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Hongo Trichoderma spp

Cultivo In Vitro de Trichoderma spp. y su antagonismo frente a hongos fitopatógenos

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RESUMEN

Con el objetivo de evaluar el potencial del hongo Trichoderma spp, se llevaron a cabo dos bioensayos en el año 2006 en el Laboratorio de Microbiología de la Escuela Superior Politécnica Agropecuaria de Manabí Manuel Félix López (ESPAM MFL). En el primer bioensayo se evaluó la velocidad del crecimiento de Trichoderma spp., en dos medios de cultivo: Papa dextrosa agar (PDA), Agar extracto de malta (AEM). Se utilizaron ocho cepas de Trichoderma spp., aisladas de tres áreas de producción del campus de la ESPAM MFL, localizada en el sitio EL Limón, Calceta-Manabí. El diseño experimental utilizado fue un Completamente Aleatorizado (DCA) con tres réplicas. Los mejores resultados se obtuvieron en las cepas provenientes del área de cultivo de cacao TAC1 y TAC2, así como la perteneciente a la unidad de producción ecológica TAE1; y el medio de cultivo PDA. Estos materiales sirvieron de base para el bioensayo 2, en donde se midió la capacidad antagónica de las cepas seleccionadas en el bioensayo 1 frente a los fitopatógenos Fusarium spp., Sclerotinia spp., y Rhizopus spp., el diseño experimental utilizado fue un DCA con cuatro réplicas. Donde se corroboró que las cepas de Trichoderma spp. TAC1, TAC2 y TAE1, ejercen un control del 100% sobre los tres patógenos al quinto día evaluado. La que tiene mejores características para ser multiplicada y liberada en campo es la cepa TAC2, ya que su esporulación es mayor; esta característica es fundamental para que el hongo sea establecido con mayor rapidez en un campo determinado.

ABSTRACT

In order to evaluate the potential of the fungus Trichoderma spp. as a biological control agent of various phytopathogens affecting different cultivations during every cycle of evolution, two assays were carried out in the year 2006. The first assay evaluated the speed of rise of the Trichoderma spp., in two cultivations: 1) Papa Agar Dextrosa (PDA); and , 2) Agar Extract of Malta (AEM). The work procedure in this first phase of study was established using 8 “strains” of Trichoderma spp., insulate in three area of production in the Superior Polytechnic School of Manabí “Manuel Félix López” (ESPAM “MFL”) located in Calceta-Manabí, In this experiment a completely random design (CRD) was used with three replications. Two factors were studied. “Strains” of (Factor A) and “Culture Medias” (Factor B). The best results were obtained from the cacao crops TAC1 and TAC2, also from the ecological production TAE1 strains: and the PDA cultivation. Which were used subsequently in the bioassay 2. Where was evaluated the antagonist capacity of the selected strains in bioassay # 1 opposite to the phytopathogens Fusarium spp., Sclerotinia spp. and Rhizopus spp. It was established a completely random design (CRD) with four replications. Here it was confirmed “in vitro” where the Thichoderma spp., holds the control of 100% up the three phytopathogens in the fifth day of evaluation. In conclusion, the strains TAC1, TAE1 and TAC2 produces a good biological control “in vitro” of the phytopathogens used in this study; however, the strains codified as:TAC2 showed the best characteristic to be multiplied and liberated in the field, because of the higher sporulations observed during its development; this characteristic is fundamental so the fungus can be establish faster in the field.


INTRODUCCIÓN

El uso de microorganismos antagonistas de fitopatógenos habitantes del suelo, cobra cada vez más importancia ya que su aplicación no genera desequilibrios biológicos, y más bien regula o minimiza las poblaciones de fitopatógenos habitantes del suelo; esta acción de los antagonistas, indudablemente, conduce a la disminución o eliminación del uso de productos químicos que son nocivos para el entorno.

En nuestro país estos estudios son muy incipientes o se los ha realizado muy superfluamente, desaprovechando, de esta manera, la posibilidad de manejar problemas fitopatológicos a muy bajos costos y sin riesgos para el medio ambiente.

