D.- Técnicas de Análisis que utilizan una Columna de Inmunoafinidad, seguido de una Determinación por Medio de la Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (HPLC)
Publicado: 17 de noviembre de 2003
Por: Alberto Gimeno
Este es uno de los Capítulos que pertenece al artículo completo titulado: Métodos de Análisis de Micotoxinas en Piensos Compuestos y Materias Primas (Revisión I).
D.0.- ANÁLISIS DE AFLATOXINA B1
Los métodos publicados con los títulos:
1.- Validation of an Analytical Method to Determine the Content of Aflatoxin in Animal Feeding Stuff (68).
2.- Immunoaffinity column cleanup with liquid chromatography using post-column bromination for determination of aflatoxins in peanut butter, pistachio paste, fig paste, and paprika powder:collaborative study (69).
han sido aplicados para el control de aflatoxina B1 en cereales y sus subproductos, alimentos compuestos para aves, cerdos y rumiantes, con muy buenos resultados de aplicación.
El uso de la columna de inmunoafinidad previo a la HPLC permite eliminar todo el proceso de purificación del extracto, utilizado en la Técnica Oficial de la Comunidad Europea (CE) para el Análisis de la Aflatoxina B1. De esta forma la rapidez del análisis es substancialmente mejorada con el uso de la susodicha columna.
El método consiste fundamentalmente en:
La aflatoxina B1 de la muestra es extraida con una solución de acetona/agua (85+15). El extracto es filtrado y diluido con agua o con solución salina de buffer fosfato (pH 7,4). Una alícuota de la disolución anterior es introducida en la columna de inmunoafinidad que contiene un anticuerpo monoclonal especifico para la aflatoxina B1. La columna es lavada con agua y posteriormente la aflatoxina B1 es extraída con metanol y cuantificada por medio de la cromatografía de líquidos de alta resolución utilizando una columna de fase reversa y una post columna de derivatización (PBPB) y detector de fluorescencia.
El limite de cuantificación del método resulta ser mejor que 0,5 microgramos de aflatoxina B1 /Kg.
D.1.- ANALISIS DE LA AFLATOXINA M1
Todos sabemos la base de las columnas de inmunoafinidad, que consiste en una columna que contiene anticuerpos específicos (fijados a un soporte solido) contra una determinada micotoxina en cuestión. Cuando la micotoxina pasa a través de la zona de anticuerpos específicos, ésta es retenida por el anticuerpo en la columna.
Después, la columna es lavada con agua o solución de lavado adecuada para eliminar las impurezas.
Pasando después por la columna una solución de elución acecuada, la micotoxina se liberta del anticuerpo y puede ser extraída.
Esta solución con la micotoxina en cuestión, puede ser preparada adecuadamente para medir la concentración por medio de la Cromatografia de Líquidos de Alta Resolución (HPLC), con detector de fluorescencia.
La técnica con la que tenemos experiencia y que nos a dado hasta ahora buenos resultados, está publicada en (53,54,55), con el titulo:
MILK AND MILK POWDER - DETERMINATION OF AFLATOXIN M1 CONTENT: CLEAN-UP BY IMMUNOAFFINITY CHROMATOGRAPHY AND DETERMINATION BY HPLC.
Este es el titulo de la publicación (54), los títulos de las publicaciones (53,55) difieren un poco, pero vienen a ser lo mismo.
El campo de aplicación de la técnica abarca: leche entera, leche semidescremada y descremada, leche sea cruda o pasterizada y leche en polvo entera, semidescremada y descremada.
La técnica se basa en lo siguiente:
1.- Después de un calentamiento previo de la muestra a 35-37ºC o bien una centrifugación durante 15 minutos, la aflatoxina M1 es extractada de la muestra de leche (caso de ser en polvo, tiene que ser preparada previamente para convertirla en liquida) pasando la muestra a través de una columna de immunoafinidad.
La columna de inmunoafinidad utilizada contiene una suspensión gel de anticuerpos monoclonales específicos (anti-aflatoxina M1) fijados por covalencia a un soporte sólido.
Cuando la muestra pasa a través de la columna, los anticuerpos específicos contra la aflatoxina M1, retienen la micotoxina y se forma un complejo anticuerpo-antigeno.
2.- La columna es lavada con agua para eliminar impurezas.
3.- La aflatoxina M1 es liberada del anticuerpo y eluida de la columna con acetonitrilo.
