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Factores que influyen en la congelación del semen de toros

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Resumen

La fertilidad de los reproductores destinados a un programa de inseminación artificial (IA) condiciona la producción de carne o leche, y su incidencia sobre la rentabilidad de los rodeos se acentúa cuando la situación económica del sector agropecuario decrece. Numerosos factores intervienen en los resultados de una IA. Los factores ligados a el manejo y a la hembra parecieran ser los más importantes, sin embargo aquellos relacionados con el macho no deben dejarse de lado ya que los mismos pueden ser eventualmente manejados por los CIA. El objetivo de este artículo es analizar los factores de variación de la congelabilidad y de la fertilidad de los toros de IA relacionados con el toro, eyaculado, edad, estación del año, familia, número de espermatozoides por dosis de IA y precio de la dosis de semen, y presentar las eventuales dificultades ligadas a la correlación entre la evaluación in vitro del poder fecundante del semen de toro y su fertilidad real.

Introducción

Muchos trabajos de investigación científica han demostrado que en sistemas de producción de carne la fertilidad es el factor más importante desde el punto de vista económico. La crianza de toros es una industria mundial multimillonaria y hemos constatado en varias ocasiones que ganaderos o centros de inseminación artificial dan prioridad en la selección a la conformación y el tipo dejando a un segundo plano la eficacia reproductiva y la congelabilidad.

Los criadores frecuentemente solicitan evaluaciones reproductivas rutinarias de sus machos (examen andrológico) para confirmar su fertilidad antes de una compra ó de una venta, para controlar su producción espermática diaria (PED) especialmente en reproductores de alto costo, para valorar el potencial reproductor como donante de semen para inseminación artificial (IA) con semen congelado ó refrigerado, ó para una orientación en problemas de infertilidad aparente y/o anormalidades testiculares. Tales evaluaciones reproductivas dependen de que se logre recolectar el semen apropiadamente y sobretodo de una precisa valoración del mismo.

La falta de éxito reproductivo frecuentemente se debe a más de un factor. Por lo tanto una evaluación de aptitud reproductiva (EAR), incluirá una prueba de libido o de capacidad de servicio, un examen de los genitales externos, una medición testicular, una palpación testicular y de los genitales internos, una evaluación seminal, así como ecografía de testículos y vesículas seminales y próstata en algunos casos. Las pruebas para determinar enfermedades de transmisión sexual, especialmente brucelosis, Paratuberculosis, IBR, etc., son parte crucial de la EAR.

Cuando se discute de examen andrológico en toros, el criterio congelabilidad es poco citado. Sin embargo en las condiciones actuales de cría de ganado, el semen congelado es el único que permite la difusión del material genético en condiciones prácticas.

La incorporación de un toro en un centro de inseminación artificial (CIA) se realiza fundamentalmente en función de su valor genético, considerando su ascendencia (pedigrí), sus características de performance individual y su descendencia (progenie). La fertilidad de este reproductor, condición sine qua non para valorizar este potencial genético, es evaluada o mejor dicho estimada a nivel del CIA por medio de un examen clínico completo y por la apreciación de la calidad del semen producido. La fertilidad o poder fecundante de un reproductor no se puede estimar en forma directa; solamente es verificada una proporción limitada de funciones del animal o de sus gametos. La apreciación que realizamos es parcial, ya que su valor predictivo negativo es elevado, pero su valor predictivo positivo es bajo. Como regla general son retenidos los toritos jóvenes que presentan una buena circunferencia escrotal (CE), una concentración espermática elevada, una buena motilidad antes y después de la congelación y pocas anomalías espermáticas. La concentración se encuentra correlacionada favorablemente con la motilidad en masa e individual (+0,4 a +0,9) y el porcentaje de anomalías totales está ligado negativamente a la motilidad y a la concentración (Dumont 1998). En el toro joven también son observadas correlaciones altas entre la CE y los parámetros cuantitativos del eyaculado (concentración y número total de espermatozoides) (Coulter y col. 1987, Thibier y col 1972). Los parámetros de viabilidad espermática generalmente evaluados en un CIA son la motilidad, la integridad de la membrana y del acrosoma. Los mismos son extremadamente sensibles al enfriado entre 2-8 C así como a la congelación. Esta congelabilidad del semen bovino solo puede evaluarse gracias a la práctica de la congelación en si y pocas son las pruebas que un veterinario puede realizar para conocer este parámetro. Una correlación interesante fue publicada recientemente (Evans y col. 2005), relacionando el modelo de inserción de los pelos de la parte frontal de la cabeza de los toros con el porcentaje de anomalías morfológicas de los espermatozoides en el eyaculado. Los toros con una inserción espiral de los pelos del área frontal de la cabeza presentaron significativamente menos anomalías morfológicas en el eyaculado que aquellos que no la presentaban.

Algunos países (Francia por ej.) emplean un test de control de la función sexual en toritos jóvenes durante la última fase de la selección individual antes de ingresar el animal en un centro de producción de semen. La finalidad de este test es la de evitar de ingresar en test de progenie animales improductivos o de baja producción y congelabilidad de semen o sea que el mismo contribuye a rentabilizar la inversión realizada (selección del torito por pedigrí y por características individuales) y a realizar. Este test consiste en la evaluación de 5 colectas dobles (10 eyaculados, siendo los dos primeros eliminados). Los parámetros seminales evaluados son: el volumen, la concentración, la motilidad de masa, una evaluación de la presencia de leucocitos, la motilidad individual, el porcentaje de anomalías y la motilidad a la post descongelación inmediata. En regla general 15-20 % de los toritos son eliminados por este único test.

La fertilidad de los reproductores destinados a un programa de inseminación artificial (IA) condiciona la producción de carne o leche, y su incidencia sobre la rentabilidad de los rodeos se acentúa cuando la situación económica del sector agropecuario de un país decrece.

La fertilidad de un toro utilizado en IA es corrientemente evaluada directamente por medio de la "tasa de no retorno" (TNR) o indirectamente estudiando una de sus componentes: la calidad del semen. La relación calidad del semen/fertilidad fue ampliamente estudiada, sin embargo dos factores influencian los resultados obtenidos de estas investigaciones: a) El factor "eyaculado": El estudio de la relación entre los resultados de inseminación y las características del semen utilizado solo debería hacerse por eyaculado. Esta información solo estará disponible cuando pueda identificarse y registrar las pajuelas después de usado por intermedio del sistema del código de barras, b) El factor "medio ambiente": las condiciones de manejo influencia enormemente los resultados de campo y deben tomarse en cuenta a los efectos de poder presentar conclusiones validas.

La TNR corresponde a la proporción de vacas o vaquillonas inseminadas que no son detectadas nuevamente en celo en un período de tiempo preestablecido: 28, 56, o 90 días. La TNR calculada sobre un período corto (28 días) puede estar influenciada por numerosos factores como: los aspectos de manejo del rodeo (detección de celo, decisión del ganadero con respecto al intervalo parto-IA), la fertilidad intrínseca de los reproductores (machos y hembras) y la mortalidad embrionaria precoz (Humblot 1986). La TNR calculada sobre un período mayor, 56 o 90 días, está a su vez influenciada por la mortalidad embrionaria tardía.

Hemos constatado desde hace un par de años una disminución de la TNR en diferentes países. La tendencia actual en Francia es de 0,5 puntos porcentuales /año.

Numerosos factores intervienen en los resultados obtenidos (fertilidad) después de realizar una IA. Los factores ligados al manejo y a la hembra son los más importantes para la fertilidad del rodeo y han sido objeto de numerosas publicaciones. Sin embargo los factores ligados al macho no deben dejarse de lado ya que los mismos pueden ser eventualmente manejados por un CIA.

La siguiente revisión está basada esencialmente en la experiencia clínica, y de investigación del autor, así como en revisiones bibliográficas publicadas y el objetivo de la misma es de analizar los factores de variación que influencian la congelabilidad y la fertilidad de los toros de IA.

 

Componentes de la fertilidad

La fecundación o concepción en una IA es el resultado del depósito de los gametos masculinos en el interior del tracto genital de la hembra por medio de un vector humano. El porcentaje de concepción, que podemos llamar corrientemente fertilidad, depende por lo tanto de un componente macho, de un componente hembra y de un componente inseminador.

Los modelos de análisis de los datos de fertilidad de las vacas y vaquillonas permiten observar de forma precisa los efectos de los diferentes factores ligados a la hembra (número de partos, intervalo parto-IA, rodeo) y a la inseminación (CIA, inseminador, mes, día de la semana). La importancia de esos factores no será tratada aquí.

En lo que respecta al componente macho, si bien el efecto "toro" es fácilmente medible, el mismo incluye el poder fecundante del semen eyaculado y la técnica de procesamiento del semen (diluyente, protocolo de dilución, técnica de enfriamiento del semen diluido, congelación, descongelación).