Para Baker, K. y Cook, J. (1983), se entiende por control biológico la reducción de la densidad o de las actividades productoras de enfermedades de un patógeno o parásito en su estado activo o durmiente, lograda de manera natural por medio de antagonistas a través de la manipulación del ambiente del patógeno que se quiere controlar, hablemos de control biológico haciendo referencia a la utilización de microorganismos antagonistas para el control de enfermedades, entendiéndose por antagonistas aquellos organismos que interfieren en la supervivencia o desarrollo de los patógenos.

Los autores antes mencionados manifiestan, que el control biológico involucraría todas aquellas prácticas tendientes a disminuir la incidencia de enfermedades, excluyendo el control químico. En la naturaleza existe una interacción continua entre los potenciales patógenos y sus antagonistas de forma tal que estos últimos contribuyen a que no haya enfermedad en la mayoría de los casos; es decir, el control biológico funciona naturalmente.

Rollán, et al., (1998), mencionan que en condiciones naturales los microorganismos están en un equilibrio dinámico en la superficie de las plantas. La disminución de la flora de competencia por prácticas agrícolas como lavado de frutos, aplicación de fungicidas, y desinfección de suelos entre otras, favorecen el desarrollo de los patógenos. La posibilidad de desarrollar y aplicar esta tecnología en el país debe ser estudiada, como una alternativa de manejo inocuo de problemas fitosanitarios causado por hongos habitantes del suelo, que parasitan las raíces de las plantas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Este trabajo constó de dos bioensayos: En el bioensayo 1, se tomaron muestras de suelo a 20 cm de profundidad de tres diferentes áreas de producción de la ESPAM MFL, se las llevo al laboratorio donde se procedió a realizar una flora total de tres diluciones 10-1, 10-2 y 10-3 y se monitoreó durante 10 días, de donde se obtuvieron ocho cepas de Trichoderma spp., las que fueron codificadas de la siguiente manera: Área de producción convencional Cepa 1 TACv1, Cepa 2 TACv2. Área de cultivo de cacao Cepa 1 TAC1, Cepa 2 TAC2, Cepa 3 TAC3 y Cepa 4 TAC4. Área de producción Ecológica Cepa 1 TAE1 y Cepa 2 TAC2; las que fueron evaluadas estadísticamente para medir su velocidad de crecimiento y el medio de cultivo en el que los microorganismos se desarrollan de mejor manera, evaluando dos medios de cultivo PDA (Papa dextrosa agar) y AEM (Agar extracto de malta).

Experimento 1 Detalle de los tratamientos

En el Cuadro 1 se observan los tratamientos expresados con cada una de las claves de las cepas y los medios de cultivo correspondientes a cada uno. En la Foto 1 se observan cada una de las cepas en estudio en los respectivos medios de cultivo en su unidad experimental.

Diseño experimental

Se empleó el Diseño Completamente Aleatorizado (DCA), con tres réplicas. Con arreglo factorial A x B.

Manejo del experimento

Se tomaron discos de 7 mm de diámetro con un sacabocado de las 8 cepas del género Trichoderma spp. Se incubaron los tratamientos en la estufa a 270C durante 2 días, a partir de allí se evaluó: crecimiento en milímetro/día.- Con una regla estandarizada en milímetros se medió el diámetro de crecimiento de las colonias de Trichoderma spp., en sus respectivos tratamientos, cada 24 horas durante 2 días a partir de la siembra.

Morfología.- Al quinto día se observaron las cajas petri al microscopio con el objetivo de 40 X, para determinar algunas de las características de las cepas de Trichoderma spp., y los medios de cultivo en estudio en el bioensayo 1 como: forma del micelio, color del micelio, tipo de micelio, esporulación, color que adquiere el medio de cultivo y el olor que emite cada una de las cepas en estudio.

Análisis estadístico

Para determinar la diferencia estadística entre los tratamientos se utilizó el programa estadístico, paquete de diseños experimentales FAUANL de la Universidad de Nuevo León de México.

Para determinar si existía diferencia significativa entre los tratamientos se realizó una prueba de rangos múltiples de Tukey al p< 0.05.