4.- El volumen de la solución es reducido a 300-500 microlitros, a 30ºC y con corriente de nitrógeno (no evaporar nunca a sequedad ya que se corre el peligro de perder aflatoxina M1).
5.- Diluir a 5ml con agua destilada.
6.- Proceder después al análisis por cromatografia de líquidos de alta resolución (HPLC) en columna de fase reversa C18 y paralelamente con una solución patrón de aflatoxina M1. En las dos cromatografias (patrón y problema), inyectar aliquotas de 500 microlitros de solución patrón y 500 microlitros de solución problema.
7.- La fase móvil consiste en una solución de acetonitrilo en agua al 25% (v/v).
8.- La detección se realiza por fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 360 nm y de emisión de 435 nm.
9.- Comparar el cromatograma del patrón de aflatoxina M1 y de la muestra problema (tiempos de retención y demás).
10.- En caso de contaminación con aflatoxina, calcular como habitualmente en HPLC (medida del área de los picos y demás)
11.- La concentración mínima detectable para la leche liquida se sitúa en 0,005 microgramos/litro y para la leche en polvo en 0,05 microgramos/Kg
12.- Cada vez más están a ser muy difundidas y perfecionadas las técnicas de analisis de micotoxinas que utilizan previamente las columnas de inmunoafinidad (56).
NOTAS:
Atender bien a todas las observaciones efectuadas en las publicaciones (53-55), en especial:
a.- La forma y el proceso de lavado del material de vidrio ya que el uso de material de vidrio que no se haya lavado con ácido puede provocar perdida de aflatoxina en las soluciones acuosas de esta.
b.- En los análisis de micotoxinas, debe ser evitada la luz natural y luz solar directa, es aconsejable trabajar con luz de fluorescente.
c.- Proteger de la luz las soluciones de micotoxina (conservar en la oscuridad y utilizar hojas de papel de aluminio)
d.- Existe un articulo (72) muy interesante sobre el uso de columnas de inmunoafinidad para el análisis de micotoxinas.
D.2.- ANALISIS DE DEOXINIVALENOL O VOMITOXINA UTILIZANDO COLUMNAS DE INMUNOAFINIDAD Y CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS DE ALTA RESOLUCION.
La técnica que da muy buenos resultados está perfectamente descrita en (57) con el titulo de:
Quantification of deoxinivalenol in wheat using an immunoaffinity column and liquid chromatography (57).
A pesar de la técnica estar referida a trigo, hemos obtenido buenos resultados en maíz, cebada, subproductos de trigo y de maíz, piensos para cerdos y rumiantes. No tenemos experiencia sobre la aplicación de la técnica en otros productos para alimentación animal.
El método se basa esencialmente en lo siguiente:
1.- Extracción de 50 g de muestra con 200 ml de agua destilada (previa adición de un ayudante de filtración) por agitación especial muy intensa durante 1 minuto.
2.- Filtración del extracto y recogida de una parte alícuota correspondiente a 1 ml.
3.- Paso de esta parte alícuota a través de una columna de inmunoafinidad especifica para deoxinivalenol (la micotoxina es retenida en la columna por el anticuerpo monoclonal).
4.- Lavado de la columna con 5 ml de agua destilada y elución posterior de la micotoxina con 1ml de metanol.
5.- Evaporación del eluido hasta casi sequedad y redisolución del mismo con 300 ml de acetonitrilo+agua (10+90).
6.- Inyección de 50 microlitros en el sistema de HPLC (con columna de fase reversa C18) con un detector de fluorescencia a 218 nm.
7.- Detección y cuantificación como habitual en HPLC.
Las recuperaciones oscilan entre 75 y 100% con una media del orden del 90%.
La concentración mínima detectable esta situada en los 100 microgramos/Kg.
NOTAS:
a.- Podemos decir que en cuanto a recuperaciones y concentración mínima detectable, no hay diferencias entre esta técnica y la de cromatografía en capa fina. Sin embargo con esta técnica existe una mayor seguridad en cuanto a la especificidad del método gracias a la columna de inmunoafinidad para deoxinivalenol.
b.- En la técnica original completa esta descrito un procedimiento para determinar la especificidad del anticuerpo monoclonal.
D.3.- METODO RAPIDO PARA LA DETERMINACION DE ZEARALENONA EN MAIZ UTILIZANDO COLUMNAS DE INMUNOAFINIDAD, FLUORIMETRIA Y CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS DE ALTA RESOLUCION.
