Evaluación de la patogenicidad de Xenorhabdus spp. nativos en Colombia

Los nematodos (entomopatógenos (neps) de los géneros Steinernema y Heterorhabditis son utilizados para el manejo de un amplio rango de especies de insectosplaga de importancia agrícola (Hazir et al., 2003). El mecanismo por el cual estos organismos infectan y se reproducen en los insectos hospederos involucra una relación mutualística entre el nematodo y las bacterias simbióticas Xenorhabdus spp y Photorhabdus spp. (Akhurst y Dunphy, 1993; Forst y Nealson, 1996; Adams et al., 2006; Chaston et al., 2011). Las bacterias se caracterizan por ser Gram-negativas, anaerobias facultativas, no forman espora, presentan numerosos pelos flagelares y sólo se recuperan de los infectivos juveniles (IJS) o de hospederos infectados (Akhurst y Boemare, 1990; Hinchliffe et al., 2010).

Además de ser patógenas a insectos (Boemare y Akhurst, 1988; Burnell y Stock, 2000; Hinchliffe et al., 2010), producen metabolitos antimicrobianos (Webster et al., 1998), antibióticos de bajo peso molecular y enzimas extracelulares como proteasas, lipasas, fosfolipasas y DNAasas. Estos compuestos están involucrados en la destrucción de tejidos de insectos que son utilizados como alimento para los neps (Forst y Nealson, 1996; Adams et al., 2006; Hincliffe et al., 2010).

El rango de actividad antibiótica es variable y depende de la especie bacteriana y de la fase de desarrollo (Akhurst 1982). Aunque los IJS juegan un papel importante en la muerte del insecto al transportar la bacteria, la cual es suficiente para causar mortalidad cuando es inyectada al hemocele del insecto (Gotz et al.,1981).

Estudios realizados han demostrado que la suspensión bacteriana es tóxica a especies de insectos como la hormiga de fuego, Solenopsis invicta (Hym:Formicidae), asperjadas sobre hojas de algodón (Gossypium hirsutum) (Dudney 1997) y sobre larvas y pupas de Spodoptera exigua (Elawad et al., 1999). Asimismo, la aplicación de células en solución y el filtrado bacterial de Xenorhabdus nematophila en suspensión acuosa fue letal a las larvas de Plutella xylostella (Lep.:Plutellidae). Su aplicación sobre hojas de Brassica oleracea var. Chinese mostraron que las células pueden penetrar en los insectos en ausencia del nematodo. Las soluciones libres de células bacteriales que contenían los metabolitos también fueron efectivas, lo cual representa una posible estrategia para el control de insectos sobre el follaje (Mahar et al., 2004).

De igual manera, Yi y Ehlers (2006) evaluaron el potencial de la aplicación de Bacillus thuringiensis en mezcla con X. nematophila sobre larvas de tercer instar de P. xyllostella. Se considera que los patógenos de insectos son una fuente de nuevos agentes insecticidas que proporcionan toxicidad. Especialmente las bacterias de los géneros Xenorhabdus y Photorhabdus son consideradas como una mina de oro, que codifican una multitud de toxinas insecticidas. Algunas altamente específicas a determinadas especies de insectos y otras más generalistas, pero con gran potencial de uso en la protección de cultivos. Además, estas bacterias están equipadas para producir un vasto rango de compuestos antimicrobiales los cuales también podrían usarse en la ciencia médica (Bowen y Ensign, 1998; Ffrench y Bowen, 1999; Ensigne et al., 2002; Hinchliffe et al., 2010).

Considerando el potencial bio-controlador de estas bacterias, se propuso caracterizar morfológica y bioquímicamente aislamientos nativos obtenidos de suelos dedicados al cultivo de Bactris gasipaes K, chontaduro y en guaduales, Guadua angustifolia Kunth. Así mismo, evaluar su patogenicidad sobre larvas de G. mellonella, (insecto hospedante de fácil manejo y reproducción) como una preselección in vitro del potencial que permita su implementación en opciones de manejo de insectos-plaga en nuestro país.