Experimento 2

En el bioensayo 2, se evaluó la capacidad antagónica de las mejores cepas de Trichoderma spp., seleccionadas estadísticamente del bioensayo 1, las que fueron: TAC1= Trichoderma spp., Área de Cacao 1, TAE1= Trichoderma spp., Área Ecológica 1 y TAC2= Trichoderma spp., Área de Cacao 2 (Fig. 2), frente a Fusarium spp., Sclerotinia spp., y Rhizopus spp., aislados en el Laboratorio de microbiología de la ESPAM-MFL para este trabajo.

Detalle de los tratamientos

En el Cuadro 2, se expresa cada uno de los tratamientos del segundo bioensayo.

Manejo del experimento

Se tomaron discos de 7 mm de diámetro con un sacabocado de las 3 cepas de Trichoderma seleccionadas de los tres fitopatógenos en estudio, las cuales fueron sembradas de forma simultánea como lo indican los tratamientos. Luego se procedió a incubar los tratamientos en la estufa a 270C durante 5 días. En este lapso se procedió a evaluar el antagonismo. Con una regla estandarizada en (mm) se medió el diámetro de crecimiento de las cepas de Trichoderma spp., y cada uno de los fitopatógenos en su respectivo tratamiento cada 24 horas durante 5 días a partir de la siembra.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Bioensayo 1.

En el cuadro 3, se observan las ocho cepas evaluadas en el bioensayo 1 de las cuales se seleccionaron tres que estadísticamente se encuentran en la primera categoría; dos fueron aisladas del área de producción del cacao (TAC1 y TAC2) y una del área de producción ecológica (TAE1). En estas áreas de producción no se usa agroquímicos de síntesis, los controles fitosanitarios y fertilizaciones son a base de productos artesanales y comerciales de origen biológico, lo que puede haber favorecido a que estas cepas hayan tenido mejor eficiencia en su crecimiento con relación a las del área de producción convencional que, por el alto uso de productos de síntesis química, se han intoxicado los suelos y debilitado la flora benéfica de los mismos.

En el cuadro 4, se presenta los promedios de crecimiento de las ocho cepas en cada uno de los medios de cultivo. Se puede apreciar la ventaja estadística del medio de cultivo PDA en los dos días de evaluación. Este tiene influencia, marcada sobre el crecimiento del hongo Trichoderma spp., corroborando lo que manifiesta Monzón y Rodríguez, (s.f.) en que el alto contenido de carbohidratos que contiene el medio de cultivo, condiciona a que los hongos tengan un mayor crecimiento, en detrimento de la esporulación que suele retrasarse hasta un mes. El coeficiente de variación en el bioensayo 1, en el día 1 es alto debido a la alta variabilidad de los materiales biológicos evaluados.

En el cuadro 5, se observan algunas de las características morfológicas más relevantes de las cepas en estudio, se aprecia que siete de las ocho cepas en estudio adquirieron, en la fase de multiplicación, una esporulación de coloración verde, lo cual corresponde a una característica específica para hongos del orden Trichoderma, como lo manifiesta Esposito y Da-Silva, (1998); Harman, (2001); Papavizas, (1985).

De las ocho cepas, las codificadas TAC1 y TAE1, emiten un aroma a coco corroborando lo expresado por Dennis y Webster, (s.f) citado por Biocontrol, (2005), en que una de la características de Trichoderma es el pronunciado aroma a coco que emite el medio de cultivo, lo que certifica que el hongo con que se trabajó pertenecía al género Trichoderma.

Bioensayo 2. Antagonismo de Trichoderma spp. (Cepa TAC1) frente a Fusarium spp., Sclerotinia spp. y Rhizopus spp., tratamientos 1, 2 y 3 que emite el medio de cultivo, lo que certifica que el hongo con que se trabajó pertenece a Trichoderma.

Como se puede apreciar en los gráficos 1, 2 y 3 en el primer día evaluado, el crecimiento de los dos hongos fue homogéneo, pero para los días 2 y 3 el crecimiento de Trichoderma spp., se incrementa mucho con relación al fitopatógeno, cubriendo la mayor parte del sustrato, en este caso PDA (Papa dextrosa agar), la velocidad del crecimiento que tiene Trichoderma spp., es aprovechada por este como un mecanismo de control biológico conocido como competencia de recurso vital, corroborando lo expresado por Tronsmo y Hhjeljord (1998); citado por Biocontrol, (2005). El tercer día evaluado es el momento en que se confronta el crecimiento del hongo benéfico con el fitopatógeno en la caja petri, es cuando comienza el mico-parasitismo, al cuarto y quinto día Fusarium spp; Sclerotinia spp. y Rhizopus spp., es invadido por las hifas de Trichoderma spp., en el medio de cultivo y este cambia de color, pasando de crema a un color anaranjado intenso (Foto 4), este fenómeno puede ser provocado por la liberación de enzimas que realiza Trichoderma spp., al momento que micoparasita al fitopatógeno, degradándolo y alimentándose de este, corroborando lo expresado por Harman, (2001).

