Empleo de marcadores RAPD para el análisis de la variabilidad genética en genotipos de tomate (Lycopersicon esculentum, Mill.)

Publicado el: 25/7/2010
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En el Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA) se sembraron en condiciones semicontroladas 6 posibles radiomutantes  de tomate  con sus respectivos donantes con el objetivo de evaluar la variabilidad genética de los mismos mediante el empleo de marcadores  RAPDs. Los 14 cebadores utilizados generaron 80 bandas polimórficas, determinando un total de 90 bandas. Estos resultados sugieren la existencia de una gran diversidad genética dentro del material analizado, diferenciándose molecularmente 4 genotipos de sus respectivas variedades donantes. (Palabras claves: Lycopersicon esculentum Mill, variabilidad genética, marcadores RAPD). 

SUMMARY

In the National Center of Agricultural Sanity (CENSA) were sowed the seeds of 6 possible tomato radiomutantes with their respective donating varieties in the glasshouses with the objective to evaluate genetic variability by the RAPD' markers. The 14 used primers generated 80 polymorphic bands, determining a total of 90 bands. These results suggest the existence of a great genetic diversity inside the analysed material, differing 4 genotypes of their respective donating varieties molecularly.  

(Key words: Lycopersicon esculentum Mill, genetic variability, markers RAPD). 

 

INTRODUCCIÓN. 

Ha sido demostrada la importancia de los marcadores morfológicos y bioquímicos (1, 2), en la evaluación de las diferencias entre genotipos de tomate, para la discriminación de variedades de esta hortaliza, a través de programas de mejoramiento genético, para adaptación a las condiciones climáticas. Sin embargo, los marcadores morfológicos y bioquímicos no son capaces de detectar suficiente polimorfismo entre variedades o especies próximas debido a que son resultados de la expresión genotípica, del ambiente y de la interacción entre el genotipo y el ambiente (3), por lo que es imprescindible caracterizar con la mayor acuciosidad posible la diversidad genética que presenta cada colección. Los avances de la tecnología del ADN recombinante, han permitido el desarrollo de los marcadores basados en el ADN, consiguiendo estabilidad en la identificación de especies y variedades (4). En este sentido, un método muy efectivo es la aplicación de marcadores moleculares como RAPD, RFLP, AFLP, etc. que suministran un buen diagnóstico sobre la estructura de las poblaciones silvestres o sobre la diversidad de las colecciones establecidas (5). En el presente trabajo se emplearon los marcadores RAPD, con el objetivo de corroborar si los genotipos seleccionados por su alto potencial productivo en condiciones de bajos suministros de agua, se diferencian molecularmente de sus respectivas donantes.

 

MATERIALES Y MÉTODOS 

Semillas de los genotipos de tomate seleccionados en condiciones de bajos suministros da agua en el Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), fueron sembradas conjuntamente con sus respectivas variedades donantes (Tabla 1), en cajuelas con suelo Ferralítico Rojo esterilizado y mantenidas en casa de cristal bajo condiciones semicontroladas a temperatura de 230C +/- 20C y una humedad relativa entre 80-85%, con un fotoperíodo natural, en el Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA).  

Tabla 1. Relación y origen del material vegetal utilizado.

Genotipos

Origen

INCA-9-1

Cruzamiento de Ontario 7710 X Campbell-28 (variedad donante )

R16-300

Irradiación de la variedad INCA-9-1 con 300 Gy de rayos gamma 60Co.

R20-300

             "                                                                     "

R4-300

             "                                                                     "

R19-500

Irradiación de la variedad INCA-9-1 con 500 Gy de rayos gamma 60Co.

Amalia

Cruzamiento y retrocruces entre Campbell-28, Caribe, INCA -3 y HC-2580 (variedad donante)

R15-500

Irradiación de la variedad Amalia con 500 Gy de rayos gamma 60Co.

