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Hongo Trichoderma spp

Cultivo In Vitro de Trichoderma spp. y su antagonismo frente a hongos fitopatógenos

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RESUMEN

Con el objetivo de evaluar el potencial del hongo Trichoderma spp, se llevaron a cabo dos bioensayos en el año 2006 en el Laboratorio de Microbiología de la Escuela Superior Politécnica Agropecuaria de Manabí Manuel Félix López (ESPAM MFL). En el primer bioensayo se evaluó la velocidad del crecimiento de Trichoderma spp., en dos medios de cultivo: Papa dextrosa agar (PDA), Agar extracto de malta (AEM). Se utilizaron ocho cepas de Trichoderma spp., aisladas de tres áreas de producción del campus de la ESPAM MFL, localizada en el sitio EL Limón, Calceta-Manabí. El diseño experimental utilizado fue un Completamente Aleatorizado (DCA) con tres réplicas. Los mejores resultados se obtuvieron en las cepas provenientes del área de cultivo de cacao TAC1 y TAC2, así como la perteneciente a la unidad de producción ecológica TAE1; y el medio de cultivo PDA. Estos materiales sirvieron de base para el bioensayo 2, en donde se midió la capacidad antagónica de las cepas seleccionadas en el bioensayo 1 frente a los fitopatógenos Fusarium spp., Sclerotinia spp., y Rhizopus spp., el diseño experimental utilizado fue un DCA con cuatro réplicas. Donde se corroboró que las cepas de Trichoderma spp. TAC1, TAC2 y TAE1, ejercen un control del 100% sobre los tres patógenos al quinto día evaluado. La que tiene mejores características para ser multiplicada y liberada en campo es la cepa TAC2, ya que su esporulación es mayor; esta característica es fundamental para que el hongo sea establecido con mayor rapidez en un campo determinado.

ABSTRACT

In order to evaluate the potential of the fungus Trichoderma spp. as a biological control agent of various phytopathogens affecting different cultivations during every cycle of evolution, two assays were carried out in the year 2006. The first assay evaluated the speed of rise of the Trichoderma spp., in two cultivations: 1) Papa Agar Dextrosa (PDA); and , 2) Agar Extract of Malta (AEM). The work procedure in this first phase of study was established using 8 “strains” of Trichoderma spp., insulate in three area of production in the Superior Polytechnic School of Manabí “Manuel Félix López” (ESPAM “MFL”) located in Calceta-Manabí, In this experiment a completely random design (CRD) was used with three replications. Two factors were studied. “Strains” of (Factor A) and “Culture Medias” (Factor B). The best results were obtained from the cacao crops TAC1 and TAC2, also from the ecological production TAE1 strains: and the PDA cultivation. Which were used subsequently in the bioassay 2. Where was evaluated the antagonist capacity of the selected strains in bioassay # 1 opposite to the phytopathogens Fusarium spp., Sclerotinia spp. and Rhizopus spp. It was established a completely random design (CRD) with four replications. Here it was confirmed “in vitro” where the Thichoderma spp., holds the control of 100% up the three phytopathogens in the fifth day of evaluation. In conclusion, the strains TAC1, TAE1 and TAC2 produces a good biological control “in vitro” of the phytopathogens used in this study; however, the strains codified as:TAC2 showed the best characteristic to be multiplied and liberated in the field, because of the higher sporulations observed during its development; this characteristic is fundamental so the fungus can be establish faster in the field.


INTRODUCCIÓN

El uso de microorganismos antagonistas de fitopatógenos habitantes del suelo, cobra cada vez más importancia ya que su aplicación no genera desequilibrios biológicos, y más bien regula o minimiza las poblaciones de fitopatógenos habitantes del suelo; esta acción de los antagonistas, indudablemente, conduce a la disminución o eliminación del uso de productos químicos que son nocivos para el entorno.

En nuestro país estos estudios son muy incipientes o se los ha realizado muy superfluamente, desaprovechando, de esta manera, la posibilidad de manejar problemas fitopatológicos a muy bajos costos y sin riesgos para el medio ambiente.

Para Baker, K. y Cook, J. (1983), se entiende por control biológico la reducción de la densidad o de las actividades productoras de enfermedades de un patógeno o parásito en su estado activo o durmiente, lograda de manera natural por medio de antagonistas a través de la manipulación del ambiente del patógeno que se quiere controlar, hablemos de control biológico haciendo referencia a la utilización de microorganismos antagonistas para el control de enfermedades, entendiéndose por antagonistas aquellos organismos que interfieren en la supervivencia o desarrollo de los patógenos.

