Marcadores Moleculares en el Mejoramiento de Trigo

A partir de la incorporación de los marcadores moleculares en el mejoramiento del trigo, es posible modificar el escenario para reemplazar el concepto de producción de un solo tipo de trigo de exportación (commodity) por el de producción de especialidades con mayor valor agregado en el componente tecnológico. También permite proteger el cultivo contra enfermedades mediante la incorporación de nuevas fuentes de resistencia a patógenos.

La realidad actual enfrenta al mejoramiento con la creciente demanda de diversificar la producción de trigos en función de requerimientos industriales específicos (pan, pastas, galletitas, etc.) impulsada por sectores del mercado interno e internacional; y con el hecho de que las nuevas variedades de trigo no permanecen mucho tiempo en el mercado porque se vuelven susceptibles a patógenos.

Esto último es la resultante de la estrecha variabilidad genética del cultivo para resistencia a patógenos -en general en el proceso de mejora se priorizan aspectos relacionados con adaptación a diferentes ambientes y rendimiento- y por otro lado, las nuevas condiciones de manejo de cultivo pueden favorecer el desarrollo de hongos.

Una forma de resolver de modo eficiente esta coyuntura consiste en complementar los programas de mejoramiento tradicionales con herramientas biotecnológicas; los marcadores moleculares, el cultivo de tejidos y la transformación genética son las de mayor difusión en el cultivo de trigo. A partir de la incorporación de estas herramientas en el mejoramiento es posible modificar el escenario del trigo reemplazando el concepto de producción de un solo tipo de trigo de exportación (commodity) por el de producción de especialidades derivadas de trigo con mayor valor agregado en el componente tecnológico y protegiendo el cultivo contra enfermedades mediante la incorporación de nuevas fuentes de resistencia a patógenos como roya de la hoja, fusariosis de la espiga, etc.

Todos estos casos tratan de la manipulación de caracteres simples o genes principales de caracteres complejos, donde la biotecnología es, comparativamente, más eficiente que el mejoramiento tradicional. No sucede lo mismo con caracteres más complejos como por ejemplo, tolerancia a salinidad, tolerancia a sequía, alto rendimiento, etc., donde el mejoramiento tradicional es más efectivo.

La selección asistida por marcadores moleculares (SAM) es en la actualidad la vía más económica para capitalizar el creciente caudal de información genómica de trigo y especies emparentadas e incorporar rápidamente caracteres valiosos en un germoplasma cualquiera.

Esta tecnología se basa en identificar una secuencia singular o única de ADN (marcador molecular) cercana a un carácter de interés agronómico (por ejemplo un gen de resistencia a roya de la hoja). Una vez logrado, las plantas portadoras de ese carácter agronómico son rápidamente seleccionadas en poblaciones segregantes según presenten o no el marcador. El proceso de selección "molecular" se independiza del fenotipo y del ambiente y puede hacerse en cualquier estadio fenológico de la planta.




Figura 1. Patrones diferenciales de ADN producto de PCR para individuos portadores de alelos WxA1b, WxB1b y WxD1b de trigo hexaploide. A. Marcador para el alelo WxA1b (waxy nulo genoma A), 1 Kern (normal), 2 TH7 (nulo), 3 Komugi Nourin67 (nulo), 4 Fumigi Komugi (nulo). B. Marcador para el alelo WxB1b (waxy nulo genoma B), 1 Buck Brasil (normal), 2 Buck Farol (normal), 3 TH7 (nulo), 4 Buck Poncho (normal). C. Marcador para el alelo WxD1b (waxy nulo genoma D), 1 Fumigi Komugi (normal), 2 Kern (normal), 3 TH7 (nulo), 4 Neepawa (normal). La punta de flecha blanca indica el fragmento polimórfico ligado al carácter waxy en cada uno de los tres casos. M: en todos los casos estándar de longitud de fragmentos de ADN. La punta de flecha negra indica fragmento de 500bp.


Figura 2. Separación de gliadinas de diferentes cultivares argentinos mediante electroforesis ácida (APAGE).
Los cuatro grupos de gliadinas (w, g, b y a, según su movilidad electroforética creciente) se indican por llaves. En las calles, de izquierda a derecha: 1- Prointa Colibrí; 2- Buck Panadero; 3- Coop. Liquén; 4- Buck Pronto; 5- Buck Arriero; 6- Prointa Bon. Alazán; 7- Baguette 10; 8- Klein Martillo.

