en misma dosis y vía de administración el pase final IB Conn. El grupo C (control negativo) fue compartido con la prueba de seguridad de ND, y solamente recibió en misma cantidad y via de administración el placebo (ver cuadro 2). Las aves fueron observadas diariamente durante 10 días y fue registrada la mortalidad existente. 

· Actividad ciliar y examen histológico de los riñones (Seguridad para el Tracto Respiratorio y los Riñones)

De los 5 grupos formados para la prueba de seguridad, se realizó la eutanasia de 5 aves a los 10 días después de la administración del virus, y fueron tomadas muestras de la tráquea y los riñones de cada ave. Se enviaron muestras de los riñones en formalina al 10% para examen histológico. Las tráqueas fueron extraídas y preparadas en 3 cortes transversales de la parte superior, central e inferior de la tráquea de cada ave; fueron examinados todos los explantes traqueales con un microscopio de poco aumento, tan pronto como fue posible y al menos 2 h después de la toma de muestra, para observar la actividad ciliar. Puntuar la ciliostasis en una escala del 0 (100  por ciento de actividad ciliar) al 4 (sin actividad, ciliostasis completa); calcular el valor medio de la ciliostasis (siendo el máximo para cada tráquea 40) para los 5 pollos sacrificados a los 10 días post-inoculación(8). Estas  muestras fueron enviadas para su evaluación a un laboratorio externo.

 

Evaluación de la Efectividad Fracción ND De acuerdo a la Farmacopea Europea 2011(9), el virus vacunal satisface el ensayo si en las evaluaciones de secuencia de aminoácidos y la prueba de seguridad no se observa ningún signo de aumento de la virulencia entre el virus que no ha experimentado ningún pase y el virus que ha experimentado el mayor número de pases. El virus vacunal también satisface el ensayo si no se recuperan virus en ningún pase en la primera y la segunda serie.

Porcentaje de mortalidad en la prueba de seguridad

El ensayo no es válido si más del 10 por ciento de las aves presentan signos clínicos anormales o muere por causas no atribuibles al virus vacunal. El virus vacunal satisface el ensayo si ninguna de las aves presenta signos clínicos notables de la enfermedad de Newcastle o muere por causas atribuibles al virus vacunal.

El virus satisface el ensayo si la secuencia obtenida es la descrita en el cuadro 3 (opción 1), o una secuencia equivalente que contenga leucina en la posición 117 y sin aminoácidos básicos en las posiciones 111, 112, 114 y 115
(opción 2)(9).

De acuerdo a la Farmacopea Europea 2011, el virus vacunal satisface el ensayo si no se observa ninguna indicación de aumento de la virulencia entre el virus antes del pase y el virus que ha experimentado el mayor número
de pases. Si no se recupera el virus en ningún nivel de pases en la 1ª y 2ª series, el virus vacunal satisface igualmente el ensayo. Realizar el ensayo de seguridad para el tracto respiratorio y riñón(8).

La prueba no es válida si menos del 80% de las aves del grupo control muestran disminución o pérdida de la actividad ciliar. El virus vacunal se considerará que no revierte a la virulencia si no existe diferencia entre el movimiento ciliar de las aves vacunadas con el pase inicial y el pase final. 

Por otro lado, el virus vacunal satisface el ensayo si ningún ave presenta signos notables de bronquitis infecciosa aviar ni muere por causas atribuibles al virus vacunal(8).

Del mismo modo que en la fracción ND, el ensayo no es válido si más del 10 por ciento de las aves presentan signos clínicos anormales o muere por causas no atribuibles al virus vacunal. El virus vacunal satisface el ensayo si ninguna de las aves presenta signos clínicos notables de la bronquitis infecciosa o muere por causas atribuibles al virus vacunal(8).

El virus vacunal satisface el ensayo si las lesiones inflamatorias observadas en el examen histológico de los riñones son como máximo moderadas(8). 

Durante el periodo de evaluación en la prueba de seguridad solamente se encontró mortalidad en los primeros días, tanto en el grupo inoculado con la semilla y el mismo número de aves en el grupo inoculado con el pase mas alto. La mortalidad no fue por causas referentes a signos de enfermedad, sino a situaciones mecánicas como son los pollitos atorados en el piso de la unidad de aislamiento. En el cuadro 4 se muestran de manera resumida estos resultados. 

No se obtuvieron resultados positivos en la técnica de RT-PCR de ninguna muestra, haciendo tres repeticiones de la prueba, por lo cual no hubo material genético para evaluar mediante secuenciación. 

Las secciones de tráquea fueron revisadas con los objetivos 20X y 40X utilizando el microscopio invertido Axiovert 200 Carl Zeiss, con la finalidad de percibir la movilidad de los cilios de las células epiteliales. Para la evaluación se tomó en cuenta la escala de establecida en la Farmacopea Europea 2011(9) descrita en el cuadro 5.

