Biopelícula y su efecto sobre la persistencia de bacterias en los ambientes de incubación

Los microorganismos más perjudiciales en la planta de incubación incluyen una amplia gama de bacterias gram positivas, gram negativas , hongos y virus. Algunos de estos organismos son específicamente patógenos para las aves, y uno de los principales aspectos relacionados con las contaminaciones bacterianas en el que se ha venido trabajando en los últimos años es lo referente al tratamiento, control y prevención de la misma sobre las diferentes superficies ; en este punto se ha avanzado en el conocimiento de cómo las diferentes bacterias sobreviven en los ambientes y como lograr su control .

Hablaremos sobre la biopelícula y su colaboración en la permanencia constante de enfermedades (virales, bacterianas y fúngicas) en las diferentes superficies y adicionalmente el rol que está jugando en la resistencia hacia los desinfectantes y los antibióticos , y como lograr su eliminación de una manera más efectiva.

Son grupos de células ( Bacterias, virus, hongos) normalmente en poblaciones mixtas (comunidades) que se adhieren a una superficie y forman una estructura  en 3 dimensiones , unida por substancias poliméricas extracelulares (matriz de polisacáridos) producidas por ellos mismos.  Cuando tenemos la formación de la biopelícula podemos hablar que es una estrategia adaptativa de los microorganismos, la cual ofrece cuatro ventajas importantes:

Todas estas circunstancias pueden incrementar sus capacidades de supervivencia. Como consecuencia, los métodos habituales de desinfección o el uso de antibióticos se muestran a menudo ineficaces contra las bacterias del biofilm (Costerton et al., 1999;  Donlan, 2002).

Podemos encontrar biofilms en todos los medios donde existan bacterias: en el medio natural, clínico o industrial. Solo se requiere la presencia de un entorno hidratado y una mínima cantidad de nutrientes, ya que pueden desarrollarse sobre todo tipo de superficies (hidrófobas o hidrófilas, bióticas o abióticas) (Kraigsley et al., 2002; Terry et al., 2003). El desarrollo en biofilm es una forma habitual de crecimiento de las bacterias en la naturaleza. En la actualidad se considera que en condiciones ambientales adecuadas, la mayoría los microorganismos son capaces de formar biofilms (Donlan, 2002; Lasa et al., 2009).

Composición de la Biopelícula
Aunque la composición del biofilm es variable en función del sistema de estudio, en general, el componente mayoritario es el agua, que puede representar hasta un 97% del contenido total. Además de agua y de las células bacterianas, la matriz del biofilm es un complejo que está formado principalmente por exopolisacáridos (Sutherland, 2001). En menor cantidad se encuentran otras macromoléculas como proteínas, ADN y diversos productos procedentes de la lisis de las bacterias (Branda et al., 2005).

Estudios realizados utilizando microscopía  han mostrado que la arquitectura de la matriz del biofilm no es sólida y presenta canales que permiten el flujo de agua, nutrientes y oxígeno incluso hasta las zonas más profundas del biofilm. La existencia de estos canales no evita sin embargo, que dentro del biofilm se puedan encontrar diferentes ambientes en los que la concentración de nutrientes, pH u oxígeno sea distinta.

Esta circunstancia aumenta la heterogeneidad del estado fisiológico en el que se encuentra la bacteria dentro del biofilm y dificulta su estudio (Lasaet al., 2009).

Formación de Biofilm
La formación de biofilm es un proceso dinámico y complejo que conlleva la adhesión, colonización y crecimiento de los microorganismos. No se trata de un proceso aleatorio sino que sigue una formación sistemática (Kumar y Anand, 1998). En él podemos identificar hasta cinco fases:

Adherencia: Esta etapa es reversible si es usado un detergente. Pero con el tiempo si no es usado un detergente , este se vuelve irreversible y la remoción del biofilm va a ser muy complicada.

Quorum Sensing –AHL ó Autoinductores.
Usando un proceso llamado  Quorum Sensing (detección de cuórum), las bacterias se comunican vía señal de moléculas , estas señales secretadas son generadas por dos tipos principalmente:

A medida que aumenta la densidad de la población celular, los AI se acumulan y desencadenan cambios en toda la población principalmente en la expresión de Genes implicados en procesos que incluyen motilidad, formación de biofilm, Virulencia, secreción tipo III y bioluminiscencia (Waters y Bassler, 2005).

El Quorum Sensing hace que  las bacterias evalúen su densidad de población a través de los AI cuya concentración en el medio ambiente local indica el número de células vecinas de la misma especie. Cuando esta concentración excede un determinado umbral, las bacterias se activan para expresar rasgos fenotípicos asociados con la infección, incluyendo la formación de biofilm y la producción de factores de virulencia. (Piletska 2011). Esta demostrado que pueden haber algunas señales como la HAI 1 que sean intraespecies como sucede con el Vibrio Harveyi  y el V Parahaemoliticus   (Bassler et al. 1997).