El interés por esta distinción puede no ser frecuente ya que todo el eyaculado de un toro utilizado en IA es "tratado" de la misma manera y la fertilidad del producto final utilizable es lo que le interesa a los profesionales de los CIA. No obstante, es importante hacer esta diferencia cuando se realizan distintos tratamientos del semen de los toros en un CIA.

El poder fecundante del semen eyaculado así como su calidad "tecnológica" (aptitud para soportar la crioconservación) es fruto de la calidad intrínseca del esperma del toro y del efecto del medio ambiente inmediato (técnica y frecuencia de colecta, estación del año, estrés, enfermedad transitoria). Finalmente la calidad del esperma depende de la interacción de un factor propio del toro (genético) y del efecto "medio ambiente".

Todos estos componentes ligados al macho, a la hembra y al inseminador pueden realizar un efecto "aditivo" sobre la fertilidad final o bien interactuar entre sí. Así por ej. Macmillan y Watson observaron una interacción entre el momento de la IA y el nivel de fertilidad de los toros. La fertilidad de 3 grupos de toros (superiores e inferiores al promedio del CIA) es diferente cuando la IA se realiza al inicio del celo (74,3%, 62,7% y 58,4% p<0,01), sin embargo no hay diferencias cuando la IA se realiza al final del mismo.

 

Estimación de la fertilidad

La fertilidad de los toros es estimada por medio de diferentes parámetros en función de la fertilidad de las vacas y vaquillonas inseminadas con su semen. El diagnóstico de gestación por medio del dosaje de proteínas embrionarias en la sangre, como la PSPB (Humblot 1986), ecografía o palpación rectal permiten establecer el porcentaje de preñez en un rodeo de vacas en un momento dado. Sin embargo, otros métodos son empleados a gran escala gracias a su simplicidad y a su carácter sistemático. Los mismos se basan en el no retorno al celo de la vaca.

Las TNR precoces (24 o 28 días) sobrestiman la fertilidad, ya que aproximadamente sólo el 50% de los retornos al celo son o pueden ser observados en ese momento (Humblot y col 1991).

Por otro lado una TNR tardía disminuye el interés del estimador ya que puede no evidenciar la eventual presencia de un problema. Es por esta razón que Van Doormaal aconseja utilizar 56 días y Foote y Oltenacu recomiendan utilizar 59 días después de la IA como el estimador óptimo. Es interesante recalcar que las TNR 56 o 59 días presentan una correlación alta (del orden del 96%) con la TNR 60/90 o 75 días (Taylor y col.1985) y que a su vez este tipo de TNR es suficientemente precoz para estimar la fertilidad del toro utilizado. La evolución de la TNR a partir de dosis de semen a 25, 60 y 90 días fue motivo de varios trabajos científicos. Recientemente Decuadro-Hansen y col. (Decuadro- Hansen y col. 2000) estudiaron la evolución de la TNR en 6 toros Holstein de testaje de fertilidad desconocida en eyaculado fraccionado y diluidos en dos diluyentes diferentes: Biociphos plus™ (B+) y Bioxcell™ (Bx), en 3 tasas de dilución distintas. Fueron así utilizadas tres tipos de dosis: 1) diluidas en Biociphos plus ™ con 7 millones de espermatozoides totales antes de la congelación; 2) Bioxcell™ con 7 millones de espermatozoides totales antes de la congelación y 3) diluidas con Biociphos plus™ con 20 millones de espermatozoides totales antes de la congelación (grupo control). La evolución de la TNR de 25 a 90 días puede apreciarse en la tabla 1.

Tabla 1. Evolución de la TNR a 25, 60 y 90 días en primo-IA (n)

B+= Biociphos plus; BX= Bioxcell

Es evidente que los factores de variación de la TNR a 25 y 90 días no son los mismos. La variación de la TNR a 90 días está más ligada a las características de la población de hembras utilizada que la TNR a 25 días. Esta última estaría más influenciada por los factores que pueden actuar en el momento de la IA, como el manejo (detección de celo, intervalo parto-IA), las condiciones de inseminación y el factor toro.

En otro orden de cosas Dumont P, comparo las TNR obtenidas a partir de inseminaciones realizadas con semen de 27 toros diferentes y 76 eyaculados diluidos en Bioxcell y Triladyl yema de huevo (split ejaculate) a concentraciones de 8 a 12 millones de espermatozoides por pajuela y no encontró diferencia significativa en materia de TNR (lettre d'Andrologie, n° 8 UNCEIA, en prensa).

El porcentaje de parición se refiere al número de vacas y vaquillonas que fueron inseminadas y que parieron en un período compatible con la duración promedio de la gestación. El cálculo de este estimador supone el registro sistemático de los nacimientos, el cual no es realizado en forma rutinaria en todos los rodeos. Asimismo, esta estimación es demasiado tardía y no puede ser utilizada como instrumento de gestión en un CIA. Por el contrario constituye un parámetro interesante para calcular los índices genéticos de fertilidad (Boichard y coll. 1998).

Todos los estimadores de fertilidad obtenidos a partir de IA clásicas precisan de un número elevado de hembras para ser estadísticamente aceptables. En cada hembra, el resultado de fertilidad (preñez o vacuidad) sigue una ley binomial y su precisión depende del porcentaje observado y no del número de hembras. Así para una fertilidad del 50% observada sobre 100 vacas, el intervalo de confianza al 95% es de ± 10 puntos de porcentaje, mientras que sobre 1.000 hembras es solamente de 3,2 puntos de porcentaje. La base mínima de evaluación de la fertilidad de un toro debería ser por lo menos de 500 IA (Haferstroh y col. 1999).

Otro método de estimación in vivo de la fertilidad que permite reducir costos es la utilización de la heterospermia. La misma consiste en inseminar una mezcla de un número similar de espermatozoides de 2 o más toros, a los efectos de clasificar los mismos en función del número de terneros obtenidos de cada toro. Los terneros obtenidos deben ser identificados fenotípicamente o de lo contrario deben usarse "marcadores genéticos" (ADN). La clasificación de fertilidad obtenida es repetible y en relación a las IA monospérmicas se necesita un número menor de hembras (Beatty y col. 1969). A su vez la utilización de toros poco fértiles no disminuye la tasa de concepción de las hembras y por lo tanto no existen riesgos financieros.

 

Factores que influencian la congelabilidad del eyaculado

El suceso de la crioconservacion depende de interacciones complejas entre la calidad original del eyaculado, el tipo de diluyente empleado, el tipo y velocidad del proceso de congelación – descongelación y del tamaño y tipo de embalaje empleado para el semen.

Los factores pueden clasificarse en:

1. Factores que influencian la capacidad fecundante de un toro

2. Los medidas de manejo y medio ambiente

3. La tecnología de tratamiento del semen

 

1. Factores que influencian la capacidad fecundante de un reproductor

1. a: Influencia de las características de los espermatozoides sobre la fertilidad y la congelabilidad

En razón de la complejidad del proceso de espermatogénesis es fácil imaginarse cómo los cambios que sufren los espermatozoides a nivel del núcleo y de la membrana pueden desencadenar un problema. De esta manera una anomalía del acrosoma, de la cabeza del espermatozoide o de su cola pueden detectarse rápidamente en el torito joven que ingresa en un CIA, lo cual puede determinar su eliminación de la producción de semen.

Por el contrario si la anomalía es menos evidente, como por ejemplo aquellas que alteran la membrana del espermatozoide, el torito puede ingresar en una prueba de progenie y/o utilizarse en IA si la fertilidad no es muy baja.

Las anomalías de los espermatozoides (defectos morfológicos o funcionales) pueden ser clasificadas en "compensables" y "no compensables". Esta clasificación utilizada por Saacke y col. (1994) corresponde a la utilizada por Pace y col. (1981) de "extrínsecas" e "intrínsecas".

Los defectos compensables son todos aquellos cuya presencia disminuye las posibilidades de fecundación, limitando por ejemplo el tránsito de los espermatozoides hacia el oviducto. La disminución de la fertilidad es desencadenada por una disminución del porcentaje de espermatozoides normales en el sitio de la fecundación. El término compensable sugiere que dicho problema puede ser "compensado" por una elevación del número de espermatozoides en la pajuela.

Por el contrario, los defectos no compensables son aquellos cuya presencia no limita el tránsito de los espermatozoides ni la probabilidad de fecundación. En este caso los espermatozoides anormales entran en competición con los normales. En sentido estricto este tipo de defectos no influencian el porcentaje de fecundación pero disminuyen el porcentaje de preñez ya que son responsables de mortalidad embrionaria.