El antagonismo de Trichoderma spp. (Cepa TAE1) frete a Fusarium spp., Sclerotinia spp., y Rhizopus spp., (Gráficos 4, 5 y 6) en los días evaluados tuvieron un comportamiento similar en cuanto a crecimiento y mecanismo de acción, con la diferencia que en estos tratamientos, no hubo cambio de coloración en los fitopatógenos como ocurrió en los tratamientos T1, T2 y T3, solo en el tratamiento T5 la cepa TAE1 al cuarto día evaluado, en el momento que Trichoderma spp., invadía la mitad del crecimiento de Sclerotinia spp., comenzó a esporular y al quinto día, cubrió por completo al fitopatógeno realizando una esporulación abundante sobre el (Foto 5), corroborando lo expresado por Biocontrol (2005), quien manifiesta que en estas pruebas se puede observar hiper parasitismo y en muchos casos incremento de la esporulación cuando Trichoderma spp., crece sobre la colonia del patógeno, siendo este uno de esos casos, degradándolo y alimentándose del fitopatógeno, corroborando lo expresado por Harman, G (2001).

En los Gráficos 8, 9 y 10 se observa que las cepas de Trichoderma (TAC2) y los patógenos tuvieron un comportamiento similar en cuanto a crecimiento y mecanismo de acción de Trichoderma spp., ejercido sobre Fusarium spp; Sclerotinia spp. y Rhizopus spp., con la diferencia que en estos tratamientos no hubo cambio de coloración en los fitopatógenos como ocurrió en los tratamientos T1, T2 y T3, pero en el tratamiento T9 la cepa TAC2 al quinto día evaluado, invadió por completo a Rhizopus spp., parasitándolo y realizando una esporulación abundante sobre este (Figura 6), corroborando lo expresado por Biocontrol (2005), quien manifiesta que en estas pruebas se puede observar hiperparasitismo y en muchos casos incremento de la esporulación cuando Trichoderma spp., crece sobre la colonia del patógeno, siendo este uno de esos casos, degradándolo y alimentándose del fitopatógeno, corroborando lo expresado por Harman., (2001).

En los histogramas de los tratamientos se puede observar la inhibición antagónica, competencia por el sustrato y el micoparasitismo que ejercen las cepas TAC1, TAE1 y TAC2 sobre los fitopatógenos, a partir del tercer día evaluado, corroborando lo expresado por De la Cruz, (1987), que la actividad antagónica de Trichoderma spp., contra hongos fitopatógenos en pruebas “in vitro” es eficiente, determinado que Trichoderma spp., paraliza el crecimiento de los hongos patógenos.

CONCLUSIONES

En nuestros suelos contamos con una excelente microfauna benéfica que puede ser aprovechada y multiplicada a nivel de laboratorio e inoculada en nuestros campos, hasta su establecimiento y así mantener el equilibrio natural de organismos fitopatógenos, sin el uso de agroquímicos.

El medio de cultivo PDA (Papa dextrosa agar) es el más apropiado para ser utilizado en trabajos de laboratorios relacionados con hongos. Las cepas TAC1, TAC2 y TAE1 fueron las mejores en cuanto a su velocidad de crecimiento en relación a las demás cepas en estudio.

Los hongos Fusarium spp., Sclerotinia spp., y Rhizopus spp., fueron inhibidas por las cepas TAC1, TAE1, TAC2, respectivamente.

El mecanismo de acción de las cepas de Trichoderma spp., en estudio fueron, primero por competencia del sustrato por su velocidad de crecimiento y liberación de gases que inhiben el crecimiento del fitopatógeno y luego por micoparasitismo con la eliminación total del organismo.