AHLs
Las  bacterias gramnegativas utilizan N-acil-L-homoserina lactonas (AHL) para unirse a reguladores transcripcionales que conducen a la activación o represión de genes diana.

Sistema de señal LuxI/luxR

OligoPeptidos
Las bacterias Gram + usan este Sistema,y  corresponden al uso de señales oligopéptidicas detectadas por un sistema de dos componentes de proteínas fosforiladas que transducen la señal por un mecanismo de fosforilación/ defosforilación. La bacteria utiliza un oligopéptido originado ribosomalmente llamado Autoinductor peptídico (AIP) . Una vez que los precursores de los péptidos (oligopéptidos) sintetizan y procesan péptidos, estos son modificados generando un péptido maduro, el cual es exportado mediante un transportador de la familia ABC (ATP- Binding-Cassette). La detección de estos péptidos es llevada a cabo mediante un sistema de dos componentes que transducen la señal por un mecanismo de fosforilación/defosforilación.(Gobeti. 2007, Gera 2006)

Bacteria empieza la división

El estudio más frecuentemente mencionado es uno de los investigadores del Instituto Pasteur y del CNRS. Se demostró, por primera vez, que ciertos virus parecen ser capaces de formar conjuntos complejos de biopelícula similar a los biofilms bacterianos. Estas estructuras extracelulares de biopelícula pueden proteger a los virus del sistema inmunitario y permitirles que se diseminen eficientemente de una célula a otra (Thoulouze MI¹, Alcover A 2011).

Al igual que los biofilms bacterianos, las biopelículas virales podrían representar "comunidades virales" con capacidad infecciosa mejorada y mejor propagación en comparación con las partículas virales "libres", y podrían constituir un reservorio clave para las infecciones crónicas. (Thoulouze MI¹, Alcover A 2011).

Resistencia  Intrínseca de los desinfectantes y Antibióticos causada por la biopelícula. 

Está demostrado que la biopelícula es uno de las grandes causas por las que se están presentando hoy en día resistencia hacia los desinfectantes y antibióticos , principalmente  debido a una disminución del acceso del agente desinfectante al interior del biofilm.

Resistencia a los biocidas y su asociación con la resistencia a los Antibióticos. 

Los biocidas no siempre se usan en concentración correcta y su acción puede verse comprometida al tener contacto con material orgánico (Rusell 2003). Las Bacterias que sobreviven a bajas dosis del biocida  son más propensas a ser resistentes a los antibióticos (Karatzas 2008). Recientemente se ha encontrado que la exposición repetida y subinhibitoria a los biocidas ha resultado en la selección de bacterias Multiresistentes (MDR). El aumento de la acumulación de biocidas en el medio ambiente a niveles bajos tiene el potencial de proporcionar entornos que favorecen la selección de mutantes con una mayor tolerancia a los biocidas y los antibióticos (Bailey AM 2009).

La resistencia cruzada de bajo nivel biocida-antibiótico puede ser el resultado del aumento de la expresión de las bombas de eflujo, particularmente en bacterias Gram-negativas, incluida Salmonella, y se ha demostrado que en la Salmonella esta se ve expresada en respuesta a la exposición a dosis bajas del biocida .

La resistencia no específica de bajo nivel a antibióticos y biocidas puede también estar mediada por la disminución de la permeabilidad de la membrana a menudo debido a la represión de las porinas principales (Zhang D 2010).

Además de su papel en la resistencia a los antimicrobianos, la bomba de eflujo también tiene un papel en la patogenicidad de bacterias gram negativas.

Se ha  demostrado que hacia los desinfectantes  se presenta  el tipo de Resistencia Intrínseca que está asociada a la formación de Biopelícula (Mc Donell Rusell 1999) (P.Araújo.2011). Es importante enfatizar que no todos los desinfectantes hoy se han asociado con formación de resistencia intrínseca , durante el crecimiento de las biopelículas, se ha demostrado que el exopolisacárido confería un alto nivel de resistencia a los Amonios cuaternarios-QAC (Campana et al., 2002; McBain et al., 2004). Esto y la presencia de material orgánico podrían diluir cualquier QAC utilizado en la desinfección de superficies duras, causando que las bacterias se adapten a las concentraciones más bajas y se vuelvan resistentes .

La mayor resistencia se presenta principalmente en desinfectantes con características residuales (amonios cuaternarios)  ya que estos son más propensos a generar biopelícula. .Dentro de los desinfectantes que se han estudiado como formadores de resistencia tenemos  Amonios cuaternarios, glutaraldehidos y sus asociaciones , Chlorhexidina , triclosan, fenoles, diaminas.