La técnica que da muy buenos resultados está perfectamente descrita en (58) con el titulo de:
RAPID IMMUNOAFFINITY- BASED METHOD FOR DETERMINATION OF ZEARALENONE IN CORN BY FLUOROMETRIC AND LIQUID CHROMATOGRAPHY (58).
A pesar de la técnica estar referida a maíz, hemos obtenido buenos resultados en trigo, cebada, subproductos de trigo y de maíz, piensos para cerdos. No tenemos experiencia sobre la aplicación de la técnica en otros productos para alimentación animal.
El método se basa esencialmente en lo siguiente:
1.- Extracción de 20 g de muestra con 50 ml de una mezcla de acetonitrilo+agua (90+10) (previa adición de 2 g de cloruro sodico) por agitación especial muy intensa durante 2 minutos.
2.- Filtración del extracto, recogida de un volumen alícuota de 10 ml y dilución de ese volumen con 40 ml de una solución fosfato-buffer salina.
3.- Filtración de esa dilución y recogida de una alícuota de 10 ml para pasar a través de la columna de inmunoafinidad especifica para zearalenona (la micotoxina es retenida en la columna por el anticuerpo monoclonal).
4.- Lavado de la columna con 10 ml de la solución fosfato-buffer salina y después con 10 ml de agua destilada.
5.- Elución de la zearalenona con 1 ml de metanol.
6.- Tratamiento del eluido con 1 ml de una solución de cloruro de aluminio hexahidrato
6.- Determinación posterior con fluorimetro, 300 segundos después del tratamiento anterior y siguiendo las indicaciones expuestas en la técnica (57).
7.- Si la determinación posterior se quiere hacer utilizando la cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), hay que hacer las siguientes modificaciones:
a.- Después de filtrar el extracto indicado en 2 anterior, el volumen alícuota recogido debe ser de 1 ml.
b.- Este volumen de 1 ml se diluye con 49 ml de agua destilada.
c.- Continuar como en 3 anterior.
d.- Lavar la columna con 10 ml de agua destilada.
e.- Eluir la zearalenona con 1 ml de metanol.
f.- Añadir al eluido, 1 ml de agua destilada.
g.- Inyectar en el sistema de HPLC (con columna de fase reversa C18), 100-200 microlitros de la disolución anterior.
i.- Analizar y cuantificar por los sistemas de HPLC con un detector de fluorescencia donde la longitud de onda de excitación será de 274 nm y la de emisión será de 440 nm o bien con un detector de absorbancia donde la longitud de onda de absorción será de 236 nm.
La media de recuperaciones es de 100-105% (determinación por fluorimetria) y de 90-95% (determinación por HPLC).
La concentración mínima detectable oscila entre 50 y 100 microgramos/Kg. Variando las diluciones se pueden obtener concentraciones mínimas detectables más bajas del orden de 5-10 microgramos/Kg.
D.4.- METODO DE ANÁLISIS PARA LA DETERMINACIÓN DE OCRATOXINA A EN CEBADA UTILIZANDO COLUMNA DE INMUNOAFINIDAD Y CROMATOGRAFÍA DE LIQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN. ESTUDIO COLABORATIVO
La técnica que da muy buenos resultados está perfectamente descrita en (59) con el titulo de:
LIQUID CHROMATOGRAPHIC METHOD WITH IMMUNOAFFINITY COLUMN CLEANUP FOR DETERMINATION OF OCHRATOXIN A IN BARLEY: COLLABORATIVE STUDY (81).
A pesar de la técnica estar referida a cebada, hemos obtenido buenos resultados aplicándola también a maíz, trigo y alimentos compuestos para cerdos. No tenemos experiencia de su aplicación en otras materias primas y alimentos compuestos.
De una forma muy breve diremos que el método se basa esencialmente en una extracción de 25 g de la muestra con 100 ml de acetonitrilo + agua (6+4) por agitación especial muy intensa durante 3 minutos
Después de filtrar el extracto se toma una parte alícuota y se pasa por una columna de inmunoafinidad con anticuerpo monoclonal especifico de la ocratoxina A.
La columna es lavada con agua y la ocratoxina A es eluida con metanol.
Después de evaporar y redisolver el extracto, la ocratoxina A es identificada utilizando la cromatografía de líquidos de alta resolución. La cuantificación se efectúa por fluorescencia.
