Silicio, níquel y nanopartículas de plata y cobre en el manejo in vivo e in vitro de Botrytis cinerea en fresa (Fragaria x ananassa Duch.)

Introducción

El cultivo de la fresa en México tiene una gran importancia económica, según registros de la SIAP (2017) aporto superior a los 12 millones de pesos con 658,435 t. cultivo que se desarrolla cerca de 15 entidades de los cuales el 95% de la producción se concentra en tres entidades; Michoacán, Baja California y Guanajuato (SIAP, 2017). La producción de este volumen implica costos de diversa índole, dentro de las que se encuentran los fungicidas y los costos generados por su constante aplicación. Por ello, es necesario la búsqueda de nuevas alternativas para el manejo de enfermedades fúngicas en el cultivo de la fresa principalmente el moho gris causado por Botrytis cinerea (Baraona y Sancho, 1992; Sesan, 2003); se ven muy afectados los cultivos de fresa cuando se producen a gran escala. El hongo puede causar pérdidas de hasta 50% en campo (Blanco et al., 2006), ataca al cultivo en el campo, durante la cosecha, el transporte y la comercialización (Card et al., 2009).

Actualmente el control del moho gris se ha realizado con éxito exclusivamente con fungicidas durante la floración de los cultivos (Mertely et al., 2002). Sin embargo, existen estudios sobre los efectos negativos por fungicidas comerciales; pueden reducir la polinización y causar frutos deformes debido al tiempo de aplicación (Kovach et al., 2000), generando de población de patógenos resistentes a los principales fungicidas utilizados contra Botrytis cinerea (Bardas et al., 2008). Además, se ha reportado residuos de plaguicidas en frutas para consumo humano (Rabolle et al., 2006).

Por otra parte, se ha reportado el uso de nanopartículas (NPs) metálicas como actividades antimicrobianas entre ellas la plata (Kim et al., 2008; Kumar et al., 2008), cobre (Cioffi et al., 2005), dióxido de titanio (Kwak et al., 2001) y óxido de zinc (Liu et al., 2009). Las AgNPs ataca una amplia gama de procesos biológicos en microorganismos, incluida la estructura y funciones de la membrana celular (Pal et al., 2007).

Investigaciones realizadas con las AgNPs indican que la acción antifúngica es dada por una gran relación de área superficial a volumen. La superficie de las AgNPs se oxida en presencia de oxígeno y agua, generando iones de plata (Ag+ ) que se disuelven en la capa de agua adsorbida dependiente de la humedad (Asay y Kim, 2005). Los iones de plata disueltos se difunden desde las partículas originales en la capa de agua absorbida como resultado de los fuertes gradientes de concentración alrededor de las partículas originales. Se forman partículas adicionales más alejadas de las partículas originales, lo que sugiere que las especies móviles son iones de plata, no las partículas mismas (Glover et al., 2011). La movilidad de los iones de plata en una capa de agua adsorbida en las superficies se ha informado en sistemas con gradientes electroquímicos (Conway y Bockris, 1958; Yang et al., 2006). El contacto directo entre las AgNPs y la pared celular de los hongos es necesario para inducir el daño celular durante la inactivación fotocatalítica, donde el daño de la membrana citoplásmica podría ser el principal mecanismo de muerte que se ha informado (Kubacka et al., 2014; Foster et al., 2011).

Asimismo, algunos investigadores han propuesto el uso de níquel a bajas concentraciones para reducir las enfermedades fúngicas (Barcelos et al., 2018). Dixon et al. (1975) encontraron que este metal es un componente estructural de la metaloenzima ureasa (urea amidohidrolasa), que tiene dos átomos de níquel en su centro activo (Ciurli, 2001) involucrado en posibles mecanismos de defensa de las plantas (Carlini y Grossi-de-Sá, 2002) llamadas defensa elemental (Polacco et al., 2013); por ser una enzima que cataliza la hidrólisis de urea en amoniaco y dióxido de carbono (Dixon et al., 1975).