Los resultados obtenidos mostraron que todos los grupos a los 10 días de evaluación post-inoculación presentaron una actividad ciliar del 100%. Estos resultados se encuentran resumidos en el cuadro 6. 

Del mismo modo que en la evaluación de seguridad de ND, durante el periodo de evaluación en la prueba de seguridad solamente se encontró mortalidad de un pollito durante los primeros días en un solo grupo, la cual fue considerada dentro de los parámetros aceptables. La mortalidad fue referida a pollito atorado en el piso de la unidad de aislamiento en el grupo que recibió el pase inicial del virus de Bronquitis Infecciosa Mass. Los resultados se resumen en cuadro 7.

Los resultados obtenidos mostraron que en ninguno de los grupos se observaron lesiones graves a los 10 días después de la administración de los virus vacunales y de los virus del pase más alto. Los resultados del análisis histopatológico se encuentran resumidos en el cuadro 8.

La Farmacopea Europea 2011(9) establece que se deben realizar al menos dos de las tres evaluaciones referentes a la fracción ND, en  este estudio se relizaron la secuencia deaminoácidos y la prueba de seguridad. En cuanto a la secuenciación de aminoácidos para el gen de la glicoproteína F, ésta ya no fue realizada debido a la ausencia de material genético disponible posterior al RT-PCR, lo cual manifiesta que no hubo reversión a la virulencia de la semilla de ND, ya que se estableceque que el virus vacunal también satisface el ensayo si no se recuperan virus en ningún pase en la primera y la segunda serie(9). En cuanto al porcentaje de mortalidad, la fracción ND no revierte a la virulencia, ya que se establece que la prueba no es válida si más del 10% de las aves muestran signos clínicos anormales o mueren de causas no atribuibles al virus vacunal, o si ningún ave muestra signos atribuibles a ND o mueren de causas atribuibles al virus vacunal; y nuestros resultados demuestran que aunque se tuvo el 10% de mortalidad en los grupos inoculados con los pases inicial y final ND (grupos A y B), ésta fue atribuida a causas mecánicas y no a daño causado por el virus vacunal.

En cuanto a la fracción IB, la Farmacopea Europea 2011(8) establece que la prueba de actividad ciliar no es válida si menos del 80% de las aves del grupo control muestran disminución o pérdida de la actividad ciliar. Con esto se demuestra que esta fracción, en sus dos cepas, no revierte a la virulencia, ya que nuestros resultados demuestran que todos los grupos tuvieron el 100% de actividad ciliar a los 10 días después de la inoculación. De la misma manera que en la fracción ND, la prueba no es válida si más del 10% de las aves muestran signos clínicos anormales o mueren de causas no atribuibles al virus vacunal, o si ningún ave muestra signos atribuibles a IB o mueren de causas atribuibles al virus vacunal. La fracción IB no  revierte a la virulencia cumpliendo con el criterio de éste parámetro, ya que solamente se observó una mortalidad del 5% en el grupo D, y no fue debido a daño causado por el virus vacunal. Finalmente, en la evaluación histológica de los riñones, el virus vacunal satisface el ensayo si las lesiones inflamatorias observadas son como máximo moderadas. Este criterio se cumple, ya que a los 10 días de observación se encontraron lesiones en el nivel máximo permitido. 

 

1. Alexander JD.; Newcastle Disease, Other Avian Paramyxoviruses, and Pneumovirus Infections. En: Saif YM. Diseases of poultry, 11a ed. Iowa State Press, A Blackwell Publishing Company. EU. 2003. 63-99. 

2. Babiuk L.; Drunen S.; Tikoo S.; Lewis P; Liang X.; Novel viral vaccines for livestock. Vet immunol and immunopathol. 1996. 54. 355-363 

3. Cavanagh D.; Naqi SA. Infectious Bronchitis. En: Saif YM. Diseases of poultry. 11a ed. Iowa State Press, A Blackwell Publishing Company. EU. 2003. 101-119. 

4. Merino R; Villegas H; Quintana JA; Calderón N. Characterization of Newcastle disease viruses isolated from chicken, gamefowl, pigeon and quail in Mexico. 

5. Vet Res Commun (2009) 33: 1023- 1030.

6. OIE Terrestrial Manual. Enfermedad de Newcastle pp. 293-306.Capítulo 2.1.15. 2008. 

7. OIE Terrestrial Manual. Bronquitis infecciosa aviar pp. 945-956.Capítulo 2.7.6. 2008. 

8. Ph Eur monograph 0442. Avian infectious bronchitis vaccine (live). European Pharmacopoeia version 7.0. 7th edition. 2011. pp. 852-854. http://online.edqm.eu/entry.htm 

9. Ph Eur monograph 0450. Newcastle disease vaccine (live). European Pharmacopoeia version 7.0. 7th edition. 2011. pp. 923-924. http://online.edqm.eu/entry.htm 

10. USDA. Veterinary services Memorandum 800.201. June 25, 2008.  

11. VICH Guideline GL41. Examination of live veterinary vaccines in target animals for abscence of reversion to virulence.