La concentración minima detectable se situa en 5 microgramos/Kg y la recuperación es del orden del 93%.
Para ver el Artículo completo, click aquí
D.0.- ANÁLISIS DE AFLATOXINA B1
Los métodos publicados con los títulos:
1.- Validation of an Analytical Method to Determine the Content of Aflatoxin in Animal Feeding Stuff (68).
2.- Immunoaffinity column cleanup with liquid chromatography using post-column bromination for determination of aflatoxins in peanut butter, pistachio paste, fig paste, and paprika powder:collaborative study (69).
han sido aplicados para el control de aflatoxina B1 en cereales y sus subproductos, alimentos compuestos para aves, cerdos y rumiantes, con muy buenos resultados de aplicación.
El uso de la columna de inmunoafinidad previo a la HPLC permite eliminar todo el proceso de purificación del extracto, utilizado en la Técnica Oficial de la Comunidad Europea (CE) para el Análisis de la Aflatoxina B1. De esta forma la rapidez del análisis es substancialmente mejorada con el uso de la susodicha columna.
El método consiste fundamentalmente en:
La aflatoxina B1 de la muestra es extraida con una solución de acetona/agua (85+15). El extracto es filtrado y diluido con agua o con solución salina de buffer fosfato (pH 7,4). Una alícuota de la disolución anterior es introducida en la columna de inmunoafinidad que contiene un anticuerpo monoclonal especifico para la aflatoxina B1. La columna es lavada con agua y posteriormente la aflatoxina B1 es extraída con metanol y cuantificada por medio de la cromatografía de líquidos de alta resolución utilizando una columna de fase reversa y una post columna de derivatización (PBPB) y detector de fluorescencia.
El limite de cuantificación del método resulta ser mejor que 0,5 microgramos de aflatoxina B1 /Kg.
D.1.- ANALISIS DE LA AFLATOXINA M1
Todos sabemos la base de las columnas de inmunoafinidad, que consiste en una columna que contiene anticuerpos específicos (fijados a un soporte solido) contra una determinada micotoxina en cuestión. Cuando la micotoxina pasa a través de la zona de anticuerpos específicos, ésta es retenida por el anticuerpo en la columna.
Después, la columna es lavada con agua o solución de lavado adecuada para eliminar las impurezas.
Pasando después por la columna una solución de elución acecuada, la micotoxina se liberta del anticuerpo y puede ser extraída.
Esta solución con la micotoxina en cuestión, puede ser preparada adecuadamente para medir la concentración por medio de la Cromatografia de Líquidos de Alta Resolución (HPLC), con detector de fluorescencia.
La técnica con la que tenemos experiencia y que nos a dado hasta ahora buenos resultados, está publicada en (53,54,55), con el titulo:
MILK AND MILK POWDER - DETERMINATION OF AFLATOXIN M1 CONTENT: CLEAN-UP BY IMMUNOAFFINITY CHROMATOGRAPHY AND DETERMINATION BY HPLC.
Este es el titulo de la publicación (54), los títulos de las publicaciones (53,55) difieren un poco, pero vienen a ser lo mismo.
El campo de aplicación de la técnica abarca: leche entera, leche semidescremada y descremada, leche sea cruda o pasterizada y leche en polvo entera, semidescremada y descremada.
La técnica se basa en lo siguiente:
1.- Después de un calentamiento previo de la muestra a 35-37ºC o bien una centrifugación durante 15 minutos, la aflatoxina M1 es extractada de la muestra de leche (caso de ser en polvo, tiene que ser preparada previamente para convertirla en liquida) pasando la muestra a través de una columna de immunoafinidad.
La columna de inmunoafinidad utilizada contiene una suspensión gel de anticuerpos monoclonales específicos (anti-aflatoxina M1) fijados por covalencia a un soporte sólido.
Cuando la muestra pasa a través de la columna, los anticuerpos específicos contra la aflatoxina M1, retienen la micotoxina y se forma un complejo anticuerpo-antigeno.
2.- La columna es lavada con agua para eliminar impurezas.
3.- La aflatoxina M1 es liberada del anticuerpo y eluida de la columna con acetonitrilo.
4.- El volumen de la solución es reducido a 300-500 microlitros, a 30ºC y con corriente de nitrógeno (no evaporar nunca a sequedad ya que se corre el peligro de perder aflatoxina M1).