Algunos autores mencionan que B. cinerea posee una enzima llamada superóxido dismutasa (SOD), que pertenece a una familia de enzimas que neutralizan los efectos de especies reactivas de oxígeno (ROS) al catalizar la conversión de superóxido (O₂ − ) a peróxido (H₂O₂) y oxígeno molecular (O₂) a través de la oxidación y reducción alternativas de sus iones metálicos catalíticos (McCord y Fridovich, 1969; McCord et al., 1971). La enzima que posee B. cinerea se le conoce como un metaloenzima, que requiere la presencia de un metal para el funcionamiento de sus reacciones. Rolke et al. (2004) menciona que B. cinerea posee solo el Cu-Zn-SOD isoforma.

Por lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue evaluar la actividad biológica de silicio, níquel, AgNPs, CuNPs y Ag/CuNPs en el control de Botrytis cinerea aplicados vía foliar en plantas de fresa (Fragaria ananassa Duch.) cv. ‘Festival’ bajo sistema hidropónico abierto en condiciones de invernadero y en medios de cultivos PDA.

El experimento se estableció bajo un diseño completamente al azar con tres repeticiones. La unidad experimental constó de un contenedor con una planta. Con los datos obtenidos se realizó un análisis de varianza con el paquete estadístico Statistical Analysis System (SAS 9.0), y una comparación de medias de Tukey (P≤0.05).

Materiales y Métodos

La presente investigación se realizó en condiciones de invernadero tipo capilla del Departamento de Fitotecnia de la Universidad Autónoma Chapingo, localizado en el Campo Agrícola Experimental “Xaltepa” Estado de México, localizado a 19° 27´ 58” latitud norte, 98° 51´ 14” longitud oeste. Asimismo, se condujeron ensayos in vitro en el Laboratorio de Hongos Comestibles del Departamento de Preparatoria Agrícola de la Universidad Autónoma Chapingo localizado a 19° 27´ 58” latitud norte, 98° 51´ 14” longitud oeste y una altitud de 2250 m.

Experimento in vivo

Se utilizó sustrato de origen volcánico (tezontle rojo), con granulometría de 3 a 4 mm, los contenedores utilizados fueron bolsas negras de polietileno 30 x 30 cm, con capacidad de 1.3 L. Se utilizaron plantas de fresa de cv. ‘Festival’. El hongo patógeno estudiado se aisló de frutos momificados con los síntomas típicos de Botrytis cinerea.

La nutrición de las plantas se realizó en base a la solución nutritiva universal de Steiner (1984), la cual en forma completa está constituida por (en mol_c m^-3 ): 12 de NO₃ - , 1 de H₂PO₄ - , 7 de SO₄^-2 , 7 K+ , 9 de Ca⁺² y 4 de Mg⁺²; misma que se utilizó en un 50 % de su concentración los primeros 15 días después del trasplante (ddt), 75 % de su concentración después de los 16 ddt y a los 60 ddt a 100% de su concentración.

Tratamientos. 1) Testigo; 2) Níquel a 2.5 mg L^-1 ; 3) Níquel a 7.5 mg L^-1 ; 4) Silicio a 50 mg L^-1 ; 5) Silicio a 100 mg L^-1; 6) AgNPs 15 mg L^-1 ; 7) AgNPs 25 mg L^-1 ; 8) Ag/CuNPs 15/30 mg L^-1 ; 9) Ag/CuNPs 25/50 mg L^-1 ; y 10) Switch® (cyprodinil y fludioxonil) 1000 mg L^-1 .

Se utilizó agua destilada para las disoluciones. El tensoactivo empleado para las NPs fue tensoactivo aniónico (lauril acetil éter) a una concentración de 0.5 mL L^-1 .

Variables de estudio. Se evaluó la incidencia de la enfermedad a intervalos de 15 días, contando el número de frutos sanos y frutos enfermos, en cada unidad experimental. Posteriormente se evaluó la efectividad biológica de los tratamientos. La transformación a porcentaje de incidencia se empleó la fórmula: I= (FE/FT) *100. Donde: I= Porcentaje de incidencia, FE= Número de frutos enfermos y FT= Número total de frutos. Para le eficacia biológica de los tratamientos se usó la fórmula de Abbott, (1925). Ef= ((cd-td) /cd) *100. Donde: Ef= Eficacia biológica, cd= porcentaje de infección en el testigo, td=porcentaje de infección en el tratamiento.