Nematodos entomopatógenos
Los 13 aislamientos de Neps fueron reactivados del cepario del laboratorio de biología molecular de la Universidad Nacional de Colombia, sede Palmira que se encuentra a 4 °C, la procedencia de cada aislamiento se presenta en la tabla 1. Para su reactivación se utilizaron larvas de último instar de G. mellonella (insecto sobre el cual está estandarizado la producción in vivo y sobre las larvas de último instar por su mayor tamaño, lo cual garantiza una mayor producción de neps). La reactivación se realizó de acuerdo a la metodología de Kaya y Stock (1997). Cada aislamiento se inoculó sobre 20 larvas de G. mellonella con una solución de 200 IJS/ml en cajas Petri de 100 mm y papel toalla estéril mantenidas en oscuridad durante 7-10 días con condiciones de 23 °C±3 de temperatura y 65% ± Humedad Relativa (HR). Los IJS se recuperaron de las trampas White y se almacenaron en agua destilada estéril a 4°C durante 7 días antes de iniciar el proceso de aislamiento de las bacterias.

Aislamiento y purificación bacteriana
Las bacterias se aislaron mediante la técnica modificada de macerado de IJS (Boemare et al.,1997), la cual consistió en la desinfección de 100 IJS por inmersión en una solución de hipoclorito de Sodio (NaClO) al 3% , durante 3±1 min , seguido de tres enjuagues con agua destilada estéril. Posteriormente, 40 IJS se adicionaron en una gota de hemolinfa de G. mellonella. Se maceraron con un pistilo estéril y se sembraron 100 µl en agar NBTA (Agar Nutritivo; 25 mg Azul de Bromotimol; 40 mg; 1000 ml agua destilada Cloruro de Trifeniltetrazolium), y se incubaron en la oscuridad a 28 °C durante 72 h. 

Caracterización fenotípica y bioquímica de las bacterias
La caracterización fenotípica de la forma primaria de las bacterias, se realizó con tinción de Gram, pruebas bioquímicas de motilidad, actividad proteasa, lipasa y lecitinasa, producción de antibióticos y la detección de la bioluminiscencia sugeridas por Boemare et al. (1997) y Arkhurst (1980). Adicionalmente, se realizaron siembras por estrías en medio MacConkey para observar la capacidad de absorción del rojo neutro. La absorción de Azul de Bromotimol y la reducción del Cloruro de Trifeniltetrazolium se evaluó en medio NBTA (Boemare et al., 1997).

La prueba de motilidad se evaluó en medio semisólido, para determinar la presencia de flagelos. La actividad proteasa en agar-gelatina, la actividad lipasa en Tween 80, la lecitinasa en agar nutritivo suplementado con yema de huevo al 10%, la luminiscencia se determinó por observación de las colonias en agar nutritivo en un cuarto oscuro por 10 minutos y la producción de antibióticos se evaluó por la medición del halo de inhibición de crecimiento frente a B. thuringiensis (suministrada como cepa en crecimiento en caja Petri, no en formulación comercial, por la empresa Bioecológicos del Valle del Cauca).

Evaluación de la patogenicidad
Se inocularon larvas de último instar de G. mellonella con una jeringa de insulina cargada con 10 µl de solución de cada aislamiento bacteriano con una concentración de 10⁴ cel/ml. La inoculación se realizó a la altura del último par de patas. Las larvas se individualizaron en vasos plásticos de 4 onzas. La mortalidad se registró a las 12, 24 y 48 h después de inoculadas. El diseño experimental fue de tipo factorial, con seis larvas por unidad experimental y cinco repeticiones en el tiempo (6 larvas x 14 tratamientos (13 aislamientos y el control) x 3 tiempos y 5 repeticiones= 1260). El control se inoculó con 10 µl de solución Ringer (9 g NaCl, 0.4 g KCl, 0.4 g CaCl₂ , 0.2 g NaH₂CO₃ en un litro de agua) (Kaya y Stock, 1997).