5.- Diluir a 5ml con agua destilada.
6.- Proceder después al análisis por cromatografia de líquidos de alta resolución (HPLC) en columna de fase reversa C18 y paralelamente con una solución patrón de aflatoxina M1. En las dos cromatografias (patrón y problema), inyectar aliquotas de 500 microlitros de solución patrón y 500 microlitros de solución problema.
7.- La fase móvil consiste en una solución de acetonitrilo en agua al 25% (v/v).
8.- La detección se realiza por fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 360 nm y de emisión de 435 nm.
9.- Comparar el cromatograma del patrón de aflatoxina M1 y de la muestra problema (tiempos de retención y demás).
10.- En caso de contaminación con aflatoxina, calcular como habitualmente en HPLC (medida del área de los picos y demás)
11.- La concentración mínima detectable para la leche liquida se sitúa en 0,005 microgramos/litro y para la leche en polvo en 0,05 microgramos/Kg
12.- Cada vez más están a ser muy difundidas y perfecionadas las técnicas de analisis de micotoxinas que utilizan previamente las columnas de inmunoafinidad (56).
NOTAS:
Atender bien a todas las observaciones efectuadas en las publicaciones (53-55), en especial:
a.- La forma y el proceso de lavado del material de vidrio ya que el uso de material de vidrio que no se haya lavado con ácido puede provocar perdida de aflatoxina en las soluciones acuosas de esta.
b.- En los análisis de micotoxinas, debe ser evitada la luz natural y luz solar directa, es aconsejable trabajar con luz de fluorescente.
c.- Proteger de la luz las soluciones de micotoxina (conservar en la oscuridad y utilizar hojas de papel de aluminio)
d.- Existe un articulo (72) muy interesante sobre el uso de columnas de inmunoafinidad para el análisis de micotoxinas.
D.2.- ANALISIS DE DEOXINIVALENOL O VOMITOXINA UTILIZANDO COLUMNAS DE INMUNOAFINIDAD Y CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS DE ALTA RESOLUCION.
La técnica que da muy buenos resultados está perfectamente descrita en (57) con el titulo de:
Quantification of deoxinivalenol in wheat using an immunoaffinity column and liquid chromatography (57).
A pesar de la técnica estar referida a trigo, hemos obtenido buenos resultados en maíz, cebada, subproductos de trigo y de maíz, piensos para cerdos y rumiantes. No tenemos experiencia sobre la aplicación de la técnica en otros productos para alimentación animal.
El método se basa esencialmente en lo siguiente:
1.- Extracción de 50 g de muestra con 200 ml de agua destilada (previa adición de un ayudante de filtración) por agitación especial muy intensa durante 1 minuto.
2.- Filtración del extracto y recogida de una parte alícuota correspondiente a 1 ml.
3.- Paso de esta parte alícuota a través de una columna de inmunoafinidad especifica para deoxinivalenol (la micotoxina es retenida en la columna por el anticuerpo monoclonal).
4.- Lavado de la columna con 5 ml de agua destilada y elución posterior de la micotoxina con 1ml de metanol.
5.- Evaporación del eluido hasta casi sequedad y redisolución del mismo con 300 ml de acetonitrilo+agua (10+90).
6.- Inyección de 50 microlitros en el sistema de HPLC (con columna de fase reversa C18) con un detector de fluorescencia a 218 nm.
7.- Detección y cuantificación como habitual en HPLC.
Las recuperaciones oscilan entre 75 y 100% con una media del orden del 90%.
La concentración mínima detectable esta situada en los 100 microgramos/Kg.
NOTAS:
a.- Podemos decir que en cuanto a recuperaciones y concentración mínima detectable, no hay diferencias entre esta técnica y la de cromatografía en capa fina. Sin embargo con esta técnica existe una mayor seguridad en cuanto a la especificidad del método gracias a la columna de inmunoafinidad para deoxinivalenol.
b.- En la técnica original completa esta descrito un procedimiento para determinar la especificidad del anticuerpo monoclonal.
D.3.- METODO RAPIDO PARA LA DETERMINACION DE ZEARALENONA EN MAIZ UTILIZANDO COLUMNAS DE INMUNOAFINIDAD, FLUORIMETRIA Y CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS DE ALTA RESOLUCION.