El experimento se estableció bajo un diseño de bloques completamente al azar con tres repeticiones. La unidad experimental fue un contenedor con una planta.

Experimento in vitro

Se ocuparon medios de cultivo papa dextrosa agar (PDA) en cajas de Petri de plástico de 90 mm de diámetro. Para los tratamientos se ocupó el método de Agar envenenado modificado usado. El método consistió en colocar la dosis de los tratamientos (mL, mg) en matraces de 125 mL con el medio PDA; después se colocaron aproximadamente 20 mL de esta suspensión en cada caja Petri, para solidificar.

La siembra se realizó a través de punta de hifa, colocando un fragmento de PDA infectado con la cepa del hongo. Posteriormente la incubación se realizó a 28 ºC y el crecimiento radial del micelio se midió con un vernier cada 24 h, hasta que la caja Petri sin tratamiento cubrió por completo la superficie del medio.

Tratamiento: 1) Testigo; 2) Níquel, 2.5 mg L^-1 ; 3) Níquel, 7.5 mg L^-1 ; 4) Níquel, 10 mg L^-1 ; 5) Silicio, 50 mg L^-1 ; 6) Silicio, 100 mg L^-1 ; 7) Silicio, 150 mg L^-1 ; 8) AgNPs, 15 mg L^-1 ; 9) AgNPs, 25 mg L^-1 ; 10) AgNPs, 35 mg L^-1 ; 11) Ag/CuNPs, 4/8 mg L^-1 ; 12) Ag/CuNPs, 8/16 mg L^-1 ; 13) Ag/CuNPs, 12/24 mg L^-1 ; 14) CuNPs, 8 mg L^-1 ; 15) CuNPs, 16 mg L^-1 ; 16) CuNPs, 24 mg L^-1 ; 17) Switch® (cyprodinil y fludioxonil) 1000 mg L^-1 .

Variables evaluadas: Para la evaluación de sensibilidad de Botrytis cinerea en medios de cultivo in vitro estuvo basado en el crecimiento micelial radial de la colonia en el medio de cultivo. Se midió el diámetro (cm) cubierta por las colonias del hongo, en la placa del medio. Para transformación de datos a porcentaje de crecimiento se aplicó la siguiente formula; CM=(CI*100) /CT, Donde: CM=porcentaje de crecimiento micelial, CT= crecimiento del testigo (cm), Crecimiento influenciado por el tratamiento (cm). porcentaje de crecimiento micelial. Para el porcentaje de inhibición se aplicado la fórmula de Fokkema (1973). I=((d-D) /d) *100. Donde: I= Porcentaje e inhibición del crecimiento micelial (%), d= Diámetro del crecimiento de la colonia del testigo (cm), D= Diámetro del crecimiento de la colonia influenciado por el tratamiento (cm).

El experimento se estableció bajo un diseño completamente al azar con seis repeticiones en experimento laboratorio. La unidad experimental fue una caja Petri de 90 mm sembrada con el hongo.

Con los datos obtenidos se realizó un análisis de varianza con el paquete estadístico Statistical Analysis System (SAS 9.0), y una comparación de medias de Tukey (P≤0.05).

Resultados

Identificación morfológica

Cinco días después de la inoculación con Botrytis cinerea los frutos de fresa manifestaron síntomas de pudrición gris, además de abundante esporulación del hongo (Figura 1A).