Entre los defectos compensables se encuentran aquellos que alteran la motilidad y la aptitud de los espermatozoides para capacitarse (reacción acrosómica); entre los no compensables están todas las anomalías de la cabeza del espermatozoide, responsables de alteraciones nucleares, como por ejemplo los cráteres o vacuolas.

Sea cual sea la anomalía presente es importante tener un método de trabajo preciso para evaluarlas y disminuir los errores en el CIA. Por lo menos seria necesario: diluir la muestra, inmovilizar los espermatozoides, evaluar un numero de espermatozoides suficientemente importante (mínimo 200 espermatozoides), trabajar en contraste de fases (ideal con contraste interferencial) y un mínimo de x 400 aumentos, y contar con personal entrenado y formado.

Además de la probabilidad que un espermatozoide posee de fecundar un ovocito y de desarrollar el embrión normalmente, debe tenerse en cuenta el tipo de anomalía presente en el semen, la cual indica en qué grado está alterada la espermatogénesis de un toro. Por ejemplo, la presencia de "cabezas sueltas" o espermatozoides decapitados es considerada como una anomalía menos grave que la presencia de la gota proximal. Podemos pensar que un espermatozoide decapitado tiene menos posibilidades de fecundar un ovocito que un espermatozoide que tiene gota proximal. Sin embargo es universalmente admitido que la presencia de gota proximal indica una alteración grave de la espermatogénesis. Por lo tanto debe dársele más importancia a la presencia de un 20% de gota proximal que a un 20% de espermatozoides decapitados en el eyaculado destinado a la congelación. Muchos estudios han investigado el mecanismo por el cual el semen de toro se daña cuando los espermatozoides llegan a 4 C o luego de la congelación. Si bien diferentes partes de los espermatozoides pueden verse afectadas, es la membrana que aparece como una de las principales causas de muerte celular. La rotura de la membrana plasmática está claramente asociada con la pérdida de viabilidad celular, pero una membrana plasmática intacta no siempre indica que la célula sea viable. Los daños que pueden producirse en éstas pueden ser modificaciones en su organización, permeabilidad y composición lipídica. Las membranas espermáticas que pueden verse afectadas por la criopreservación incluyen la membrana plasmática, la membrana externa del acrosoma y las membranas mitocondriales.

En cualquier caso, la criopreservación, cuyo propósito es garantizar la supervivencia del semen, causa daños irreversibles en la membrana plasmática, lo que conlleva la muerte de un gran número de espermatozoides o, en los supervivientes, cambios similares a los observados durante la capacitación espermática, que provoca un acortamiento de su período de vida útil.

La evaluación morfológica de la integridad de la membrana plasmática se realiza usando la óptica de contraste de fases, la óptica de contraste diferencial de interferencia o de Nomarski o las tinciones supravitales, como el verde rápido/eosina o la eosina/azul de anilina, el tripán azul/Giemsa o el amarillo de naftol/eritrosina. También ha sido valioso el examen a través de la microscopía electrónica o de barrido, para determinar aspectos de la integridad espermática. Actualmente, se están utilizando diversas tinciones fluorescentes, las cuales presentan una mayor precisión en el estudio de las características de la membrana plasmática. Así, se ha estado usando ampliamente el diacetato de carboxifluoresceína y el ioduro de propidio, visualizándose con esta técnica los espermatozoides viables de color verde, frente a los muertos que se observan de color rojo anaranjado. La evaluación funcional de la misma puede llevarse a cabo mediante test de resistencia osmótica o Host. Esta prueba se basa en la capacidad del espermatozoide para captar agua en un medio hiposmótico y en que la hinchazón osmótica está asociada con el enrollamiento de la cola del espermatozoide, que se desenrolla cuando la célula es devuelta a un medio isosmótico. Para que esta respuesta se produzca, la membrana plasmática del espermatozoide debe estar íntegra y con los mecanismos de intercambio de fluidos funcionando correctamente. La entrada de agua provoca en estas células un hinchamiento y enrollamiento del flagelo. Las células con la membrana física o funcionalmente dañada no experimentan cambios en la forma del flagelo. Los valores obtenidos en esta prueba se correlacionan con otros parámetros de calidad seminal, como la motilidad, la viabilidad o la morfología.

 

1.b Efecto toro

La evidencia de la existencia de un efecto toro sobre la fertilidad de las vacas es corrientemente mencionada en la literatura (Everett y col. 1986, Humblot y col. 1991). Este efecto se manifiesta precozmente después de la IA, y la clasificación no varía enormemente cuando se estudian las TNR a 24 o a 90 días (Humblot 1986). Existe una correlación de 0,90 entre la TNR 28 y 56 (Reurink y col. 1990) y de 0,96 entre la TNR 56 y la TNR 60/90 días (VanDoormaal 1998).

La amplitud de esta variación entre toros es elevada cuando se consideran las IA destinadas a la prueba de progenie, ya que se observaron hasta 42 puntos porcentuales de diferencia en parición para una muestra de 913 toros Holstein utilizados con 300 a 700 IA (2). Los valores extremos son raros ya que para esta muestra de toros expresando la fertilidad de los mismos con respecto a su raza, 26 toros fueron estrictamente inferiores a –10, y 11 toros fueron estrictamente superiores a +6. La amplitud de estos resultados fue del orden de 3,9%, próxima a la observada por Everett y Bean (1986) sobre una muestra de 4.500 toros.

Sin embargo, cuando se consideran los toros de servicio, o sea aquellos testeados que representan el 85% de las IA realizadas, las fluctuaciones son mucho más limitadas. En Francia, sobre 75 toros Holstein, Montbélaird y Normandos (+ de 20.000 IA cada uno entre los años 1996 y 1998), el porcentaje de parición expresado con respecto a un promedio varió de –8 a +4. De la misma manera, sobre los 20 toros más utilizados en Holanda, la TNR 56 varió de –5 a +2 (29). Esta amplitud menor de la TNR, se explica por el refugo de los toros de testaje de baja fertilidad y por el número elevado de IA realizadas lo cual mejora la precisión.

 

1.c Efecto eyaculado

Frecuentemente se observa en los CIA que la calidad de un eyaculado no es constante y que en determinadas ocasiones los mismos presentan una motilidad inferior o un porcentaje de anomalías mayor. Es probable que la capacidad fecundante de tal eyaculado sea baja, lo que en realidad no se sabe ya que es eliminado por el CIA. Esta práctica contribuye a uniformar la calidad de los eyaculados de un toro e indirectamente reduce la variación entre toros.

A los efectos de obtener semen de alta calidad a la descongelación, es necesario obtener semen puro de alta calidad lo cual esta influenciado por :

  • La preparación sexual antes de la colecta
  • El trabajo con los toros en sala de monta
  • El ritmo de colecta
  • La alimentación
  • La ausencia de patología locomotoras o de pene y prepucio
  • La temperatura
  • El toro en si………….
  • La diferencia entre el primer y el segundo:

Existen, algunas diferencias entre el primer y segundo eyaculado colectado en un toro en una misma sesión de colecta. Según experiencia del autor el porcentaje de anomalías es siempre menor en los segundos eyaculados colectados, sin embargo el porcentaje de espermatozoides móviles al descongelado no difiere en forma significativa. Asimismo, Schenk (1998) constato una composición diferente en el plasma seminal de los primeros y segundos eyaculados:

Características seminales del primer y segundo eyaculado de toro colectado con 20 minutos de intervalo (Schenck 1998)

 

1.d Efecto edad

El efecto edad del toro en relación al poder fecundante del semen se ha estudiado muy poco en razón de la falta de trazabilidad en lo que respecta a la fecha de producción del eyaculado y la IA. Sin embargo, este factor ha sido considerado ligándolo a la hembra y al año de producción.

De esta forma, la fertilidad de un toro de 1 año puede aumentar cuando cumple 2 años, ya que se han observado 4-6 puntos más en el porcentaje de preñez y de parición en un estudio realizado con toros de monta natural sobre 748 vacas (Makarechian y col. 1993).

En lo que respecta a los toros viejos, los mismos presentaron una fertilidad menor como en el estudio de Murray y col. (1983), en donde toros Holstein de 14 años presentaron una TNR 60/90 días inferior en 4% en relación a los toros de un año. En realidad la estimación del porcentaje de parición de los toros de progenie Holstein no difiere de aquella de los toros de servicio entre 60 a 107 meses (Taylor y col. 1985) y la reducción de la fertilidad comienza a observarse a partir de los 5 años de edad.

Un estudio realizado sobre la razas Holstein y Guernsey mostró que la regresión de la TNR en relación a la edad de los toros fue significativa para las dos razas a partir de 2 años (tabla 2)(p<0,01). Esta disminución fue de 0,31% de 2 a 16 años para los Holstein y de 0,50% para los Guersney de 2 a 13 años (Collins y col. 1962).

