Control de la influenza aviar (IA) H7N3 de alta patogenicidad en pollos de engorda a través de la vacunación con una vacuna vectorizada RHVT-H7 sola o en combinación con la aplicación de una vacuna inactivada comercial

Introducción

El virus de la Influenza Aviar de alta patogenicidad (IAAP) H7N3 ingresó en la industria avícola mexicana en junio de 2012 (OIE, 2012; FAO, 2012). El brote inicial ocurrió en ponedoras comerciales en el estado de Jalisco y fue reportado como controlado hasta que nuevos brotes aparecieron en enero de 2013. Vacunación de las aves comenzó en julio de 2012 a través del uso de vacunas inactivadas que contenían una cepa H7N3 de baja patogenicidad aislada de patos salvajes en 2006 (A/cinnamon teal/Mexico/2817/2006 [H7N3]) oficialmente provista a la industria veterinarias por el gobierno mexicano. Aunque los datos iniciales de campo indicaban que la vacuna era protectiva y datos de desafíos experimentales igualmente lo confirmaban (Kapczynski et al., 2013), luego, al largo del año 2013, inúmeros reportes de campo empezaron a circular indicando que la cepa vacunal oficial estaba fallando en inducir efectiva inmunidad clínica en contra el H7N3 en las empresas avícolas. Este artículo reporta los resultados de una reciente prueba de desafío controlado por el H7N3 en pollos vacunados solamente con una vacuna vectorizada con rHVT-H7 (contra la Enfermedad e Marek y la IAAP por H7N3) o la combinación de la vacuna vectorizada con una vacuna inactivada contra el H7N3 producida por la técnica de genética reversa.

Materiales y Métodos

Instalaciones Experimentales
El experimento fue llevado a cabo en las instalaciones de nivel de bioseguridad 3 (BSL-3) de la Unidad Integral de Servicios Diagnósticos y Constatación (UISDC) del Centro Nacional de Servicios de Diagnóstico en Salud Animal (CENASA) del gobierno de México en Tecámac, estado de México (https://www.gob.mx/senasica/acciones-y-programas/el-centronacional-de-servicios-de-diagnostico-en-salud-animal).

Vacunas
1. rHVT-H7 = vacuna recombinante vectorizada contra la Enfermedad de Marek y contra la IAPP H7N3 (rHVT-H7). El virus replicante de la vacuna es la cepa vacunal HVT (herpesvirus de pavo) recombinada con el gen del virus de la IAAP H7N3 (Vectormune H7 – Ceva Salud Animal).
2. GR - Genética reversa = vacuna comercial inactivada emulsionada que contiene un virus H7N3 atenuado inactivado generado en laboratorio a través de técnicas de genética reversa. El virus vacunal fue generado en base a la secuenciación del gen de la hemaglutinina de un virus H7N3 de campo de alta patogenicidad.

Grupos experimentales
Se usaron pollos comerciales Cobb los cuales tenían altos títulos de anticuerpos maternos circulantes (promedio HI de 8,82±1,6 log₂ de AcM contra el H7N3) al nacimiento.

Los grupos experimentales estuvieron todos alojados individualmente en aisladores:

Grupo rHVT-H7 (15 pollos) Vacunados con la vacuna rHVT-H7 al día 1 de edad vía subcutánea (región dorsal del cuello).
Grupo rHVT-H7 + GR (15 pollos) Vacunados con la vacuna rHVT-H7 al día 1 de edad vía subcutánea y con la vacuna GR a los 9 días de edad vía subcutánea. La edad de aplicación de la vacuna GR fue debido a evitarse la fuerte neutralización de antígenos vacunales H7N3 por los AcM circulantes cuando las aves son vacunadas al 1er día de vida (Cardenas-Garcia et al., 2019). En zonas oficialmente consideradas endémicas al virus H7N3 en México, es práctica común vacunarse aves de larga vida y/o pollos de engorda contra el H7N3 alrededor de los 9-11 días de edad con vacunas inactivadas.
Grupo control 1 (15 pollos) Grupo control del grupo rHVT-H7 No vacunados.
Grupo control 2 (15 pollos) Grupo control del grupo rHVT-H7+GR No vacunados.

Desafío
Todos los grupos de pollos fueron desafiados (vía óculo-nasal) a los 28 días de edad con la cepa oficial del virus H7N3 de la IAAP aislado en 2015 en el estado de Guanajuato (A/chicken/Guanajuato/07437-15/2015 - H7N3 - GenBank accession number AKL91078.1). La solución viral (200 µl) de desafío inoculada en cada ave contenía el título viral de 10⁶ DIE_50% (Dosis Infectante de Embrión50%).

Monitoreo clínico y muestreos
Todos los grupos fueron monitoreados para mortalidad post desafío por 14 días. Muestreos de sangre (todas las aves en cada grupo) para serología HI (inhibición de la hemaglutinación) fueron hechos al 1er día de vida, a las 2,3 y 4 sem de edad y a las 2 semanas post desafío (6 semanas de edad). Para medición de la excreción viral post desafío se tomaron muestras (10 aves por cada grupo de aves vacunadas y 5 aves por cada grupo control) de hisopados coanales (tomados en la hendidura coanal de las aves) y cloacales a los 2, 6 y 9 días post desafío.

Pruebas laboratoriales
Todas las pruebas de laboratorios fueron llevadas a cabo en el laboratorio clínico del CENASA.