Silicio, níquel y nanopartículas de plata y cobre en el manejo in vivo e in vitro de Botrytis cinerea en fresa (Fragaria x ananassa Duch.) - Image 1

Por otra parte, en el medio de cultivo se observaron colonias con crecimiento micelial concéntrico de color blanco, y cinco días después el micelio se tornó a color gris (Figura 1B). bajo microscopía de luz, se observaron conidióforos largos, septados, ramificados apicalmente y con racimos de conidios (Figura 1C). Todas las características observadas correspondieron a Botrytis cinerea con la descripción de Barnett y Hunter (2006)

Incidencia y efectividad biológica

En invernadero, las plantas del tratamiento testigo tuvieron mayor incidencia de B. cinerea en frutos (71%) que el resto de los tratamientos; lo anterior, destaca la importancia de aplicar estos productos en la reducción de la incidencia de la enfermedad (Figura 2A). El segundo tratamiento con mayor incidencia fue el de 100 mg Si L^-1 , con un valor de por 53% (Figura 2A). Asimismo, la efectividad biológica (α=0.05) del producto comercial Switch® fue de 84%, seguido por los tratamientos 15 mg Ag/CuNPs L^-1 , 15 mg AgNPs. L^-1 y Níquel a partir de sulfato de níquel (II) a dosis de 2.5 mg L^-1 en un 72, 68 y 70% respectivamente (Figura 2B).

Silicio, níquel y nanopartículas de plata y cobre en el manejo in vivo e in vitro de Botrytis cinerea en fresa (Fragaria x ananassa Duch.) - Image 2

Crecimiento e inhibición del micelio Botrytis cinerea, en medios de cultivo PDA

En el experimento in vitro, el efecto de los tratamientos en el crecimiento del micelio en la caja de Petri se evaluó a los 12, 24, 48,72 y 96 h, midiendo el diámetro de la colonia del hongo en las seis repeticiones de cada tratamiento. Los tratamientos: Switch®, Níquel dosis baja, AgNPs dosis alta, AgNPs dosis media y Ag/CuNPs dosis alta mostraron inhibición en el crecimiento de la colonia del hongo. Como se muestra en la Figura 3.

Silicio, níquel y nanopartículas de plata y cobre en el manejo in vivo e in vitro de Botrytis cinerea en fresa (Fragaria x ananassa Duch.) - Image 3

Veinticuatro horas después de la siembra del hongo en medios de cultivo PDA, el tratamiento CuNPs en su dosis baja 8 mg L^-1 favoreció el porcentaje de crecimiento del hongo en un 59% más que el testigo, seguido por Ag/CuNPs en la dosis baja con 20% más que el testigo. A las 72 h el tratamiento CuNPs en la dosis baja y media presenta un 10% de crecimiento que el testigo (Figura 4).

Mientras que el níquel dosis baja presentó solo 14% de crecimiento a las 72 h evaluadas, AgNPs dosis media y dosis alta presentó 39 y 36% de crecimiento micelial, respectivamente (Figura 4), lo que indica una actividad inhibitoria sobre el crecimiento del hongo. Switch® un producto comercial usado presentó 98% de inhibición. El níquel en su dosis baja presentó 85% de inhibición; AgNPs dosis alta 63%; AgNPs dosis media 60% y Ag/CuNPs solo 31% de inhibición en el crecimiento de micelio de B. cinerea (Figura 5). Los tratamientos que favorecieron el crecimiento del micelio en el medio de cultivo se presentaron con valores negativos en el porcentaje de inhibición, como se muestra en la Figura 5.

Silicio, níquel y nanopartículas de plata y cobre en el manejo in vivo e in vitro de Botrytis cinerea en fresa (Fragaria x ananassa Duch.) - Image 4

Silicio, níquel y nanopartículas de plata y cobre en el manejo in vivo e in vitro de Botrytis cinerea en fresa (Fragaria x ananassa Duch.) - Image 5

Silicio, níquel y nanopartículas de plata y cobre en el manejo in vivo e in vitro de Botrytis cinerea en fresa (Fragaria x ananassa Duch.) - Image 6

Discusión

La acción antifúngica de las AgNPs está dada por una gran relación entre área superficial y el volumen, por lo que exhiben un mejor contacto con el microorganismo. Son conocidos agentes antibacterianos potentes y de amplio espectro con actividad contra diversas especies dentro de bacterias grampositivas y gramnegativas (Morones et al., 2005; Kim et al., 2007; Lee et al., 2007; Vigneshwaran et al., 2007; Marambio y Hoek, 2010).

