Efecto de Bacillus amyloliquefaciens CECT 5940 en la inhibición de Salmonella in vitro e in vivo

El control de Salmonella en la avicultura es una preocupación de salud pública debido a que es la principal causa de intoxicación alimentaria humana. También hay preocupación sobre el incremento de la resistencia antibiótica cuando es tratada la salmonelosis en humanos. La avicultura no es la única fuente posible de salmonelosis, pero se sabe que es un principal reservorio global de Salmonella.

Los métodos de producción intensiva pueden incrementar la susceptibilidad de la avicultura a infecciones por Salmonella. Algunas cepas, tales como Typhimurium y Enteritidis, son más intratables debido a su epidemiología más compleja, la cual involucra excreción fecal extensa asociada con la contaminación ambiental y la existencia de muchos reservorios adicionales de infección.

Un control efectivo depende de una serie de factores, los cuales incluyen una mejor bioseguridad en granja, el uso de ‘mejores prácticas’ en la cría, y el uso de vacunación, inmunoestimulantes y probióticos.

Colección de Sobrenadante
El caldo de fermentación industrial fue recolectado en el crecimiento de B. amyloliquefaciens CECT 5940 a las 9, 15 y 36 horas de incubación; el extracto fue centrifugado y después pasado por un filtro de 0.22 µm que permitió una eliminación completa de las células.

Cepas patógenas utilizadas
Diferentes cepas de Salmonella fueron cultivadas en un medio de caldo nutritivo (Biokar) a 37°C por 18 horas y se utilizaron para los estudios in vitro e in vivo. Las cepas utilizadas fueron:

Salmonella entérica CECT 443 subespecie entérica, serovar Typhimurium.

Salmonella entérica CECT 722T subespecie entérica, serovar Typhimurium.

Salmonella entérica CECT 7161 subespecie entérica, serovar Typhimurium.

Salmonella Typhimurium var Monofásica Ref. 301/99; cepa cedida por el Laboratorio Veterinario de Diagnóstico de Enfermedades Infecciosas de la Universidad Autónoma de Barcelona (UAB-LVDMI).

Actividad antimicrobiana in vitro:
La actividad antimicrobiana de Ecobiol® contra diferentes cepas de Salmonella spp. fue determinada usando la técnica de difusión en placa (Cintas et. al, 1995). Cincuenta microlitros de Ecobiol® en cada sobrenadante obtenido a diferentes tiempos de incubación (9, 15 y 36 horas) fueron pipeteados en pocillos de 6 mm en las placas de agar nutritivo. Las placas de agar se prepararon disolviendo el medio en polvo directamente en 50mM buffer citrato pH4 y 50mM buffer fosfato pH6, previamente cultivado con 100 microlitros de un cultivo de una noche de Salmonella spp. Todas las placas fueron puestas en refrigeración a 4°C; después de 2 horas, las placas fueron extraídas del refrigerador e incubadas a 37°C de 24 a 48 horas. Después de la incubación, se midió el tamaño del halo de inhibición, y todas las pruebas fueron hechas por duplicado.

Actividad antimicrobiana in vivo:
Para validar aún más el ensayo in vitro descrito anteriormente, se realizó un estudio in vivo. Un total de 100 pollos de engorda Ross sanos (machos y hembras) fueron separados aleatoriamente en dos grupos experimentales diferentes y colocados en 2 corrales en piso por separado, cada uno con 50 pollitos. Los dos grupos consistieron en 1) una dieta basal control y 2) una dieta basal suplementada con Ecobiol® (1x109 UFC/g) a razón de 1 kg/ton de alimento balanceado. Al día 1 del experimento, todas las aves fueron confirmadas como negativas para Salmonella entérica serovar enteritidis. La prueba duró 42 días. En el día 5, veinte por ciento de las aves por grupo experimental fueron inoculadas vía oral con Salmonella entérica serovar enteritidis (105 UFC/ave). Las aves inoculadas se volvieron a colocar en los corrales para simular una infección horizontal. A los días 6, 9, 13, 20, 27, 34 y 41 del experimento (1, 4, 8, 15, 22, 29 y 36 pos-desafío), se recolectaron hisopos cloacales de todas las aves para medir conteos de S. Enteritidis. Al día 42, todas las aves fueron sacrificadas; el buche, ciego, hígado y bazo, se recolectaron, pesaron, homogeneizaron con agua peptonada, y se almacenaron para sus análisis bacteriológicos adicionales. El título de Salmonella por muestra fue determinado después del enriquecimiento con una base de caldo Muller-Kauffmann Tetrathionate, y por plaqueo de diluciones seriales en Agar Verde Brillante para calcular la concentración de Salmonella en UFC por gramo de tejido.

Resultados y Discusión 

 

Basado en los resultados de la inhibición in vitro (Tabla 1 y Figura 1). De acuerdo a los resultados que muestran halos, en la mayoría de los casos mayores a 10 mm, podemos concluir que se observó una clara inhibición de los patógenos.

Las diferencias en la actividad de inhibición a diferentes tiempos de incubación pueden ser relacionadas a la producción de los compuestos inhibidores a diferentes fases en la curva de crecimiento del probiótico. Siendo los compuestos activos excretados a más de 15 horas.

Después del desafío con Salmonella, el número de aves positivas aumentó muy rápido; esto se debe a la grande concentración de Salmonella utilizada en la inoculación oral. La reducción de aves positivas observada hasta el día 20 puede ser debida a una rápida respuesta del sistema inmune innato. Sin embargo, después de los 20 días de edad, sólo las aves suplementadas con Ecobiol® pudieron reducir de forma consistente y significativa (P<0.001) el derramamiento de Salmonella enteritidis.

La Salmonella colonizó en el ciego y buche a un aproximado de 90% de las aves. La colonización en el bazo e hígado fue alrededor de 20%. Lo más interesante es que los conteos de Salmonella en las aves alimentadas con Ecobiol® se redujeron significativamente en un 20 % en el ciego y en un 70 % en el buche en comparación con las aves control. El grupo alimentado con Ecobiol® no mostró colonización de Salmonella en hígado.