La mecánica de incorporar caracteres agronómicos en un individuo utilizando marcadores moleculares no genera las controversias en la opinión pública que actualmente poseen los organismos transgénicos. Países como EE.UU., Canadá, Australia, Inglaterra y Francia tienen incorporada la selección asistida por marcadores moleculares al mejoramiento tradicional de trigo para resolver problemas puntuales de calidad industrial y susceptibilidad a ciertas enfermedades. En la Argentina, el Programa Nacional de Mejoramiento de Trigo del INTA ha incorporado la SAM en las siguientes áreas de investigación:


GERMOPLASMA DE TRIGO CON CALIDADES DIFERENCIADAS

Contenido de proteína en grano

La presencia de un gen principal proveniente de una translocación de T. dicoccoides en el cromosoma 6B de la variedad Glupro permite aumentar hasta un 13% el contenido de proteína en grano sin afectar el rendimiento, característica deseable tanto para trigos panaderos como para candeales.

Existen marcadores moleculares ligados a este gen que permiten incorporar este carácter en cualquier germoplasma mediante un proceso de SAM. Actualmente, el Instituto de Recursos Biológicos del Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias del INTA Castelar está incorporando este carácter en germoplasma argentino siguiendo un programa de retrocruzas asistido por el marcador ligado.


Absorción de agua en harina a través de modificación de la dureza del endosperma de grano

La textura del endosperma afecta marcadamente la dureza del grano de trigo y condiciona su uso industrial. Durante la molienda de granos con endosperma duro se dañan físicamente los gránulos de almidón mientras que la molienda de trigos blandos produce harinas con gránulos de almidón intactos. Las harinas con gránulos de almidón dañado absorben mayor cantidad de agua y son preferidas para la preparación de pan mientras que las harinas con gránulos intactos absorben menos agua y se prefieren para galletas dulces y bizcochuelos. La textura del endosperma está regulada por un complejo de proteínas denominado friabilinas que incluye puroindolina A, puroindolina B (pinA y pinB) y una tercer proteína llamada GSP (grain soft protein).

Distintas mutaciones en pinA o pinB han sido asociadas con granos de textura de endosperma duro. En un trabajo se observó que variedades de trigos duros con pinA mutada son de textura más dura que variedades con la mutante de pinB.
También, en 1999, científicos desarrollaron marcadores moleculares que identifican las mutantes de ambos genes. Estudios preliminares realizados en el IRB del INTA Castelar sobre 101 variedades panaderas argentinas presentaron en su totalidad dos variantes genotípicas igualmente representadas: pinB mutada y pinA normal o la inversa, pinA mutada y pinB normal, que es lo esperable para trigos duros. Estrategias para modificar el grado de textura de grano podrían considerarse a partir de la manipulación de las variantes alélicas detectadas.

Por un lado, sería esperable un mayor grado de dureza si se combinaran en un genotipo ambas mutantes. Sin embargo, dado el estrecho ligamiento entre los genes que codifican estas proteínas, la probabilidad de detectar esta recombinante es muy baja. Algo más sencillo de implementar es el reemplazo de la combinación de puroindolinas mutada y normal de una variedad dura por una combinación de ambas puroindolinas normales correspondiente a una variedad blanda y de este modo "ablandar" la textura de una variedad dura.

En el IRB del INTA Castelar y en la Estación Experimental Agropecuaria Marcos Juárez de INTA se han iniciando trabajos para convertir variedades duras en blandas, aptas para galleta o bizcochuelo, siguiendo la hipótesis de reemplazo de combinación de puroindolinas duras por puroindolinas blandas, ya que existe demanda harinera para esta calidad diferenciada y no hay material específicamente desarrollado en el país.


Propiedades físico-químicas del almidón

El almidón de trigo tradicional está constituido por dos tipos de carbohidratos, amilopectina (78-65%) y amilosa (22-35%).

Cuando el almidón del grano se compone exclusivamente de amilopectina adquiere una textura cerosa al tacto y se lo conoce como almidón waxy. La enzima GBSS (granule- bound starch synthase), codificada por el locus Waxy (Wx) es responsable de la síntesis de la amilosa del almidón. El trigo hexaploide presenta tres loci Wx - Wx-A1a, Wx-D1a y Wx-B1a - localizados en los brazos cortos de los cromosomas 7A, 7D y en el brazo largo del cromosoma 4A, respectivamente.