Glover et al. (2011) mencionan que la actividad antifúngica de AgNPs está dada en la formación de nuevas NPs en contacto con el medio (planta, medios de cultivo). La superficie de las AgNPs se oxida en presencia de oxígeno y agua, generando iones de plata (Ag+ ) que se disuelven en la capa de agua adsorbida dependiente de la humedad (Asay y Kim, 2005). Los iones de plata disueltos se difunden desde las partículas originales en la capa de agua absorbida como resultado de los fuertes gradientes de concentración alrededor de las partículas originales. Una vez formadas, las nuevas nanopartículas no se mueven. Con el tiempo, se forman partículas adicionales más alejadas de las partículas originales, lo que sugiere que las especies móviles son iones de plata, no las partículas mismas. La movilidad de los iones de plata en una capa de agua adsorbida en las superficies se ha informado en sistemas con gradientes electroquímicos (Conway y Bockris, 1958; Yang et al., 2006). Cuando se producen nuevas nanopartículas de Ag+ más pequeños mediante la reducción de los iones de plata en la superficie y el contacto directo entre las AgNPs y la pared celular de los hongos induce un daño celular, respondiendo a la inactivación fotocatalítica, donde el daño de la membrana citoplásmica podría ser el principal mecanismo de muerte que se ha informado (Kubacka et al., 2014; Foster et al., 2011). Los iones Ag+ atacan una amplia gama de procesos biológicos en microorganismos, incluida la estructura y funciones de la membrana celular (Pal et al., 2007).

Min et al. (2009) en sus pruebas para el crecimiento de hongos fitopatógenos, evaluaron los efectos de las AgNPs con las especies formadoras de esclerocios Rhizoctonia solani, Sclerotinia Sclerotiorum y S. minor, documentando que fueron inhibidos sus crecimientos de manera dependiente de la dosis, mismos resultados obtenidos en esta investigación en prueba in vitro contra Botrytis cinerea 63% de inhibición con una dosis de 35 mg L ^-1 y de 60% con dosis de 25 mg L^-1 . La investigación realizada por Kim et al. (2012) sobre efectos antifúngicos de las AgNPs contra diversos hongos patógenos de plantas, muestra que en Botrytis cinerea tuvo una inhibición de 100% con una concentración de 100 ppm de AgNPs, mientras que a una dosis de 25 ppm solo alcanzó 56.5%. Investigaciones realizadas por Lamsal et al., (2011a) en mildiu polvoriento en pepino y calabaza; en Colletotrichum (Lamsal et al., 2011b) y en contra diversos hongos fitopatógenos (Kim et al., 2012) muestran un efecto de inhibición a manera que las concentraciones de AgNPs van aumentando, alcanzando una tasa de inhibición más alta hasta los 100 ppm de AgNPs. Esto podría deberse a la alta densidad a la que la solución fue capaz de saturar y unirse a la hiedra fúngica y desactivar los hongos patógenos de plantas. Morones y colaboradores (2005) mencionan que las AgNPs se unían a la superficie de las membranas celulares y penetran dentro de la célula.

A medida que los iones de plata se mueven hacia las células, conducen a la producción de radicales superóxidos y otras ROS (especies de oxígeno reactivo) a través de una reacción con oxígeno (Feng et al., 2000) por lo que afecta principalmente a la función de las enzimas unidas a la membrana, como las de la cadena respiratoria (Mcdonnell y Rusell, 1999). Algunos estudios indican que las AgNPs podrían conducir a la muerte celular al interactuar con fósforo y compuestos de azufre y dañar el ADN y las proteínas internas (Krishnaraj et al., 2012).

Por otra parte, algunas investigaciones realizadas con níquel, señala que cuando se aplica a bajas concentraciones, el níquel puede reducir las enfermedades fúngicas (Barcelos et al., 2018; Oliveira et al., 1999). El níquel es un micronutriente esencial para las plantas superiores. (Brown et al., 1987).