El crecimiento bacteriano dentro de la larva se evaluó en términos de UFC, sembrando una gota de hemolinfa de larvas (previamente desinfectadas en Hipoclorito al 3%, durante 3 min) en medio NBTA a las 12, 24 y 48 h, después de la inoculación. El diseño experimental y los tratamientos fue igual al del ensayo anterior.

Análisis estadístico
Los datos se sometieron a un análisis de varianza y a la prueba de comparación de medias de Duncan. Se analizó la interacción entre: (i) los 13 aislamientos bacterianos y los tres tiempos con la mortalidad de larvas; (ii) los 13 aislamientos bacterianos y los tres tiempos evaluados en la curva de crecimiento bacteriano.

Resultados y discusión
Los 13 aislamientos bacterianos presentaron los principales rasgos fenotípicos descritos para el género Xenorhabdus (Akhurst y Boemare, 2005) de la familia Enterobacteriaceae. Los miembros de esta familia son bacilos Gram-negativos anaerobios facultativos, negativos para oxidasa, no forman esporas, heterótrofos quimiorgánicos con metabolismo fermentativo y respiratorio y con la excepción de unos pocos miembros, son motiles por flagelos perítricos (Brenner, 1999). Xenorhabdus y Photorhabdus son típicos de la familia Enterobacteriaceae y ningún otro miembro de esta familia es fenotípicamente similar (Holt et al., 1994). Por ejemplo, Xenorhabdus es negativo para catalasa, similar solamente a Shigella dysenteriae y la mayoría de Xenorhabdus y Photorhabdus son negativos para nitrato reductasa, característica compartida solamente con algunas cepas de Erwinia y Yersinia (Boemare, 2002; Brenner, 1999). La diferencia más marcada entre los dos géneros es que la mayoría de los aislamientos de Photorhabdus son bioluminicentes y catalasa positivos mientras que Xenorhabdus son negativos para ambas características (Forst et al., 1997). Ambos géneros producen formas fenotípicas variables. La forma primaria o fase I es la forma naturalmente asociada con los nematodos, mientras que la forma secundaria o fase II puede aparecer espontáneamente cuando la bacteria está en cultivo. Las diferencias entre las fases son que en fase I la bacteria produce antibióticos, adsorbe ciertos colorantes y tiene inclusiones intracelulares compuestos de proteínas cristalinas, mientras que la fase II, no adsorbe colorantes, no produce antibióticos y produce inclusiones intracelulares ineficientemente. La forma de la colonia son diferentes y la diferencia en patogenicidad se ha observado sobre algunos hospederos (Volgyi et al., 1998; Adams et al., 2006; Thomas y Poinar, 1979), lo que demuestra su relación con los neps del género Steinernema (figura 1A).

Las células bacterianas aisladas mostraron movilidad en las pruebas de agar semisólido y al exámen microscópico se identificaron como bacilos Gram negativos con cuerpos de inclusión (figura 1B). Las prueba lipasa, lecitinasa (figura 1C) y proteasa fueron positivas para todos los aislamientos.

Los aislamientos mostraron la capacidad de producir antibiótico para inhibir el crecimiento de B. thuringiensis (figura 1D), mostrando diferencias en los diámetros de los halos de inhibición de crecimiento. La luminiscencia fue negativa para todos los aislamientos (tabla 2) del género Steinernema sólo las bacterias del género Photorhabdus son las únicas bacterias terrestres bio-luminiscentes.