 
Autor/es
Manabi, Ecuador
Ing. Agrónomo
(8627)
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Camilo Cury Vásquez
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Santo Domingo, Distrito Nacional, República Dominicana
Re: Cultivo In Vitro de Trichoderma spp. y su antagonismo frente a hongos fitopatógenos
28/08/2015 | Estoy totalmente de acuerdo con el concepto del ING Carlos Abecasis , tanto que sugiero se difunda como disciplina general que predomine en toda actividad agropecuaria .
Cuando estudiaba hace muchos años pensaba en ese equilibrio que debe regir en todo la naturaleza.
El equilibrio de todos los seres vivos .
Nosotros los humanos somos los que alteramos ese equilibrio por nuestro afán desmedido de obtener riquezas sin importarnos como afectamos ese equilibrio de la naturaleza
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jose joaquin castaño
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Popayan, Cauca, Colombia
Administrativo
Re: Cultivo In Vitro de Trichoderma spp. y su antagonismo frente a hongos fitopatógenos
29/08/2015 | como se obtiene el trichoderma en nuestra finca?
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Edwin Mira
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Nueva San Salvador, La Libertad, El Salvador
Ing. Químico
Re: Cultivo In Vitro de Trichoderma spp. y su antagonismo frente a hongos fitopatógenos
29/08/2015 | Muy de acuerdo con el Ing. Abecasis, para no crear un desequilbrio de Microorganismos en el Suelo, es necesario que la intervención que hagamos sea la más parecida a como trabaja la naturaleza(Equilibrio). Este equilibrio se debe buscar pero no solo en los microorganismos, sino también en los Minerales del suelo.
Si tenemos un desequilibrio mineral vamos a tener problemas porque habrán elementos que no son accesible para las plantas y estas se debilitan por su ausencia, lo que ocasiona que la naturaleza responda buscando destruir la planta( a trevez de insectos, virus, bacterias etc.) para que se devuelva al suelo los nutrientes y que pueda surgir una nueva planta mejor nutrida y más fuerte.
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Ing. Agr. Carlos Abecasis
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CABA, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina
Ing. Agrónomo
Re: Cultivo In Vitro de Trichoderma spp. y su antagonismo frente a hongos fitopatógenos
29/08/2015 | Estamos de acuerdo Edwin, pero no perdamos de vista que el ciclo es como el del huevo y la gallina: Para que haya diversidad de microorganismos debe haber diversidad de nutrientes y para que haya diversidad de nutrientes debe haber diversidad de microorganismos !!!, ya que son los microorganismos los que mayores aportes hacen para que esto suceda. Cada especie microbiana excreta uno o más tipos de enzimas al medio para disolver los alimentos y transformarlos en nutrientes para las plantas. Por ende, cuanto mayor sea la diversidad de microorganismos mayor será la diversidad de enzimas y mayor entonces será la diversidad de nutrientes disponibles !!
En un medio con suficiente cantidad y diversidad microbiana es muy poco probable que falte algún nutriente !!!
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Edwin Mira
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Nueva San Salvador, La Libertad, El Salvador
Ing. Químico
Re: Cultivo In Vitro de Trichoderma spp. y su antagonismo frente a hongos fitopatógenos
29/08/2015 | Excelente Carlos, mejor imposible, Hay elementos presentes es los Minerales que sirven como Cofactores enzimáticos o como parte de las enzimas o simplemente como catalizadores. sin ellos no funcionarían algunas enzimas y los procesos serían lentos!!!
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Luis Alberto Padilla Valencia
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Culiacán, Sinaloa, México
Director
Re: Cultivo In Vitro de Trichoderma spp. y su antagonismo frente a hongos fitopatógenos
01/09/2015 | Estimados amigos:
su servidor comprobó el año, próximo pasado, en el ciclo agrícola en Culiacán, Sin. MEXICO con unas calabazas amarillas para la exportación, la efectividad en el uso del Trichoderma koningiopsis, obteniendo los mejores pesos y calidad de las calabazas, en el lote tratado. La realidad que no se inició el tratamiento con la semilla, sino que se aplicó el material foliarmente.
Tenemos trabajos en maíces y sorgos en las zonas agrícolas de Zacoalco de Torres, Jalisco y Chiautla de Tapia, Puebla y me refiero solamente a estas 2 zonas, pues son las más castigadas por el mal temporal, en este ciclo agrícola P-V 2015 (pueden ver fotografías en nuestra página de facebook de More less) y los resultados del desarrollo con muy pocas lluvias, han sido extraordinarios.
Agradezco sus opiniones y las estamos tomando muy en cuenta, para evitar saturar nuestros suelos y generar problemas posteriores.