R17-500

             "                                                                     "

A los 30 días de germinadas las semillas se tomaron hojas jóvenes y se les realizó una extracción de ADN (6), a todo el material vegetal mencionado anteriormente. La calidad del ADN se constató por electroforesis de los extractos en geles de agarosa al 0.8% y solución amortiguadora de corrida TBE 0.5X (45mM Tris-Borato, 1mM EDTA pH 7), teñidos con bromuro de etidio (5mg/ml) y observados en un transiluminador  (Bioblock Scientific). La concentración se estimó por la medición de la densidad óptica a 260 nm  en un espectrofotómetro Ultrasepec Plus Spectrophotometer Pharmacia LKB.       .

La reacción de amplificación se realizó en un volumen total de 25uL que contenía: 10mM Tris-HCl a pH 8,3; 50mM KCl,  2mM  MgCl2,  0.001% de gelatina, 100uM de cada dNTPs, 5 pmoles de cebador ( Kits OPA y  OPF de la firma comercial Operon Technologies), 100ng de ADN genómico y 2U de Taq ADN polimerasa (Amplicen). La amplificación se produjo en un termociclador marca Techme de la firma Progene programado para 45 ciclos de 1 min. a 94ºC, 1 min. a 36ºC y 2 min. a 72ºC, y un ciclo de 10 min. a 72ºC. Los productos de la PCR se visu aliz aron por electroforesis en gel de agarosa al 1,5% en solución amortiguadora TBE 0.5X y se tiñeron con bromuro de etidio, antes de ser observados en un transiluminador. Los productos de la PCR se reportaron, tomando las bandas más intensas, como presentes [1] o como ausentes [0] en cada genotipo, creando así una matriz de valores binarios que se analizó a través de la aplicación del software computacional CLATAX (7), para determinar el grado de similitud utilizando el coeficiente de similitud de Nei y Li (8), entre el material genético analizado, para luego construir un dendrograma mediante el algoritmo UPGMA por medio del paquete STASTITICA (9).

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

A partir del análisis molecular basado en los 14 cebadores empleados se puso de manifiesto  que  los mismos  generaron 90 bandas  producto de la amplificación (Tabla 2), de las cuales 80 fueron polimórficas para un promedio de 5.7 bandas por cebador. Es de destacar que, casi la totalidad de los cebadores usados, fueron muy informativos, con la excepción del OPA 13, que no detectó polimorfismo entre el material genético estudiado.

Tabla 2. Cantidad de bandas totales y polimórficas detectadas en el ensayo de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y porcentajes de polimorfismo.

Cebador

Secuencia

Total de bandas

Bandas polimórficas

Porcentaje de polimorfismo

OPA 02

TCCCGAGCTG

6

3

50

OPA 03

AGTCAGCCAC

5

4

 80

OPA 12

TCGGCCATAG

4

4

100

OPA 13

CAGCACCCAC

5

0

   0

OPF 01

ACGGATCCTG

9

8

 88

OPF 03

CCTGATCACC

5

5

100

OPF 04

GGTGATCAGG

4

4

100

OPF 05

CCGAATTCCC

5

5

100

OPF 06

CGGAATTCGG

9

9

100

OPF 07

CCGATATCCC

3

3

100

OPF 10

GGAAGCTTGG

8

8

100

OPF 13

GGCTGCAGAA

                 14

                  14

100

OPF 14

TGCTGCAGGT

4

4

100

OPF 15

CCAGTACTCC

9

9

100

El cebador OPA 12 y  todos los cebadores OPF, excepto OPF 01, alcanzaron el 100 % de bandas polimórficas, resultando útiles en la determinación de polimorfismo. Se destacó el cebador OPF 13 por el gran número de bandas generadas, de las cuales el 100% fueron polimórficas. De acuerdo con la literatura consultada, los porcentajes de polimorfismo genético alcanzados en este trabajo son altos, en comparación con los que se han obtenido normalmente en tomate (Lycopersicon esculentum Mill), mediante los marcadores morfoagronómicos y bioquímicos (2, 10), marcadores de RAPD (3, 11) y por medio de otros marcadores moleculares (12, 13, 14).