La técnica que da muy buenos resultados está perfectamente descrita en (58) con el titulo de:
RAPID IMMUNOAFFINITY- BASED METHOD FOR DETERMINATION OF ZEARALENONE IN CORN BY FLUOROMETRIC AND LIQUID CHROMATOGRAPHY (58).
A pesar de la técnica estar referida a maíz, hemos obtenido buenos resultados en trigo, cebada, subproductos de trigo y de maíz, piensos para cerdos. No tenemos experiencia sobre la aplicación de la técnica en otros productos para alimentación animal.
El método se basa esencialmente en lo siguiente:
1.- Extracción de 20 g de muestra con 50 ml de una mezcla de acetonitrilo+agua (90+10) (previa adición de 2 g de cloruro sodico) por agitación especial muy intensa durante 2 minutos.
2.- Filtración del extracto, recogida de un volumen alícuota de 10 ml y dilución de ese volumen con 40 ml de una solución fosfato-buffer salina.
3.- Filtración de esa dilución y recogida de una alícuota de 10 ml para pasar a través de la columna de inmunoafinidad especifica para zearalenona (la micotoxina es retenida en la columna por el anticuerpo monoclonal).
4.- Lavado de la columna con 10 ml de la solución fosfato-buffer salina y después con 10 ml de agua destilada.
5.- Elución de la zearalenona con 1 ml de metanol.
6.- Tratamiento del eluido con 1 ml de una solución de cloruro de aluminio hexahidrato
6.- Determinación posterior con fluorimetro, 300 segundos después del tratamiento anterior y siguiendo las indicaciones expuestas en la técnica (57).
7.- Si la determinación posterior se quiere hacer utilizando la cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), hay que hacer las siguientes modificaciones:
a.- Después de filtrar el extracto indicado en 2 anterior, el volumen alícuota recogido debe ser de 1 ml.
b.- Este volumen de 1 ml se diluye con 49 ml de agua destilada.
c.- Continuar como en 3 anterior.
d.- Lavar la columna con 10 ml de agua destilada.
e.- Eluir la zearalenona con 1 ml de metanol.
f.- Añadir al eluido, 1 ml de agua destilada.
g.- Inyectar en el sistema de HPLC (con columna de fase reversa C18), 100-200 microlitros de la disolución anterior.
i.- Analizar y cuantificar por los sistemas de HPLC con un detector de fluorescencia donde la longitud de onda de excitación será de 274 nm y la de emisión será de 440 nm o bien con un detector de absorbancia donde la longitud de onda de absorción será de 236 nm.
La media de recuperaciones es de 100-105% (determinación por fluorimetria) y de 90-95% (determinación por HPLC).
La concentración mínima detectable oscila entre 50 y 100 microgramos/Kg. Variando las diluciones se pueden obtener concentraciones mínimas detectables más bajas del orden de 5-10 microgramos/Kg.
D.4.- METODO DE ANÁLISIS PARA LA DETERMINACIÓN DE OCRATOXINA A EN CEBADA UTILIZANDO COLUMNA DE INMUNOAFINIDAD Y CROMATOGRAFÍA DE LIQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN. ESTUDIO COLABORATIVO
La técnica que da muy buenos resultados está perfectamente descrita en (59) con el titulo de:
LIQUID CHROMATOGRAPHIC METHOD WITH IMMUNOAFFINITY COLUMN CLEANUP FOR DETERMINATION OF OCHRATOXIN A IN BARLEY: COLLABORATIVE STUDY (81).
A pesar de la técnica estar referida a cebada, hemos obtenido buenos resultados aplicándola también a maíz, trigo y alimentos compuestos para cerdos. No tenemos experiencia de su aplicación en otras materias primas y alimentos compuestos.
De una forma muy breve diremos que el método se basa esencialmente en una extracción de 25 g de la muestra con 100 ml de acetonitrilo + agua (6+4) por agitación especial muy intensa durante 3 minutos
Después de filtrar el extracto se toma una parte alícuota y se pasa por una columna de inmunoafinidad con anticuerpo monoclonal especifico de la ocratoxina A.
La columna es lavada con agua y la ocratoxina A es eluida con metanol.
Después de evaporar y redisolver el extracto, la ocratoxina A es identificada utilizando la cromatografía de líquidos de alta resolución. La cuantificación se efectúa por fluorescencia.
La concentración minima detectable se situa en 5 microgramos/Kg y la recuperación es del orden del 93%.
Para ver el Artículo completo, click aquí
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