Tabla 2: Regresion de la fertilidad de Toros Holsteins en relacion a su edad

 

 

1.e Efecto familia

Una familia de toros se define como el conjunto de terneros machos nacidos del mismo padre. Si la fertilidad de los machos es "heredable", la fertilidad observada de los toros de testaje o progenie debiera lógicamente ser influenciada por el padre.

Así los resultados de pariciones obtenidos a partir de inseminaciones realizadas en Francia entre 1996 y 1998 permitieron observar la fertilidad de los toros de testaje nacidos de 13 familias de 3 razas: Holstein (n=9) ; Montbéliard (n=3) y Normando (n=1). Cada una de las familias estaba constituida por no menos de 40 toritos, los cuales realizaron 300 IA entre los años 96-98. Entre los fenómenos observados entre esas familias llamó la atención los resultados obtenidos en 3 de ellas que proporcionaron sistemáticamente una tasa de parición menor al promedio de las mismas y más variabilidad.

 

1.f Efecto anomalías cromosómicas

Una de los estudios que debe realizarse cuando se obtiene una TNR baja en un número significativo de hembras en diferentes establecimientos con semen congelado de toros que no presentan problemas de calidad de semen (motilidad y morfología normal) es el cariotipo. La primera anomalía cromosómica en ganado bovino relacionada con la fertilidad fue descubierta en 1964: translocación 1/29.

En el 2000 Ducos y col (2000), estudiaron un caso de baja fertilidad a campo (< 30% en mas de 400 IAP) en 3 toros de la raza Montbéliard. El análisis citogenético evidenció la presencia de una translocación cromosómica 12:17.

 

2. Los medidas de manejo y medio ambiente

2.1 Colecta de semen y sala de monta

El trabajo en sala de monta realizado por el equipo de un CIA comprende una fase de preparación sexual o periodo de pre-excitación y una fase de excitación propiamente dicha compuesta de falsas monta sobre un súcubo o maniquí.

Todo responsable de un CIA debe acompañar esta fase y monitorear la misma por lo menos una vez cada 15 días. No existe en opinión del autor ningún otro equipo de trabajo en un CIA que pueda influenciar en forma tan significativa la cantidad y calidad de semen. La colecta de semen influencia en forma importante la calidad de semen producida por intermedio de su personal, la calidad y limpieza de la sala de monta, el tipo y preparación de la vagina artificial., y el ritmo o frecuencia de colecta. Optimizar la frecuencia de colecta a los efectos de reducir las reservas de semen en el epidídimo y aumentar el transito epididimario es una de los métodos más antiguos para mejorar la calidad de semen (Amman, 1961).

En regla general los CIA de Europa y América del Norte usan un ritmo de colecta de 2 x 2 (2 eyaculados 2 veces por semana). Es interesante remarcar que en regla general los toros colectados con este ritmo presentan una calidad post descongelada superior en los segundos eyaculados colectados (Schenk 1998) . En regla general, es altamente recomendado de estimular sexualmente los toros antes de la colecta. Esta practica de manejo puede dividirse en dos fases: a) pre excitación sexual de 15-20 minutos en toros lecheros y 30 minutos en toros de carne de razas europeas colocando los animales en un brete contiguo a la sala de colecta y permitiendo a los animales observar a los otros toros saltando, y b) falsas montas, siendo una de las mejores técnicas para producir semen en cantidad y calidad en toros de razas europeas practicar dos falsas montas 5 minutos de espera restringida al lado del súcubo y una tercera falsa monta antes e colectar (Schenk J 1998).

Un trabajo interesante fue presentado por Yates J en 2002 comparando el comportamiento, libido y las características de semen antes y después de congelado de toros Holstein y Braham colectados en régimen diurno y nocturno. A pesar de una mejor respuesta a la colecta en régimen nocturno no se constato diferencia en la congelabilidad del semen.

 

2.2 Efecto estación del año

En los pequeños rumiantes es común observar un factor "estacional" sobre la calidad del semen y la fertilidad. La primavera constituye un período desfavorable para la gran mayoría de las razas ovinas, debido al aumento de la duración de los "horas luz", a la cual son sensibles carneros y machos cabríos (Colas y col. 1983 , Corteel y col. 1980).

En el bovino la variación estacional de la fertilidad es más discreta pero se conoce desde los años sesenta (Courot y col. 1968). La utilización de la técnica de congelación de semen en bovinos permitió distinguir la responsabilidad del macho y de la hembra en materia de estación del año, lo cual no era posible antiguamente cuando sólo se empleaba semen fresco.

Así, los trabajos de Courot y col. (1968) en Francia mostraron que el semen de toros de raza Montbéliard producido en primavera fue más fecundo que aquel producido en otoño (2,4 puntos más de TNR 60/90 días). Por el contrario, Sullivan y Elliot (1968) observaron una menor TNR 60/90 días (74,2%; P<0,01) obtenida con semen producido durante la primavera y verano, que aquella obtenida con semen producido en otoño e invierno (76,3%).

Para Everett y Bean (1986) igualmente el efecto "mes" de producción del semen influyó en forma significativa sobre la fertilidad, haciendo variar el porcentaje de concepción en ±1,33%. En cambio, otros estudios no han puesto en evidencia un efecto claro del mes de producción sobre la TNR 30/60 y 60/90 días (Dimitripoulus 1968) ni sobre el porcentaje de parición (Sullivan y col. 1968).

En América Latina destaca el trabajo presentado por investigadores Brasileros en la región Sureste de este país: Anchieta y col 2005, comparando razas taurinas a cebuinas en dos grandes épocas del año: lluviosa y seca, ambas con temperaturas elevadas ( > 19 C). En regla general, el la congelabilidad del semen, juzgada por apreciación subjetiva a la colecta, fue superior en las de razas taurinas que en las cebuinas, así como el descarte de eyaculados mayor en épocas lluviosas.

 

2.3 Alimentación

Pocos son los trabajos que han relacionado la alimentación de los toros de CIA con la producción y calidad del semen.

El autor empleo durante varios años en CIA en Europa con toros estabulados dos estrategias de alimentación según que los reproductores se encontrasen en fase de producción de semen o en lay-off (reposo sexual).

Toros en producción:

  • Heno de alfalfa o pradera a voluntad
  • Cama de paja
  • Ración concentrada (3-4 Kg/toro/día en Holstein y 1-3 K en Normando) con 14.5% de proteínas, materia grasa 2,3%, 12,3 % de celulosa bruta, 7,6 % de cenizas

Toros en lay-off (16 meses a 3.5-4 años):

  • 15 K de ensilado de maíz
  • 7-8 K de heno
  • 400 g por día de un concentrado a base de soya y minerales para los toritos con menos de 24 meses y para aquellos con más de 24 meses solo minerales.

Uno de los factores más conocidos en los CIA es el efecto negativo de las dietas altas en energía. En efecto, Coulter y col (1997) pusieron en evidencia un efecto nefasto de dietas altamente energéticas (80 % granos y 20 % forraje) en toritos de carne destetados Angus y Hereford, a cual indujo una circunferencia escrotal importante pero un tono testicular reducido y una capacidad de termorregulación testicular menos eficiente. Asimismo, el examen de semen de los toritos así alimentados reveló un porcentaje mayor de anomalías espermáticas y un numero inferior de espermatozoides con motilidad progresiva frente a toros alimentados con dietas menos energéticas.

La alimentación de los toros juega un papel fundamental en el desarrollo y la aparición de problemas en las pezuñas, las manifestaciones de úlceras y abscesos en la línea blanca constituyen muchos episodios de cojeras. Ambas enfermedades (salvo el absceso en la línea blanca producto de un traumatismo) son consecuencia de la incapacidad del corion para producir una pezuña de calidad y para ello la alimentación juega un papel decisivo.

Cambios bruscos en la alimentación, baja calidad de los ensilados, poca fibra en la ración conducirá a una menor salivación y por consiguiente a una reducción del efecto tampón que tiene la saliva en el rumen por lo que el riesgo de acidosis será mayor.