Una de las más estudiadas es la de los amonios cuaternarios dada su alta relevancia en salud pública(Megan C. et all 2015 ), donde exposiciones prolongadas a los amonios cuaternarios resulta en cambios de la estructura de la comunidad microbiana y aumentado la resistencia microbiana  (Madan et all 2013).
 

Control del Biofilm con limpieza y desinfección 

La biopelícula es una formación de Bacterías , Virus , Hongos , EPS, residuos de materia orgánica , minerales, y descubierto recientemente residuos de desinfectantes y detergentes.

La biopelícula dependiendo del tiempo hace que sea más difícil de eliminar , una sola acción no es suficiente para eliminarla , por eso hay que integrar varios procesos entre los que tenemos:

En estudios recientes se identificó la importancia de verificar que los productos desinfectantes tengan acción sobre la biopelícula  (Virkon™)  y que esta no es fácil de eliminar ; ya que se  estableció que no todos los biocidas como  el Fenol, Glutaraldehido, Silvicide (asociación de peróxido de hidrógeno y nitrato de plata), Novacide (amonio cuaternario de cuarta generación en combinación con biguanidina ) pueden eliminarla ,  o que para su eliminación se tienen que utilizar dosis más altas como en este estudio que solamente Virkon™  en una concentración de 4% logro la eliminación de la biopelícula de Klebsiella y al 2% de Staphilococcus aureus y los otros biocidas incluso a 8 o 16 veces la dosificación no lograron eliminar la biopelícula de las bacterias. (Chakraborty, et al.: 2014).

En diferentes estudios con Biopelículas se ha comprobado que no todos los desinfectantes son capaces de eliminar la biopelícula según N.D. Allan . 2011 en un estudio sobre eficacia de los desinfectantes sobre biopelícula detecto que entre 10 diferentes desinfectantes (amonios cuaternarios, Fenólicos, hipocloritos, biguanidinas, acidos peracéticos, peróxidos de hidrógeno, Virkon™)  ninguno de los biocidas probados fueron capaces de erradicar los biofilms de L. monocytogenes . Además, sólo Virkon™ fue capaz de demostrar un efecto bactericida sobre el fenotipo planctónico de esta cepa, y sólo dos veces la concentración recomendada por el fabricante para el tiempo de contacto de diez minutos evaluado. Estos datos reflejan la tenacidad de este patógeno transmitido por los alimentos y aportan información sobre las causas potenciales de los fracasos comunes de la ciencia desinfectante contra los patógenos microbianos. (N.D Allan. 2011).

En otro estudio con  Salmonella de 12 diferentes agentes biocidas (Hipoclorito de sodio, Enzimas, Cloro, clorito de sodio, amonios cuaternarios, yodo, fenol, cresol) solo hubo dos desinfectantes, Hipoclorito y el Monopersulfato de K (virkon™), que fueron efectivos en la reducción de Salmonella en presencia de carga orgánica y en la eliminación de las biopelículas de Salmonella. El compuesto A, que tenía hipoclorito sódico como ingrediente activo, era eficaz a una concentración de 500 ppm de hipoclorito sódico. El compuesto C, que tenía cloruro de sodio y un  peróxido alcalino -KMPS(Virkon™S) como sus ingredientes activos, era eficaz a una concentración del 1% de solución de producto. Ambos desinfectantes eliminaron Salmonella completamente en 2 minutos. (Ramesh, N. et all 2002).

Estudios con los siguientes biocidas : Virkon™S (un compuesto oxidativo),Superkill (SK), una mezcla de aldehídos y compuestos de amonio cuaternario (QAC) , AQAS (AQ), un amonio cuaternario compuesto,  y Trigene (TR), un compuesto de amina terciaria halogenado , muestran que una sola exposición a la concentración de trabajo de ciertos biocidas como  Glutaraldehido mas amonio cuaternario , amonio cuaternarios, y aminas terciarias pueden seleccionar Salmonella mutante con resistencia a múltiples fármacos mediada por bombas eflujo. En este estudio se demostró que la propensión de los biocidas para seleccionar mutantes MDR varía y esto debería ser una consideración cuando se diseñan nuevas formulaciones biocidas ya que no se encontró en Virkon™ esta aparición de mutantes. (Rebekah N. Whitehead 2011).

En general, los agentes oxidantes (Acido peracético, peróxido de hidrógeno, Dióxido de cloro , Virkon™S ) se dirigen a múltiples componentes de la biopelícula y objetivos microbianos, mientras que otros biocidas como la clorhexidina , amonios cuaternarios solo se dirigen a las células componentes de la pared; por lo tanto, los agentes oxidantes tienden a tener un mayor nivel de eficacia contra las biopelículas.