Con el procedimiento no-jerárquico (K-means) del Análisis de Conglomerados, basado en los índices de similitud, se identificaron al menos 2 grupos de diferente diversidad genética (Figura 1),  estando el primer grupo formado por el genotipo R17-500 y su variedad donante Amalia y el segundo formado por el resto de los genotipos analizados. Este último grupo se dividió a su vez en 3 subgrupos, donde el genotipo R19-500 y su variedad donante INCA-9-1 integraron el primer subgrupo, los genotipos R15-500 y R20-300 formaron el segundo subgrupo y el tercero estuvo compuesto por R16-300 y R4-300.


Figura 1. Dendrograma derivado de las distancias genéticas en el material vegetal  analizado.

Las similitudes encontradas entre R17-500 y  R19-500, y sus respectivas variedades donantes Amalia e INCA-9-1, pudieran deberse a que los cebadores empleados en este estudio conllevan a no esclarecer la situación, al no amplificar otras regiones que acentúan más las diferencias, ya que los marcadores RAPD son dominantes porque sólo se amplifica un producto o variante alélica; aquél que cumple los requisitos de complementariedad entre el cebador y las cadenas de ADN a una distancia ≤ 2 kb (15). Se pudo observar además que los genotipos R15-500 y R20-300 (derivados de Amalia e INCA-9-1, respectivamente), manifestaron un comportamiento similar, aspecto que pudiera relacionarse con lo anteriormente expuesto (15) y/o el origen de ambas variedades donantes (Tabla 1). Sin embargo, los genotipos R15-500, R20-300, R16-300 y R4-300 se diferenciaron molecularmente del resto de los genotipos y de las variedades donantes, por lo que se corroboró que el genotipo R15-500 es radiomutante de la variedad Amalia y R20-300, R16-300 y R4-300 son radiomutantes de la variedad INCA-9-1, comprobándose la efectividad de la selección realizada para la obtención  de dichos genotipos potencialmente productivos en condiciones de bajos suministros de agua.

Se debe significar, que el alto grado de polimorfismo molecular detectado en este trabajo, mediante el empleo de RAPD, corrobora  las diferencias alcanzadas en las evaluaciones morfoagronómicas efectuadas entre los mismos genotipos y las variedades donantes y el resto de los genotipos analizados, bajo condiciones de campo (16,  17), lo que demuestra la importancia de los marcadores RAPD, para detección de variabilidad genética en el cultivo del tomate, resultando los más informativos los cebadores OPA 12, OPF 03, OPF 04, OPF 05, OPF 06, OPF 07, OPF 10, OPF 13, OPF 14 y OPF 15, los cuales se podrían ser utilizados para la selección de caracteres agronómicos e identificar variaciones en la secuencia del ADN entre individuos. Estos resultados ponen de manifiesto la efectividad de los rayos gamma 60Co para generar variabilidad genética, comportamientos  similares se han obtenido en el cultivo del arroz (18, 19) y en Musa spp (20).  El uso directo de mutaciones ha sido de gran valor para los cultivadores de planta, particularmente cuando se desea mejorar algunas características específicas a fin de extender la vida agrícola de buenas variedades (21). Varias variedades derivadas de la utilización directa de mutaciones inducidas en trigo, cebada, arroz, fríjol, caña de azúcar, etc., han demostrado que características tales como talla baja, precocidad, resistencia a ciertas enfermedades, tolerancia a la salinidad y calidad, ser inducidas en las variedades bien adaptadas sin variar significativamente sus demás atributos. En el tomate (Lycopersicon esculentum Mill), se han obtenido somaclones resistentes a distintas enfermedades y se continúa investigando en la selección de plantas que superen al donante en rendimiento y adaptación a diferentes épocas del año (22).

 

CONCLUSIÓN.

Los resultados alcanzados en este trabajo permiten reafirmar el poder de la técnica de  RAPD para el estudio de la diversidad en la secuencia de una población y corroboran la efectividad del uso de rayos gamma 60Co para la inducción de variabilidad genética y de la selección realizada para la obtención de genotipos de tomate con alto potencial productivo en condiciones de bajos suministros de agua.

 

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