A los efectos de prevenir los problemas de pezuñas en toros es necesario:

  • Mantener la estabulación de los toros limpia y seca, proporcionando en el brete una cama ya sea de arena o paja o agua,
  • Cuidar del piso de la sala de monta que debe ser antideslizante y con declive lateral , incluir un tapete de goma de 3 m x 2 m en la zona de colecta,
  • Todos los pisos donde los animales permanecen un cierto tiempo (incluido el de la sala de monta) deben ser tratados por acido acético 10 días antes que los toros ingresen (1 litro de vinagre diluido en 10 litros de agua, neutralizar el cemento a razón de 5 litros por cada 100 m2)
  • Realizar siempre una transición alimentaría gradual de por lo menos 10 días para permitir que la flora ruminal se adapte,
  • Realizar la toilette (recorte funcional) de las pezuñas 2 veces/año
  • Suplementar la ración de los toros con materias primas que intervienen en la salud de las pezuñas: Zinc, metionina, cisteina, Vitamina A y E, Biotina, Ca, P y relación Ca/P (muy importante en toros), Cobre, Selenio, Azufre.
  • Usar bicarbonato de sodio (200 g /día) en caso de alimentación en base a ensilaje

La suplementación de Zinc (forma orgánica por ej. propionato) en las raciones de toros ha sido revisada recientemente. El Zinc influencia la producción y secreción de testosterona, insulina y corticoides suprarenales en consecuencia procesos como la esperamatogenesis están en parte mediados por este mineral (Mc Dowell y col. 1993). Kumar y col. 2006 encontraron que algunos parámetros seminales de los toros suplementados con 35 ppm de Zinc orgánico (motilidad masal, número de espermatozoides por eyaculado y test de penetración de espermatozoides en mucus cervical) se mejoraban luego de un período de suplementación de 6 meses.

 

3. tecnología de tratamiento del semen

3.1 Efecto Diluyente

Desde el desarrollo de la criopreservación del semen (Polge 1949) , la yema de huevo, la albúmina bovina o humana, la leche, una base salina compuesta, y el glicerol fueron empleados en los diluyentes de semen bovino. En la especie bovina, la gran mayoría de los diluyentes a excepción de aquellos a base de leche, poseen 20 % de yema de huevo o un substituto del mismo en su composición. El rol de la yema de huevo durante la congelación es la de proteger los espermatozoides del efecto nefasto de la dilución así como del "cold shock" que ocurre durante el proceso de congelación-descongelación (Moussa y col. 2001). El mecanismo por el cual la yema de huevo protege a los espermatozoides es hasta hoy desconocida. En regla general la yema de huevo utilizada es la de gallina, sin embargo en los últimos años y en especies consideradas como "difíciles de congelar" (ex. Burros baudet du poitou) se ha empleado yema de huevo de codorniz que se caracteriza por ser mas rica que la yema de huevo de gallina en fosfatidilcolina, menos en fosfatilidiletalonamina y una relación baja de ácidos grasos saturados e insaturados (Trimeche y col. 1997).

Los últimos avances en materia de diluyentes de semen bovino pueden clasificarse en:

1. aquellos que están relacionados a la protección de la membrana durante el proceso de congelación-descongelación

2. aquellos que incorporan substancias a carácter antioxidante en el diluyente

 

1. aquellos que están relacionados a la protección de la membrana durante el proceso de congelación-descongelación

1.a: Se admite que el daño que los espermatozoides sufren durante el proceso de congelacióndescongelación es superior a el ocasionado por la dilución o el agregado de glicerol El mismo es ocasionado por efecto temperatura y osmótico y afecta la morfología y fisiología de los espermatozoides incluyendo la regulación del calcio intracelular, la fluidez de la membrana plasmática, la permeabilidad, la composición lipídica y la actividad mitocondrial (Watson 1995) así como la induce la perdida de proteínas plasmáticas de membrana necesarias durante la fecundación en el tracto genital de la vaca (Lessar y col. 2000). Los daños ocasionados por este proceso pueden ser reducidos usando crioprotectores como el glicerol, la yema de huevo y azucares en los diluyentes. Una nueva generación de diluyentes de semen bovino (Biociphos plus™, Bioxcell ™, Andromed ™) hizo aparición a mitades de los años 90, se trata de diluyentes sintéticos sin productos de origen animal. La característica principal de los mismos es la de emplear un substituto de la yema de huevo. El objetivo principal de este tipo de producto no ha sido el de mejorar la respuesta a la congelación, sino el de evitar la contaminación bacteriológica del diluyente por intermedio de la yema de huevo (que puede llegar a proporciones de mas de 106 UFC/ml, Decuadro-Hansen 2004) así como el de facilitar la fabricación cotidiana del diluyente en CIA y la de mejorar la lectura al microscopio del semen congelado (nitidez de la lectura). Numerosos test de campo han permitido confirmar las excelentes TNR obtenidas con este tipo de diluyente versus los diluyentes a base de yema de huevo inclusive en baja concentración de espermatozoides congelados por dosis (ver tabla 3).

Tabla 3: TNR después de inseminación artificial con semen congelado obtenida con dosis de 15 y 5 millones de espermatozoides totales diluidos en diluyentes a base de Tris-yema de huevo (Triladyl) y diluentes sin yema de huevos : Bioxcell y Andromed. El test de campo incluye 5000 IAP por diluyente (Nehring H et Rothe L 2003)

No obstante, persistirán algunos parámetros o interacciones que pueden favorecer un diluyente en relación a otro ya sea con o sin yema de huevo, como por ejemplo, la "velocidad del enfriado del semen" de +32-34°C a +2-4°C, el número de espermatozoides totales o con motilidad progresiva utilizados que pueden "esconder" las diferencias o la "preferencia" que un semen puede tener con un diluyente en relación a otro. Así por ejemplo si comparamos 2 diluyentes entre sí en condiciones de campo, sería interesante disminuir la concentración de espermatozoides por dosis, a los efectos de detectar diferencias significativas entre diluyentes en materia de TNR.

Es altamente probable que el semen de algunos toros "prefieran" un diluyente en particular con respecto a otro. Cuando se comparan 2 o más diluyentes, a los efectos de disminuir los factores que influencian la fertilidad, debería utilizarse sistemáticamente la técnica del "eyaculado fraccionado" en uno o mejor varios CIA. Esto permite comparar diluyentes reduciendo los factores que eventualmente pueden influenciar la prueba, como ser: el CIA, el tratamiento del semen (protocolo de dilución, enfriamiento y envasado), el factor toro y el factor eyaculado

1.b : El LDL (lipoproteínas de baja densidad de la yema de huevo) y el colesterol: Numerosos autores han mencionado que la fracción de lipoproteínas de baja densidad de la yema de huevo conocida como LDL interacciona con la membrana de los espermatozoides durante el proceso de congelacióndescongelación y es la responsable de la protección durante la dilución y la crioconservación. Un nuevo método de extracción del LDL fue desarrollado en el INRA de Rennes (France) y experimentado en semen bovino con excelentes resultados. El LDL así extraído ha sido empleado como fuente de lipoproteínas en diluyentes a base de Tris, acido cítrico y fructosa comerciales y ha permitido confirmar el rol crioprotector de esta molécula así como la concentración optima en los diluyentes de semen bovino: 8 % w/v (Antón, INRA de Rennes comunicación personal). Los resultados obtenidos por el equipo de Briandt-Amarat y col. (2006) han permitido confirmar el efecto benéfico de esta nueva metodología de extracción del LDL ya que más espermatozoides motiles (54.4%) a la descongelación fueron hallados con el uso de un diluyente a base de Tris, acido cítrico fructosa + 8 w/v de LDL que con el mismo diluyente adicionado de 20 % de yema de huevo (30,2%). En otro orden de cosas, Graham. y col 2006 reporta una mejor viabilidad del semen bovino cuando el mismo es tratado previamente con colesterol y ciclodextrinas , sin embargo no existen hasta el día de hoy ningún test de campo que confirme que este tratamiento previo la congelación permita mejorar los resultados de fertilidad de los toros problema.

 

2. aquellos que incorporan substancias a carácter antioxidante (AOX) en el diluyente

La dinámica de la membrana plasmática de la célula espermática cumple un papel importante en los procesos de maduración, capacitación y fecundación (Wolfe et al., 1998; Müller et al., 1999); sin embargo, el aumento de los radicales libres (ROS) pueden dañarla (Clarkson y Thompson, 2000) y una de las principales causas del deterioro espermático es el estrés oxidante que causa peroxidación de los lípidos de la membrana plasmática, modifica su fluidez y altera la permeabilidad, lo que puede conducir a la célula a un proceso de muerte celular (Batellier et al., 2001).

La membrana de los espermatozoides contienen una alta concentración de ácidos grasos polinsaturados lo que le transmite a la misma una alta susceptibilidad a los problemas de daño oxidativo (oxidación o peroxidación) lo cual puede interferir en el proceso de fecundación. Este fenómeno fue recientemente confirmado en el trabajo de Kasimanickam R y col. en 2006.

Con base en lo anterior se puede considerar que un área prometedora de estudio es el posible pretratamiento contra los procesos de peroxidación de los espermatozoides o en el medio de dilución para proteger o conservar la integridad de su membrana durante el proceso de congelación y descongelación (Leboeuf et al., 2000), ya que se sabe que los metabolitos generados por las ROS durante los procesos oxidantes trastornan la fusión espermatozoide-ovocito, la movilidad espermática y la integridad del ADN (Aitken et al., 1998).