En esta investigación, se obtuvo que en la aplicación de 2.5 mg de níquel L ^-1 obtuvo un valor de 69.6% de efectividad biológica y solo 21.6% de incidencia de la enfermedad en los frutos de fresa aplicados a las plantas vía foliar. Esta actividad antifúngica está dada por el papel esencial que tienen níquel en las plantas. Dixon et al. (1975), encontraron que este metal es un componente estructural de la metaloenzima ureasa (urea amidohidrolasa), que tiene dos iones níquel en su centro activo (Ciurli, 2001). Las ureasas podrían estar involucradas en los mecanismos de defensa de las plantas (Carlini y Grossi-de-Sá, 2002), llamadas defensa elemental (Polacco et al., 2013).

Y en pruebas in vitro se obtuvo que el níquel a una dosis de 2.5 mg L-1 ocasionó una inhibición de 85.5% en B. cinerea en comparación con el testigo. Lo que podría atribuirse a un inactivador de enzimas de patogenicidad del patógeno B. cinerea.

Por lo que se puede deducir que en este ensayo de la investigación in vitro el níquel un metal de transición con estados de oxidación +2, +3 igual que Cu. Con una alta homología, y con un sitio de unión de metal virtualmente superponibles, Cu-Zn-SOD podría incorporar níquel (Ni) en lugar de Cu en el centro activo, inactivamente esta proteína y su efecto de virulencia. Como es reportado por Vance y Miller (1998) en Escherichia coli con MnSOD que en altas concentraciones de Fe extracelular presentes fue reemplazado al manganeso en el sitio activo de MnSOD y esté se vuelve inactiva. Mismo comportamiento es reportado por Hodgson y Fridovich (1975) donde menciona que “el radical OH no se difunde libremente del sitio activo, sino que está unido y, por lo tanto, puede atacar a las histidinas que se unen al cobre en el sitio activo y que también puede sufrir un barrido por un sustrato externo que puede acercarse lo suficiente al sitio activo”

Por tanto, si la enzima incorpora el níquel en su centro activo este es inactivada, el proceso del patógeno es detenida, dado que se requiere SOD para la infección del huésped (Rolke et al., 2004).

Finalmente, las Ag/CuNPs a una dosis de 15 mg L^-1 presentan un efecto inhibidor en el crecimiento de B. cinerea, en los frutos de fresa; con una infección de 20.4% y un control de 71.8%. mientras que en las pruebas in vitro en dosis de Ag/CuNPs 12/24 ml L^-1 presentó solo 30% de inhibición a las 72 horas evaluadas. Ouda (2014), reportó que las Ag/CuNPs presentaron una alta actividad antifúngica a una concentración de 15 mg L^-1 en el crecimiento de Alternaria alternata y Botrytis cinerea. Las AgNPs y CuNPs tienen importancia como nuevos agentes antimicrobianos debido a sus fuertes propiedades antimicrobianas contra una amplia gama de microorganismos que incluyen organismos que han generado resistencia alguna (Ouda, 2014).

El silicio no tuvo una actividad favorable en pruebas en campo y en medios de cultivo, lo cual podría atribuirse a la concentración que se estuvo evaluando. En investigaciones realizada por Santiago et al. (2017) se concluyó que con dosis de 5 g de silicio L^-1 se obtiene un mayor control ante B. cinerea. Y el cobre por ser un metal indispensable en la enzima Cu-Zn-SOD, probablemente fue usado como un centro de recarga de la metaloenzima del patógeno dado que las concentraciones que se usaron fueron bajas, lo que podría atribuir su nula actividad antifúngica y un favorable crecimiento del micelio.

Conclusión

La aplicación foliar y en medios de cultivo de AgNPs, así como de níquel redujeron la incidencia de Botrytis cinerea en frutos de fresa y tuvieron un alto porcentaje de inhibición en el crecimiento del hongo. La actividad antifúngica de las AgNPs está relacionada con el incremento de su concentración en el medio, mientras que el níquel presentó mayor actividad antifúngica en concentraciones bajas. En este sentido, se detecta potencial en el uso de AgNPs y Ni para el manejo de Botrytis cinerea.