I.A.P. Luis Alberto Padilla Valencia
www.morelessmexico.com
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Graciela Romero
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Montevideo, Montevideo, Uruguay
Ing.Agr.Graciela Romero . www.labgrom.com 00598 99626845
Re: Cultivo In Vitro de Trichoderma spp. y su antagonismo frente a hongos fitopatógenos
01/09/2015 | Hola a todos Realmente el foro es muy interesante y diverso. Quiero plantear nuestra opinión a lo largo de años trabajandocon analisis de suelos diferentes con distintos cultivos y con controles biológicos, se ven algunas afeciones sanitarias que si son claramente INDUCIDAS digamos por acciones humanas puntuales tratando de resolver problemas como faltas de nutrientes, aportando ÚNICAMENTE ESE NUTRIENTE , o problemas sanitarios con productos QUIMICOS, Y LUEGO DE ALGUN TIEMPO VARIABLE vemos que aparecen otros problemas.La realidad es que ni aún los controles biológicos debemos usarlos en base a UNA SOLA CEPA lo ideal es mezcla de cepas y mezcla de nutrientes o vigorizantes o bioestimulantes y PARALELAMENTE observar y analizar suelos, hojas, etc para detectar como se viene comparando el cultivo.
Existen muchos antecedentes de esto , mezcla de microorganismos benéficos, productos natualres que levantan niveles enzimáticos o dejan disponibles nutrientes en el suelo.
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Alvaro Castillo Castillo
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Alajuela, Alajuela, Costa Rica
Ing. Agrónomo
Re: Cultivo In Vitro de Trichoderma spp. y su antagonismo frente a hongos fitopatógenos
01/09/2015 | Graciela; creo que lo que estas mencionando es la clave trabajar con microorganismos eficientes, Sin embargo, es necesario también trabajar con las familias en la parte cultural, para que esto sea parte su modo de ver la agricultura, y poder con esto mejorar la economía familiar. Deberás es un gusto que podamos debatir sobre estos temas que son el futuro de la agricultura de muchos de nuestros pueblos .
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Hernan Dario Lozano Parra
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Chinchiná, Caldas, Colombia
Ing. Agrónomo
Re: Cultivo In Vitro de Trichoderma spp. y su antagonismo frente a hongos fitopatógenos
01/09/2015 | hola igualmente me han funcionado de un modo excelente la implementacion de microorganismos en diferentes cultivos que asesoro, primero hago un vació biológico y luego de 3 dias formulo el llenado biologico con melazas, y los controles de hongos y bacterias como fusarium y ralstonia son bastante notorios.
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Henry Alvis Zabala
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Ibague, Tolima, Colombia
Ing. Agrónomo
Re: Cultivo In Vitro de Trichoderma spp. y su antagonismo frente a hongos fitopatógenos
02/09/2015 | Buen dia, no hay que olvidar que los microorganismos y en general los biológicos se establecen y multiplican en el suelo, partiendo de la coexistencia de sus antagónicos, es decir, fitopatógenos, existiendo tropismo direccional, normalmente un microorganismo de tipo biológico no destruye ni ataca en forma indiscriminada a su antagónico y menos ataca a todas las especies de fitopatógenos, al mismo tiempo, inicialmente ataca selectivamente y no lo erradica pues se acabaría el mismo. (deben coexistir)
Para ello antes de su inoculación en el suelo se realiza un análisis microbiológico del suelo para establecer especies predominantes y cuantificar su presencia.
Además se debe evitar al máximo aplicaciones cercanas de muriato o cloruro de potasio. El suelo está vivo y nosotros los seres humanos poco a poco lo estamos destruyendo, el proceso biológico no debe mirarse en forma parcial es un proceso holístico y complejo, el suelo y los microorganismos, en balance son una " Máquina" perfecta para producir cualquier tipo de cultivo.
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