La acumulación de ROS ha sido también comprobada durante la conservación de semen fresco de toro así como después de la descongelación del semen.

Este "stress oxidativo" se ha asociado en el esperma humano con baja fertilidad y alteración del desarrollo embrionario (Aitken et al, 1996; Griveau and LeLannou, 1997, De Iuliis et al, 2006).

Sustancias antioxidantes están normalmente presentes en los espermatozoides y en el plasma seminal. Algunos de ellos son moléculas no enzimáticos como el α-tocopherol, acido ascórbico , glutathione (Halliwell and Gutteridge, 1989) piruvato (de Lamirande and Gagnon, 1992), taurina, hypotaurina y albúmina (Alvarez and Storey, 1983).

Se han llevado a cabo varios experimentos usando substancias AOX en diferentes especies animales para mejorar la calidad del semen y la fertilidad del mismo. Hasta ahora pocos resultados son realmente concluyentes. Bilodeau y col. (2002) trabajando con un diluyente a base de Tris-yema de huevo glicerol encontró que el agregado de fluido de oviducto rico en catalasa y piruvato mantenía la motilidad y viabilidad del semen así como los niveles de ATP intracelular cuando el semen era desafiado con H202. Foote y col. (2002) usaron glutation reducido (GSH), superoxyde dismutase (SOD), acido ascórbico, hypotaurina, Tempo y Tempol en un diluyente a base de leche. Entre los AOX usados solo el GSH consiguió mejorar los parámetros in vitro del semen liquido y descongelado sin aumento significativo de la fertilidad a campo.

Bing rond y col (2001) hallan que el agregado de glicina y betaina (100 o 200 mM) a diluyentes tipo Talp-yema de huevo o Tres-Test-yema de huevo mejora en forma significativa la motilidad del semen fresco a 20, 5 y 0 C en toros de baja y buena congelabilidad.

Identificación de la eficacia de la acción antioxidante en el semen:

Para desafiar el semen con ROS Gérard y col agregaron al semen bovino diluido cantidades crecientes de peroxido de hidrogeno (de 0 a 1 mM) y ensayaron 36 moléculas con actividad antioxidante en concentraciones de 50 micro M hasta 5 m para medir el rol protector de algunas. Solo 4 (designadas como N, AC, AE y AF) de las 36 moléculas testeadas permitieron mantener la motilidad y el vigor del semen (ver tabla 4 caso del AC).

Tabla 4: Evolución del porcentaje de espermatozoides vivos descongelados desafiados con cantidades crecientes de H2O2; (AC versus control).

 

Efecto de los AXO sobre las características in Vitro de los espermatozoides cuando los mismos son agregados a los diluyentes comerciales. Semen fresco o líquido (Gérard O 2006)

11 centros de producción de semen de Francia participaron en el siguiente test

a) Semen fresco: El semen de 7 toros colectados 2 veces por semana durante 3 semanas fue tratado por la técnica del "split ejaculate" en 3 fracciones y diluidas con un diluyente comercial a base de Trisyema de huevo (control, A01 Tris-yema enriquecido con AOX N a 1 mM y A05 Tris-yema enriquecido con AOX N a 5 mM, ver tabla 5). La adición de dicho AOX tuvo un claro efecto positivo (motilidad y vigor) a la concentración de 1 mM desde el día 2 y hasta el día 4.

Tabla 5: Evolución del porcentaje de espermatozoides móviles en cada fracción del eyaculado de 7 toros (21 muestras).

 

Efecto de los AXO sobre las características in Vitro de los espermatozoides cuando los mismos son agregados a los diluyentes comerciales. Semen congelado

El semen de 10 toros colectados 2 veces por semana durante 3 semanas fue tratado por la técnica del "split ejaculate" y diluido con un diluyente comercial a base de Tris-yema de huevo o un diluyente sintético sin productos de origen animal enriquecido o no con 4 diferentes AOX y 2 concentraciones diferentes. El semen congelado así producido fue evaluado por microscopia de contraste de fases y sistema CASA (Ivos HT) para los parámetros de motilidad y vigor, así como por citometria de flujo para los parámetros de viabilidad .Solo los AOX N y AC a una concentración de 5 mM mostraron una respuesta positiva. Los resultados de 4 de los CIA que participaron en este test se encuentran en la tabla 6. Cuando fueron usados 5 mM la viabilidad del semen no fue significativa diferente pero los parámetros de velocidad si.

Tabla 6: Influencia de la adición de N y AC a dos concentraciones diferentes en los parámetros de calidad seminal (Experimento N, n=80 eyaculados ; 4 CIA, 10 toros, 2 colectas de semen, Experimento AC, n=40 eyaculados).

Teniendo en cuenta estos resultados promisorios se realizo un test de campo con semen fresco y con semen congelado.

Semen fresco:

3 toros Holstein fueron colectados y su semen fraccionado en dos por la técnica del split ejaculate y diluido en Tris-yema de huevo, Tris-yema de huevo + AOX, las dosis fueron concentradas con 5 millones de espermatozoides totales cada una. Paralelamente semen de los mismos toros pero de otros eyaculados fue colectado diluido con Tris-yema de huevo y congelado.

Tabla 7: TNR18-75 usando FC (Semen Fresco Control), FN (Semen fresco con AOX N 1mM) y semen congelado (FS) (Gérard O 2006).

Tabla 8: TNR18-75 usando FC (Semen Fresco Control), FN (Semen fresco con AOX N 1mM) y semen congelado (FS), resultado por toro (Gérard 2006) .

La adición de AOX a el diluyente aumento de forma significativa la TNR del toro 1 y 2 ( + 13% y + 6 % respectivamente, tabla 7 y 8) mientras que fue levemente deprimida en el toro 3 (-3%). A señalar que para todos los toros la TNR fue superior en semen fresco enriquecido en N que en semen congelado.

Semen congelado (Gérard O 2006)

Varios test fueron realizados para confirmar el efecto benéfico del uso de AOX AC en el diluyente usado para congelar semen bovino y no es el objetivo de este trabajo de describirlos en detalle. En regla general, si bien se observa un efecto toro, el agregado del AOX AC permitió mejorar la fertilidad medida por la TNR 90 días en 3 puntos (tabla 9).

Tabla 9: TNR90 por toro (CIA) y por fracción de semen (dosis enriquecidas en AC 1811 inseminaciones versus control 1707 inseminaciones)

 

3.2 Efecto tratamiento del semen : curva de enfriado

Una vez el eyaculado colectado pocas son los métodos que permiten mejorar la calidad del semen a la descongelación.

El semen de toro se colecta en general sobre tubo seco y estéril sin diluyente. Un estudio reciente (Wendee 2007) narra las bondades de realizar la colecta sobre un dispositivo llamado BreedMaX™ el cual contiene diluyente en su interior que se de be entibiar a 37 C antes de realizar la colecta. No obstante el semen de toro puede permanecer sin diluyente alguno en un baño maría durante un periodo de 30 minutos. En efecto, a la fin de los años 60 algunos CIA practicaban este método llamado "holding" (mantenimiento del semen puro 10-30 minutos en baño maría antes de la dilución). Es en parte lo que se sigue realizando cuando dos colectas se hacen sucesivamente a 20 minutos de intervalo, sin embargo es opinión del autor que en eyaculados altamente concentrados (> 2 billones de espermatozoides/ml) es interesante realizar una pre dilución.

Gran parte de los cuidados y tiempos respetados usados en el laboratorio del CIA son destinados a evitar el cold schock.

En regla general, después de colectado, el semen debe enfriarse a 4-5 C en forma gradual (1.5-2 h mínimo) y luego equilibrarse (tiempo de espera a 4-5 C hasta la congelación) durante 3-24 h. Es opinión del autor que poco se ha experimentado con la primera fase de la curva (37 C hasta 4-5 C). Así por ejemplo, diluyendo y llenando las paillettes a temperatura ambiente, el autor obtuvo buenos resultados de motilidad y viabilidad con semen calificado mediocre a el examen post colecta bajando la temperatura desde 20 C hasta 4 C en 160 minutos a 0.1 C/minuto en un congelador programable (Minidigtcoll IMV-Technologies). Es posible que este tipo de descenso de la temperatura sea mas regular, homogéneo y lento que el enfriado en masa realizado en recipientes en donde la técnica no esta estandardizada (descenso con recipiente sumergido en agua del baño maría o no, calidad y potencia del refrigerador, etc.).

Sin embargo, numerosas experiencia han sido realizadas con la equilibración y han mostrado que es más importante el tiempo de incubación del semen diluido a 4-5 C que el tiempo en el cual el semen esta en presencia del glicerol (Salisbury y col 1978).