Serología
Los títulos de Ac circulantes fueron medidos por HI (inhibición de la hemaglutinación) en acuerdo con el protocolo estándar de la Organización Mundial de Sanidad Animal (OMSA/OIE, 2019 / 4 unidades hemaglutinantes y títulos considerados positivos cuando iguales o mayores que 4 log₂ o dilución 1:16). Se usó como antígeno para el HI una cepa oficial estandarizada del gobierno del virus H7N3 de la IAAP aislado en 2012.

RT-PCR en tiempo real
Para medidas de la excreción viral en hisopados coanales y cloacales su usó la técnica de la RT-PCR en tiempo real como descrito por Spackman et al (2012). Concentraciones de del gen H7 en las muestras fue expresado como “no. de copias del gen/µl de ARN extraído”.

Análisis Estadístico

Diferencias entre los títulos de virus excretados por cada grupo experimental fueron analizadas con la prueba “one-way” ANOVA y la prueba de Tukey para determinación de significancia estadística. Si se detectaba no normalidad en la distribución de los datos se usó la prueba Kruskal-Wallis “one-way” ANOVA en “ranks” y la prueba de Dunn para múltiples comparaciones (GraphPad Prism 8.3.0/InStat, San Diego-CA, USA). Se eligió un valor de P≤0,05 para considerar diferencias como estadísticamente significativas.

Resultados

La tasa de viabilidad post desafío en los 3 grupos experimentales está reportada en la Figura 1. Los dos planes vacunales presentaron la misma (P>0,05) eficacia de protección en contra el desafío mientras las aves no vacunadas de los grupos control se habían muerto todas ya a los 6 días post desafío.

Control de la influenza aviar (IA) H7N3 de alta patogenicidad en pollos de engorda a través de la vacunación con una vacuna vectorizada RHVT-H7 sola o en combinación con la aplicación de una vacuna inactivada comercial - Image 1

^{Figura 1. Porcentaje de viabilidad de pollos comerciales vacunados con dos planes vacunales contra la IAAP H7N3, desafiados a las 4 semanas de edad con la cepa de campo oficial del H7N3 del año 2015 y observados clínicamente durante 14 días. La línea color azul representa el promedio del porcentaje de viabilidad diaria de los dos grupos control de aves no vacunadas y desafiadas. Porcentaje final de viabilidad a los 14 días de observación clínica seguidas de letras diferentes difieren estadísticamente (P<0.05).}

Los resultados de títulos anticuerpos humorales circulante contra el H7N3 medidos por HI son visualizados en la Figura 2 (promedio log₂±SD). Los pollos comerciales usados en la prueba presentaban altos títulos de Ac maternos al nacimiento en función del plan vacunal contra el H7N3 usado en las reproductoras. A la edad de desafío los grupos experimentales vacunados aún no habían seroconvertido de manera detectable. Sin embargo, a las dos semanas post desafío 93% de las aves en el grupo la combinación de vacunas (rHVT-H7+GR) fueron positivas en el HI aunque las aves vacunadas solo con la vectorizada (rHVT-H7) solo el 36% de las aves presentaron títulos iguales o mayores a 4 log₂.

^{Figura 2. Títulos HI (promedio log2±SD) de Ac maternos, a las 4 sem de edad (desafío) y a las 6 sem de edad (14 días post desafío) de los pollos comerciales usados en la prueba.}

El efecto de los planes vacunales sobre la tasa de excreción del virus H7N3 de desafío está indicado en el Cuadro 1. El 100% de las aves en el grupo control presentaban significativa excreción viral del H7N3 de desafío a los 2 días post inoculación. Fue la única edad de muestreo en aves control ya que el 100% de las aves se había muerto ya a los 6 días post desafío (Figura 1). Aves vacunadas con ambos planes vacunales presentaron significativa reducción de excreción post desafío en comparación con el grupo control no vacunado. Aunque no estadísticamente significativo, pero presentando clara tendencia, el grupo de pollos vacunados solamente con la vacuna vectorizada rHVT-H7 no solo excretaron menores cantidades de virus como igualmente menos aves en este grupo excretaron cantidades detectables del virus de desafío.

Cuadro 1. Promedio (±SD) por ave de excreción viral vía coana más cloaca (total de copias de ARN extraído/µl) y porcentaje de aves excretando volúmenes detectables de virus a diferentes edades post desafío con el H7N3 de la IAAP en los tres
experimentales (volúmenes de copias de ARN extraído/µl seguidos de letras diferentes en la misma columna difieren estadísticamente).

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Conclusiones

La vacuna vectorizada rHVT-H7 (Vectormune H7 – Ceva Salud Animal) aplicada al primer día de vida en pollos de engorda comerciales con altos títulos de Ac maternos contra el virus H7N3 de IAAP no sola ha sido eficaz en proteger clínicamente en 100% las aves desafiadas a las 4 semanas de edad como también pudo disminuir significativamente la excreción del virus H7N3 en el periodo de 2 sem post desafío.
El plan vacunal usando la combinación de la vacuna vectorizada rHVT-H7 al primer día com la aplicación de una vacuna inactivada (SC, a los 9 días de edad) contra el H7N3 producida a través de la técnica de genética reversa fue igualmente eficaz en inducir una protección clínica de 100% más una evidente disminución de la excreción del virus H7N3 de desafío.
Ambos planes vacunales no indujeron seroconversión detectable por HI hasta las 4 semanas edad. Muy probablemente debido a una baja homología genética entre los virus vacunales con el antígeno H7N3 usado en la prueba serológica.