Los autores antes mencionados manifiestan, que el control biológico involucraría todas aquellas prácticas tendientes a disminuir la incidencia de enfermedades, excluyendo el control químico. En la naturaleza existe una interacción continua entre los potenciales patógenos y sus antagonistas de forma tal que estos últimos contribuyen a que no haya enfermedad en la mayoría de los casos; es decir, el control biológico funciona naturalmente.

Rollán, et al., (1998), mencionan que en condiciones naturales los microorganismos están en un equilibrio dinámico en la superficie de las plantas. La disminución de la flora de competencia por prácticas agrícolas como lavado de frutos, aplicación de fungicidas, y desinfección de suelos entre otras, favorecen el desarrollo de los patógenos. La posibilidad de desarrollar y aplicar esta tecnología en el país debe ser estudiada, como una alternativa de manejo inocuo de problemas fitosanitarios causado por hongos habitantes del suelo, que parasitan las raíces de las plantas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Este trabajo constó de dos bioensayos: En el bioensayo 1, se tomaron muestras de suelo a 20 cm de profundidad de tres diferentes áreas de producción de la ESPAM MFL, se las llevo al laboratorio donde se procedió a realizar una flora total de tres diluciones 10-1, 10-2 y 10-3 y se monitoreó durante 10 días, de donde se obtuvieron ocho cepas de Trichoderma spp., las que fueron codificadas de la siguiente manera: Área de producción convencional Cepa 1 TACv1, Cepa 2 TACv2. Área de cultivo de cacao Cepa 1 TAC1, Cepa 2 TAC2, Cepa 3 TAC3 y Cepa 4 TAC4. Área de producción Ecológica Cepa 1 TAE1 y Cepa 2 TAC2; las que fueron evaluadas estadísticamente para medir su velocidad de crecimiento y el medio de cultivo en el que los microorganismos se desarrollan de mejor manera, evaluando dos medios de cultivo PDA (Papa dextrosa agar) y AEM (Agar extracto de malta).

Experimento 1 Detalle de los tratamientos

En el Cuadro 1 se observan los tratamientos expresados con cada una de las claves de las cepas y los medios de cultivo correspondientes a cada uno. En la Foto 1 se observan cada una de las cepas en estudio en los respectivos medios de cultivo en su unidad experimental.

Diseño experimental

Se empleó el Diseño Completamente Aleatorizado (DCA), con tres réplicas. Con arreglo factorial A x B.

Manejo del experimento

Se tomaron discos de 7 mm de diámetro con un sacabocado de las 8 cepas del género Trichoderma spp. Se incubaron los tratamientos en la estufa a 270C durante 2 días, a partir de allí se evaluó: crecimiento en milímetro/día.- Con una regla estandarizada en milímetros se medió el diámetro de crecimiento de las colonias de Trichoderma spp., en sus respectivos tratamientos, cada 24 horas durante 2 días a partir de la siembra.

Morfología.- Al quinto día se observaron las cajas petri al microscopio con el objetivo de 40 X, para determinar algunas de las características de las cepas de Trichoderma spp., y los medios de cultivo en estudio en el bioensayo 1 como: forma del micelio, color del micelio, tipo de micelio, esporulación, color que adquiere el medio de cultivo y el olor que emite cada una de las cepas en estudio.

Análisis estadístico

Para determinar la diferencia estadística entre los tratamientos se utilizó el programa estadístico, paquete de diseños experimentales FAUANL de la Universidad de Nuevo León de México.

Para determinar si existía diferencia significativa entre los tratamientos se realizó una prueba de rangos múltiples de Tukey al p< 0.05.

Experimento 2

En el bioensayo 2, se evaluó la capacidad antagónica de las mejores cepas de Trichoderma spp., seleccionadas estadísticamente del bioensayo 1, las que fueron: TAC1= Trichoderma spp., Área de Cacao 1, TAE1= Trichoderma spp., Área Ecológica 1 y TAC2= Trichoderma spp., Área de Cacao 2 (Fig. 2), frente a Fusarium spp., Sclerotinia spp., y Rhizopus spp., aislados en el Laboratorio de microbiología de la ESPAM-MFL para este trabajo.

Detalle de los tratamientos

En el Cuadro 2, se expresa cada uno de los tratamientos del segundo bioensayo.

Manejo del experimento

Se tomaron discos de 7 mm de diámetro con un sacabocado de las 3 cepas de Trichoderma seleccionadas de los tres fitopatógenos en estudio, las cuales fueron sembradas de forma simultánea como lo indican los tratamientos. Luego se procedió a incubar los tratamientos en la estufa a 270C durante 5 días. En este lapso se procedió a evaluar el antagonismo. Con una regla estandarizada en (mm) se medió el diámetro de crecimiento de las cepas de Trichoderma spp., y cada uno de los fitopatógenos en su respectivo tratamiento cada 24 horas durante 5 días a partir de la siembra.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Bioensayo 1.