Los trabajos de Gilbert y Almquist (1978) así como de Frijters (2003) están a favor de una equilibración prolongada de 9 y 16 h respectivamente debido a una mejor motilidad, porcentaje de acrosomas normales y viabilidad (integridad de la membrana) obtenida frente a periodos de equilibración más cortos. El uso de tiempos de equilibración largos fue experimentado a campo por Foote y Kaproth (2002) quienes compararon en un test a gran escala (14.000 IA) dos tiempos de equilibración del semen bovino diluido en diluyente a base de leche: 4 versus 28 h sin observar diferencias significativas en la fertilidad. En Francia el tiempo promedio de equilibración es hoy en día de 5 horas.

Pribenszky y col. (2006) presentaron una mejora sustancial de los resultados a la descongelación y de la fertilidad del semen bovino después que las paillettes fueron tratadas con presión de 300 bar durante 90 minutos a temperatura ambiente antes de practicar el enfriado a 4-5 C. Esta estrategia puede ser interesante para toros de baja congelabilidad no obstante es necesario que se evalué con un numero de toros importante.

El tipo de embalaje usado para contener el semen: pajuelas finas, medias, pellets influencia la curva de congelación, sin embargo pocos son los artículos científicos que han comparado en eyaculado fraccionado la calidad de cada embalaje frente a la fertilidad a campo. En regla general el autor considera que no existen diferencias significativas de fertilidad entre las pajuelas finas y las medias en acuerdo con Kupferschmied (1982).

Las técnicas de congelación del semen en si han evolucionado en forma importante en estos últimos 10 años. Hoy en día la mayorías de los CIA poseen un congelador programable que permite modular la curva de enfriado en ritmos de 0.1 C/minuto hasta 60 C/minuto. La curva de descenso de temperatura para el semen bovino puede realizarse a diferentes velocidades (Saacke 1982), sin embargo en opinión del autor los mejores resultados son obtenidos con una velocidad de descenso de 40-50 C/minuto entre -10 y – 100 C.

 

3.3 Efecto número de espermatozoides por dosis de IA

Uno de los conceptos principales con respecto a la evaluación de la fertilidad de los toros es la relación entre la calidad y cantidad de espermatozoides. Dentro de este concepto propuesto por Salisbury en 1961 (32) se considera que para una característica dada del semen, la fertilidad aumenta en función del incremento de la misma hasta un valor máximo a partir del cual los factores limitantes son otras características del semen o la población de hembras.

Esta "característica" puede ser: 1) un factor cualitativo del eyaculado (motilidad, proteínas del plasma seminal, etc.), 2) el número de espermatozoides inseminados, o 3) o el número de espermatozoides con una característica particular. Pace y col. (1981), así como Den Das (1992) demostraron que esta relación con la fertilidad existe realmente para el número de espermatozoides que posean una serie de criterios de viabilidad. Es decir que el número de espermatozoides inseminados (y no el porcentaje) que presentan ciertos parámetros de viabilidad (motilidad progresiva, integridad del acrosoma, aptitud a reaccionar a la prueba de resistencia osmótica, aptitud para atravesar un filtro de Sephadex, etc.) está correlacionado con la fertilidad. Esta relación es de tipo exponencial y tiende a una asíntota (Figura 1). En lo que respecta al número de espermatozoides con motilidad progresiva, Pace y col. (1981) informaron que la TNR 90 días disminuyó en 4,9% cuando el número de espermatozoides móviles después de la descongelación pasó de 8 a 2 millones por dosis.

En otro estudio, Foote y Parks (1993) remarcaron que la fertilidad disminuyó un 1% (p<0,05) cuando el número de espermatozoides totales pasó de 24 a 12 millones. Sin embargo este efecto de la disminución eventual de la fertilidad en función del número de espermatozoides no se observa en todos los toros.

Por otro lado es importante señalar que los toros catalogados como "poco fértiles" no podrán alcanzar una fertilidad correcta o comercialmente aceptable, a pesar de utilizar dosis de semen altamente concentradas en espermatozoides (34).

Januskauskas y col. (1996) compararon los resultados de fertilidad obtenidos con 5 toros que fueron utilizados en IA con una concentración de entre 10 y 15 millones de espermatozoides por dosis. Dos toros mantuvieron su fertilidad mientras que los otros tres perdieron 3,4 a 4,7% de TNR 56 días. Es interesante resaltar que el toro con peores resultados de fertilidad era menos fértil aún con 15 millones de espermatozoides.

En regla general los toros poco fértiles requieren más espermatozoides por dosis para alcanzar su valor máximo de TNR Stalhammar y col. 19943). A su vez este tipo de toros no alcanzan a tener una TNR dentro de lo que puede considerarse como aceptable a pesar de aumentar la concentración de espermatozoides en la pajuela. Estas dos nociones: 1) aumento más lento de la fertilidad en función del número de espermatozoides inseminados y 2) un máximo de fertilidad alcanzado menor al resto de los toros del CIA nos hace recordar los principios mencionados al principio como factores compensables y no compensables. Como lo muestra la Figura 1, el toro A es de referencia, el toro B presenta una deficiencia que puede ser compensada aumentando la concentración de espermatozoides en las pajuelas y el toro C presenta factores no compensables que no le permiten alcanzar una TNR aceptable.

Figura 1. Correlación entre fertilidad y el número de espermatozoides inseminados, en 3 toros diferentes, A, B y C (TA, TB y TC).

 

3.4 Efecto número de espermatozoides viables por dosis de IA

Desde el inicio de la IA en bovinos, los CIA procuraron un método simple, preciso ,eficaz y relacionado con la fertilidad a campo para evaluar el semen de toro. Los exámenes del semen como el volumen, la motilidad de masa e individual así como la concentración son particularmente eficaces para eliminar los eyaculados o pajuelas de mala calidad pero ineficaces para determinar la fertilidad de los toros.

Por ejemplo, la subjetividad e imprecisión del control de motilidad post-descongelado de las paillettes bovinas imposibilita la harmonización de los criterios de aceptación del semen entre CIA. En los últimos años, una serie de pruebas de laboratorio se han desarrollado para evaluar otros parámetros seminales tales como la integridad de la membrana de los spz o del acrosoma , en base al uso de soluciones hiposmóticas o en el uso de colorantes fluorescentes y un citómetro de flujo.

Christensen y col (.2000) desarrollaron un método destinado a estudiar la relación entre la viabilidad del semen estimada por citometría de flujo (FACSCount™ BD/SYBR14/PI) y la fertilidad a campo. Decuadro-Hansen y col observaron una correlación positiva entre la TNR y el número de espermatozoides viables por dosis de IA (Figura 2) en una prueba a campo realizado en Francia con 13 toros diferentes y 2154 IAP.

Figura 2: Número de espermatozoides viables por dosis de IA x TNR 60/90 d (r²=0.69 , P<0.01).

 

3.5 Precio de la dosis de semen

El precio de venta de la dosis de semen es un factor que el CIA debe tener en cuenta cuando analiza la fertilidad de un toro. Así por ejemplo en Canadá, Van Doormaal, (1993) encontró que las dosis de menos de 15 dólares canadienses presentaban una "fertilidad" superior a aquellas más caras. En efecto, los productores utilizan estas dosis más caras sobre vacas de alta calidad genética y por ende con una producción lechera mayor, lo cual castiga la fertilidad de las dosis utilizadas. Así un aumento de la producción de leche de +1.000 Kg determinó una disminución de 3% en la TNR 28 días y de 4% en la TNR 90 días (1999).

 

Elección de un número de espermatozoides / dosis

Con motivo de simplificar el trabajo, la mayoría de los CIA utilizan un objetivo común para todos los toros, que se expresa en el número de espermatozoides por dosis o número de espermatozoides con motilidad progresiva por dosis.

La existencia de numerosas fuentes de variación de fertilidad (toro, eyaculado, estación del año, número de espermatozoides, IA, hembra) impone al CIA escoger un número de espermatozoides por dosis bastante elevado, lo cual establece un cierto margen de seguridad. Esto justifica el empleo de cantidades altas de espermatozoides por dosis en los toros de razas lecheras (aproximadamente de 20 millones), lo cual, según el porcentaje de espermatozoides con motilidad progresiva obtenido después de la descongelación (por ejemplo 30 a 50%), permite disponer de entre 6 a 10 millones de espermatozoides con motilidad progresiva por dosis para la gran mayoría de los eyaculados. La TNR 90 días promedio que se puede esperar según la fórmula de Pace y col. (1981) sería de 70,4 y 71,4% respectivamente.