A mediados de la década del 90, se estableció una relación directa entre la reducción del contenido de amilosa y la presencia de alelos nulos para los loci Wx- Wx-A1b, Wx-D1b y Wx-B1b. Además se analizaron
colecciones de trigos de todo el mundo y detectaron variedades nulas simples, dobles y triples para los loci Wx.

Trigos panaderos portadores de alelos nulos Wx son de interés para la producción de harina de trigo apta para elaborar un tipo de pastas que se consumen principalmente en China y Japón denominados"noodles". En el INTA Marcos Juárez se diseñaron marcadores para las mutantes Wx4A1b, Wx7A1b y Wx7D1b que permiten la selección de estos fenotipos en poblaciones segregantes de manera sencilla y eficiente (Fig. 1). Estos marcadores están siendo utilizados para seleccionar germoplasma waxy parcial (Wx4A1b), apto para la elaboración de noodles y para desarrollar germoplasma triple nulo (Wx4A1b, Wx7A1b y Wx7D1b) para la producción de almidón waxy de trigo, un potencial sustituto para almidones waxy de maíz y papa.

Lesiones producidas por Roya de la Hoja


Ausencia de lesiones de Roya de la Hoja.

Figura 3. Incorporación mediante selección asistida por marcadores moleculares del gen Lr47 en germoplasma susceptible a roya de la hoja. A. variedad originalmente susceptible (Prointa Oasis) recurrente en el programa de retrocruza.
B. individuo portador del gen Lr47 seleccionado en una población segregante.



Figura 4. Toma laboratorio Biotecnología EEA Marcos Juárez

Constitución de gluteninas y gliadinas para distintos usos industriales.

En trigos hexaploides y candeales la calidad industrial está determinada por un componente ambiental y por un componente genético (composición de proteínas de reserva del endosperma o gluten). Dentro de estas proteínas, las gluteninas y gliadinas son los principales determinantes de las propiedades visco-elásticas del gluten en el proceso de elaboración del pan, pastas, bizcochuelos, etc.

Las gluteninas son subunidades poliméricas que forman extensos entramados en la masa de harina mediante uniones tipo puentes disulfuro. Estas subunidades se clasifican según su movilidad en electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE) en gluteninas de alto y bajo peso molecular (HMWGs y LMWGs).

Las gliadinas son proteínas monoméricas que según su movilidad electroforética a pH ácido (A-PAGE) se clasifican en gliadinas, en orden decreciente de movilidad. En la región electroforética correspondiente a - gliadinas, también puede aparecer un tercer grupo de proteínas conocidas como secalinas, codificadas por la translocación de centeno 1BL/1RS.

Como corolario de numerosos estudios de interacción entre parámetros de calidad panadera y constitución de proteínas de gluten (principalmente HMWGs y secalinas) se creó un índice de denominado GLU-1, con valor máximo de 10. En general, valores altos de este índice (8-10) se correlacionan con mayor fuerza de gluten, que es una característica deseable para panificación industrial y congelados, mientras que valores bajos del índice GLU-1 (5-7) se asocian con baja tenacidad del gluten, lo que es deseable para panificación directa y galleta cracker. Este índice ha sido utilizado como criterio de selección en programas de mejoramiento para trigos duros tipo pan de Canadá y Australia, donde actualmente no se utilizan líneas avanzadas con HMWGs deíndice GLU-1 inferior a 10. En el INTA, un estudio reciente realizado sobre variedades argentinas categorizadas por la CONASE (Comisión Nacional de Semillas), permitió determinar la utilidad del índice GLU-1 como criterio de selección para el desarrollo de germoplasma con buena calidad panadera. El INTA está realizando trabajos de caracterización de HMWGs de las variedades y líneas de mejoramiento utilizadas en el país a fin de seleccionar padres de índice GLU-1 ideal y buena calidad panadera, para el desarrollo de germoplasma de calidad panadera superior (colecciones núcleo para calidad panadera).

En relación al efecto de gluteninas y gliadinas sobre la calidad de trigos candeales, un ensayo desarrollado por el INTA reveló interacción significativa entre alelos de HMWGs y parámetros de calidad de pasta.
El germoplasma evaluado presentó escasa variabilidad alélica para LMWGs y gliadinas.
En función de estos resultados el INTA prevé incrementar la variabilidad genética de LMWGs y gliadinas del germoplasma candeal mediante cruzamientos amplios entre variedades candeales y trigos panaderos que serán los aportantes de variabilidad genética para LMWGs y gliadinas.