Las colonias en medio NBTA (figura 1E) mostraron una coloración azul (Fase I), por absorción del Azul de Bromotimol, a excepción del aislamiento UNPX12 cuya coloración fue verde-azulada, lo cual de acuerdo a Kaya y Stock (1997) depende de la especie bacteriana. La forma de las colonias para todos los aislamientos fue redondeada, convexa, con borde definido, de color claro y 2 mm de diámetro aproximadamente (figura 1F). En medio MacConkey las colonias presentaron un tamaño de 4 mm de diámetro y se evidenció la absorción del Rojo Neutro y fermentación de la Lactosa, por la coloración rojiza de las colonias y viraje del medio. El crecimiento de las colonias fue lento, se observó crecimiento de colonias a partir de 72 h, en todos los medios evaluados. Esta descripción concuerda con los resultados encontrados por Campos et al. (2009) donde todos los aislamientos obtenidos a partir del macerado de IJS de neps mostraron coloración azul por absorción de pigmentos del medio, pero contrasta con lo reportado por Gerritsen et al. (1992) en la obtención de colonias rojas de Xenorhabdus spp. pertenecientes a formas variantes de la fase primaria

La mortalidad de larvas de G. mellonella en el tiempo y entre aislamientos, fue analizada mediante la prueba de Duncan (tabla 3), resultando significativamente diferente (p<0.05) y se incrementó con el paso del tiempo de una manera diferencial en cada aislamiento, como se observa en la figura 2.

El máximo porcentaje de mortalidad en el menor tiempo se logró con los aislamientos UNPX04 y UNPX15 (figura 2), las cuales empezaron a causar la muerte en larvas de G. mellonella por septicemia a partir de 12h después de la inoculación, ambas con un número de UFC superior a 10⁶ cell/ml. A pesar que otros aislamientos presentaron similitud en el número de UFC, no presentaron virulencia a las 12 h (tabla 4). Siete de los 13 aislamientos mostraron porcentaje de mortalidad mayor del 70% a las 24 h de inoculación, lo cual contrasta con lo obtenido por Campos et al. (2009) al evaluar X. bovienii ES14 aplicando el doble del volumen (20 µl) y la misma concentración sobre larvas de S. littoralis, alcanzando una mortalidad del 80% a las 24 h. Los resultados contrastan con los obtenidos por Mahar et al. (2005) quienes obtuvieron una mortalidad del 93% de G. mellonella con inoculaciones de X. nematophila a una concentración de 4x10⁷ cel/ml comparado con el 100% de mortalidad obtenido con los aislamientos nativos de UNPX04 de la Florida, Risaralda y UNPX15 de Llano Bajo, Valle del Cauca con una concentración de 104 cel/ml, sugiriendo que estos aislamientos son altamente virulentos. 

Las UFC en tiempo y entre aislamientos fueron significativamente diferentes (P<0.05), como se observa en la figura 3, debido a que no todas las especies desarrollan los mismos factores de virulencia (toxinas) para evadir el sistema inmune del insecto hospedero.

En general el aumento de UFC se observa entre las 12 y 24 h después de la inoculación como lo describe Sicard et al. (2004). El crecimiento exponencial retrasado de los aislamientos posiblemente se deba a que las bacterias quedan atrapadas en los hemocitos, donde se multiplican lo suficiente para después pasar al hemocele

 

 

 

 

Se encontraron diferencias entre los aislamientos así: en los aislamientos UNPX01, UNPX04, UNPX06, UNPX09, UNPX10, UNPX12 y UNPX15 la septicemia se produjo antes de la muerte de las larvas, mientras que en los aislamientos UNPX02, UNPX03, UNPX07, UNPX08, UNPX12, y UNPX13 la mortalidad de la larva ocurrió cuando el crecimiento bacteriano se encontraba en el pico de la fase estacionaria, como lo mencionan Clarke y Dowds (1995).

El mayor porcentaje de mortalidad de G. mellonella inoculada con los aislamientos bacterianos se observa a las 48h, debido a que la mayoría de aislamientos empezaron a morir a partir de las 24h (figura 2).

La identificación molecular de las especies bacterianas, hace parte de la continuación de este trabajo (dato no publicado).