 

Relación entre la evaluación in vitro y la fertilidad

Es común en los CIA de limitar el examen de semen descongelado a una simple evaluación de la motilidad inmediata o diferida (test de termoresistencia). Sin embargo, Amann (1961) y Pace y col (1981) demostraron más de una vez que dosis que presentaban un adecuado número de espermatozoides con motilidad progresiva a el descongelado podían ser responsables de un porcentaje bajo de fertilidad. Asimismo, Stalhammar y col. (1994) estiman que si bien la motilidad antes y después de la congelación es diferente entre los toros de un CIA, la misma sólo representa 1% de la variabilidad de la TNR.

El uso de los sistemas CASA permitió darle objetividad a los parámetros de motilidad y estudiar otros no detectables por el ojo humano. Recientemente Hallap y col (2006), encontraron una correlación interesante entre la fertilidad a campo y algunos parámetros CASA: la velocidad promedio medida (VAP) (p < 0.001), la motilidad total (p < 0.01), la linearidad (p < 0.05) y el numero de espermatozoides móviles (p < 0.05), todos medidos después de practicar el swim-up.

La evaluación de un reproductor al ingreso en un CIA consiste en un examen clínico completo, con especial atención al tracto genital y al aparato locomotor, una serie de exámenes complementarios destinados al control sanitario (serológicos, control de enfermedades venéreas, Schalm test, etc.), y un examen minucioso de las características del eyaculado: volumen, concentración, motilidad, examen de las anomalías morfológicas de los espermatozoides ( mínimo 3 sobre los segundos eyaculados), y evaluación de la aptitud a la congelación (motilidad, acrosomas, integridad de la membrana). Luego de esta evaluación del potencial reproductor del toro, los animales son generalmente clasificados en aceptables, inaceptables o regulares. Generalmente los animales clasificados como "aceptables" y "regulares" ingresan dentro del esquema de producción de semen, sabiendo que los segundos sufrirán un examen complementario. Los animales "infértiles" son generalmente eliminados dentro de este esquema, sin embargo debemos tener siempre presente que es "riesgoso" querer clasificar los animales únicamente sobre la base de las apreciaciones in vitro. Como sabemos, existen diferencias importantes entre CIA y laboratorios en lo que se refiere a los criterios de eliminación de los eyaculados y pajuelas de un toro lo cual demuestra la falta de harmonización así como la subjetividad e imprecisión de los criterios generalmente utilizados (motilidad) para calificar un reproductor. Efectivamente como vimos, los factores que influencian la fertilidad son numerosos e interactúan entre sí. La evaluación in vitro es delicada ya que los coeficientes de correlación entre la misma y la fertilidad in vivo raramente sobrepasan a 0,4. Esto se debe a la poca variabilidad existente entre los toros utilizados en IA (los cuales son seleccionados por este carácter), a la concentración elevada de espermatozoides por dosis y a los numerosos cofactores que influencian la fertilidad. Como regla general no existe correlación alta entre los test de evaluación in vitro del semen y la fertilidad.

Sin embargo una correlación importante, próxima a uno (r= 0.99), fue hallada por Christensen y col. entre la viabilidad del semen evaluada por citometría de flujo y la fertilidad (2000).

Dentro de los parámetros seminales que podrían considerarse como altamente correlacionados con la TNR se encuentran: la motilidad individual de los espermatozoides en el eyaculado fresco inmediatamente después de colectado y la motilidad inmediata al descongelado (Christensen y col 1999).

El criterio de fertilidad que debemos privilegiar es la tasa de parición o en su defecto una TNR tardía.

 

Problemas prácticos en la evaluación de la fertilidad

Si suponemos que todos los aspectos ligados a la hembra y a la IA son correctamente controlados, la fertilidad de los toros de IA no caracteriza el poder fecundante del reproductor sino el poder fecundante de la dosis de semen utilizada. Sin embargo muchos factores pueden confundirnos en la apreciación de la fertilidad de un toro, sobre todo si consideramos los elementos sobre los que vamos a calcular el poder fecundante (Tabla 10).

Por ejemplo, si se quiere estimar el poder fecundante a partir de las pajuelas utilizadas, la fertilidad del macho observada permite obtener una buena estimación poco influenciada por el factor inseminador y por la hembra, en la medida que el semen sea de buena calidad y el número de IA importante.

Tabla 10: Factores a tener en cuenta cuando se quiere estimar la fertilidad de los toros

 

Conclusión

Cuando se analiza la fertilidad de un toro a nivel de campo se pone en evidencia un conjunto de factores ajenos al toro mismo.

Sin embargo para un CIA con un número importante de toros en producción y practicando el mismo manejo de los eyaculados (dilución, enfriamiento, equilibramiento y congelación), es posible identificar que el factor "toro" pesa de forma preponderante en el resultado final obtenido (TNR).

La observación de este efecto macho, autoriza a pensar que quizás en un futuro próximo se pueda contribuir a mejorar la fertilidad de los rodeos por medio de una selección activa sobre los factores que mejoran este carácter en el macho. En este sentido sería muy importante que los CIA vigilaran este aspecto (fertilidad de los toros) sobre todo debido a la difusión masiva de esos mismos toros en los rodeos comerciales.

Un mejoramiento pragmático de la fertilidad y la difusión de un toro en IA reposa sobre un estudio "individual" de cada animal en relación al número de espermatozoides inseminados y la fertilidad.

 

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El autor estará presente brindando una Conferencia en las VI Jornadas Taurus de Reproducción Bovina

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Re: Factores que influyen en la congelación del semen de toros
25/07/2012 | Hola Gustavo, un abrazo me da gusto saber di ti, excelente trabajo de los toros para ponerlo en practica,no platicó contigo desde que estuve contigo en la posta donde tome el curso de produccion de embriones con la sonda de 3 vías IMV, fui con el dr. Garnier, ya trabajo independiente en mi ciudad natal Durango Durango México, espero tener noticias tuyas.

Dr. Roman Uviña
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Manuel Perez Durán
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Chihuahua, Chihuahua, México
Mestria en cienciad area reproduccion y genetica
Re: Factores que influyen en la congelación del semen de toros
25/07/2012 | 25/07/2012 GUSTAVO, EXCELENTE TRABAJO MUY INTERESANTE...UNA PREGUNTA EN TU ARTICULO ME ENCONTRE UNA CITA BIBLIOGRAFICA DE EVANS Y COL 2005 QUE HACE REFERENCIA A LAS ANORMALIDADES ESPERMATICAS RELACIONANDOLA CON LA INSERCCION DEL PELO DE LA FRENTE DEL TORO......ME INTERESO MUCHO PERO EN LA BIBLIOGRAFIA NO APARECE ME PODRIAS DAR LA CITA COMPLETA..

SALUDOS Y FELICIDADES POR TU TRABAJO MUY BUENO

M.C. MANUEL PEREZ DURAN
MAESTRIA EN REPRODUCCION ANIMAL EGRESADO DE LA UACH.
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Cruz Enrique
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Jose Cardel, Veracruz-Llave, México
Médico Veterinario Zootecnista
Re: Factores que influyen en la congelación del semen de toros
26/07/2012 | MUCHAS FELICITACIONES DR. GUSTAVO
ES PRESISAMENTE LO QUE ESTABA BUSCANDO, YA QUE TENGO DOS TOROS Y LOS PIENZO EN ORDEÑAR EN APROXIMADAMENTE UN PAR DE MESES.
TIENE 17 MESES DE EDAD, SON CEBU SARDO NEGRO.
OJALA Y SIGA PUBLICANDO MAS ARTICULOS.
MUCHAS GRACIAS
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CHAVIRA OROZCO LUIS FERNANDO
down arrow
El Salto, Chihuahua, México
Médico Veterinario Zootecnista
Re: Factores que influyen en la congelación del semen de toros
03/08/2012 | Dr. Decuadro, excelente trabajo, mi pregunta es si han realizado evaluaciones sobre % de fertilidad, independientemente del disluyente a utilizar con el primer o segundo eyaculado por la diferencia del pH del semen ademas de celulas reciduales que salen en la primer colecta.
le doy las gracias de antemano
muy buen articulo
MC luis fernando chavira orozco
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Raul Magaña
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Villahermosa, Tabasco, México
Agricultor
Re: Factores que influyen en la congelación del semen de toros
24/01/2013 | felicidades dr. gustavo excelente art. quiero preguntar si la edad de un toro puede influir en la calidad de las crias, me refiero a que hay crias que nacen con defectos por ejemplo me a tocado ver becerros que al pararse se le dobla las pezuñas traseras, tambien algunos que estan muy raquiticos el toro tiene una edad promedio de 8 años.

de antemano le doy las gracias

C. RAUL MAGAÑA
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Juan Carlos Acosta
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La Villa del Rosario, Zulia, Venezuela
Estudiante
Re: Factores que influyen en la congelación del semen de toros
30/01/2013 | buenas hermano podria indicarme que tipo de glicerol usa en la formula
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