Una característica particular de las gliadinas es su gran variabilidad genética. Esta variabilidad puede ser visualizada por electroforesis ácida (A-PAGE) bajo la forma de diferentes patrones de bandas proteicas (Fig. 2). Esta variabilidad ha sido utilizada por el INASE para confeccionar patrones identificatorios de las variedades registradas hasta el año 1996. El INTA está actualizando esta información con los patrones de nuevas variedades a fin de utilizar esta herramienta para identificación varietal, que es una demanda de comercialización básica para implementar la clasificación de trigos por grupos de calidad.



RESISTENCIA GENÉTICA A ENFERMEDADES FÚNGICAS

Roya de la hoja

La acumulación sucesiva de diferentes fuentes de resistencia a una enfermedad en un mismo genotipo es un proceso conocido como "piramidización" y resulta una estrategia promisoria para lograr resistencia durable en el tiempo. Esta idea es de difícil implementación en el mejoramiento tradicional debido a que una vez incorporado un gen de resistencia en una línea se torna difícil monitorear la incorporación de otros genes de resistencia al mismo patógeno, debido a que todas las plantas presentan el mismo fenotipo "resistente", a menos que el proceso de selección sea asistido por marcadores moleculares para cada uno de los genes que se desea piramidizar.

El INTA, en colaboración con J. Dubcovsky (Dpt. of Agronomy, UC Davis CA, EE.UU.), desde hace algún tiempo está trabajando sobre germoplasma local en la piramidización de nuevas fuentes de resistencia a Roya de la hoja asistida por marcadores moleculares. Para ello cuenta con marcadores públicos para los genes Lr47, Lr37 y Lr51.

Poblaciones avanzadas (F3BC5) portadoras de Lr47 se comportaron como resistentes a las razas de la roya de la hoja presentes en la región de Marcos Juárez durante los anos 1999, 2000, 2001 y 2002 (Fig. 3). El mismo comportamiento presentaron plantas portadoras de Lr51 frente a las razas de roya de la hoja presentes en Marcos Juárez durante la campaña 2002. Para el caso de Lr37, si bien existen reportes sobre razas locales de roya de la hoja que han quebrado su resistencia, ligado a este gen se encuentran los genes Sr38 y Yr17 que aun son efectivos frente a roya del tallo y roya amarilla.


Fusariosis de la espiga de trigo (FET)

El uso de cultivares resistentes es una de las medidas mas económicas para reducir el daño causado por la FET.

Desafortunadamente, numerosas evaluaciones sobre líneas de trigo de los más diversos orígenes no han permitido identificar germoplasma inmune a la enfermedad.

De todos modos es posible observar variación en la respuesta al patógeno frente a distintas líneas de trigo. A partir de esta información se identificaron tres fuentes principales de resistencia a la enfermedad: trigos invernales del este de Europa, trigos primaverales de Brasil e Italia, trigos primaverales de China y Japón.

Dentro del grupo de trigos de China y Japón se destaca el cultivar Sumai3. Para este caso se han publicado recientemente marcadores ligados a una región genómica que explica entre un 41 y un 24% de la resistencia a FET en dos poblaciones independientes.

Este locus de carácter cuantitativo (en inglés QTL) se ubica en el cromosoma 3BS y se halla ligado a microsatélites que pueden ser utilizados para selección asistida.

La resistencia a FET disponible en los cultivares de trigo argentinos es de tipo parcial o incompleta por lo que se expresa no como ausencia de síntomas sino como niveles más bajos de intensidad. En la actualidad, un grupo de cultivares entre los que se cuentan ACA 223, Buck Guapo, Buck Farol, Klein Cacique, Klein Escorpión, Klein Sagitario, Prointa Granar, Prointa Molinero, entre otros, poseen ese tipo de resistencia.

El INTA esta trabajando en la incorporación del QTL proveniente de Sumai3 en germoplasma local a fin de incrementar la resistencia a este patógeno.


CONCLUSIONES

Con la incorporación de la selección asistida por marcadores dentro del mejoramiento tradicional es posible dar solución a las demandas específicas de calidad industrial o a los problemas de susceptibilidad a ciertos patógenos en líneas avanzadas de mejoramiento que de otro modo serían eliminadas del programa.

Cada día es mayor el volumen de información genómica-molecular que se publica sobre trigo en relación a caracteres de interés agronómico. El modo más sencillo y eficiente de incorporar esta información en el desarrollo de nuevas variedades de trigo es a través del mejoramiento asistido por marcadores moleculares.