En el cuadro 3, se observan las ocho cepas evaluadas en el bioensayo 1 de las cuales se seleccionaron tres que estadísticamente se encuentran en la primera categoría; dos fueron aisladas del área de producción del cacao (TAC1 y TAC2) y una del área de producción ecológica (TAE1). En estas áreas de producción no se usa agroquímicos de síntesis, los controles fitosanitarios y fertilizaciones son a base de productos artesanales y comerciales de origen biológico, lo que puede haber favorecido a que estas cepas hayan tenido mejor eficiencia en su crecimiento con relación a las del área de producción convencional que, por el alto uso de productos de síntesis química, se han intoxicado los suelos y debilitado la flora benéfica de los mismos.

En el cuadro 4, se presenta los promedios de crecimiento de las ocho cepas en cada uno de los medios de cultivo. Se puede apreciar la ventaja estadística del medio de cultivo PDA en los dos días de evaluación. Este tiene influencia, marcada sobre el crecimiento del hongo Trichoderma spp., corroborando lo que manifiesta Monzón y Rodríguez, (s.f.) en que el alto contenido de carbohidratos que contiene el medio de cultivo, condiciona a que los hongos tengan un mayor crecimiento, en detrimento de la esporulación que suele retrasarse hasta un mes. El coeficiente de variación en el bioensayo 1, en el día 1 es alto debido a la alta variabilidad de los materiales biológicos evaluados.

En el cuadro 5, se observan algunas de las características morfológicas más relevantes de las cepas en estudio, se aprecia que siete de las ocho cepas en estudio adquirieron, en la fase de multiplicación, una esporulación de coloración verde, lo cual corresponde a una característica específica para hongos del orden Trichoderma, como lo manifiesta Esposito y Da-Silva, (1998); Harman, (2001); Papavizas, (1985).

De las ocho cepas, las codificadas TAC1 y TAE1, emiten un aroma a coco corroborando lo expresado por Dennis y Webster, (s.f) citado por Biocontrol, (2005), en que una de la características de Trichoderma es el pronunciado aroma a coco que emite el medio de cultivo, lo que certifica que el hongo con que se trabajó pertenecía al género Trichoderma.

Bioensayo 2. Antagonismo de Trichoderma spp. (Cepa TAC1) frente a Fusarium spp., Sclerotinia spp. y Rhizopus spp., tratamientos 1, 2 y 3 que emite el medio de cultivo, lo que certifica que el hongo con que se trabajó pertenece a Trichoderma.

Como se puede apreciar en los gráficos 1, 2 y 3 en el primer día evaluado, el crecimiento de los dos hongos fue homogéneo, pero para los días 2 y 3 el crecimiento de Trichoderma spp., se incrementa mucho con relación al fitopatógeno, cubriendo la mayor parte del sustrato, en este caso PDA (Papa dextrosa agar), la velocidad del crecimiento que tiene Trichoderma spp., es aprovechada por este como un mecanismo de control biológico conocido como competencia de recurso vital, corroborando lo expresado por Tronsmo y Hhjeljord (1998); citado por Biocontrol, (2005). El tercer día evaluado es el momento en que se confronta el crecimiento del hongo benéfico con el fitopatógeno en la caja petri, es cuando comienza el mico-parasitismo, al cuarto y quinto día Fusarium spp; Sclerotinia spp. y Rhizopus spp., es invadido por las hifas de Trichoderma spp., en el medio de cultivo y este cambia de color, pasando de crema a un color anaranjado intenso (Foto 4), este fenómeno puede ser provocado por la liberación de enzimas que realiza Trichoderma spp., al momento que micoparasita al fitopatógeno, degradándolo y alimentándose de este, corroborando lo expresado por Harman, (2001).

El antagonismo de Trichoderma spp. (Cepa TAE1) frete a Fusarium spp., Sclerotinia spp., y Rhizopus spp., (Gráficos 4, 5 y 6) en los días evaluados tuvieron un comportamiento similar en cuanto a crecimiento y mecanismo de acción, con la diferencia que en estos tratamientos, no hubo cambio de coloración en los fitopatógenos como ocurrió en los tratamientos T1, T2 y T3, solo en el tratamiento T5 la cepa TAE1 al cuarto día evaluado, en el momento que Trichoderma spp., invadía la mitad del crecimiento de Sclerotinia spp., comenzó a esporular y al quinto día, cubrió por completo al fitopatógeno realizando una esporulación abundante sobre el (Foto 5), corroborando lo expresado por Biocontrol (2005), quien manifiesta que en estas pruebas se puede observar hiper parasitismo y en muchos casos incremento de la esporulación cuando Trichoderma spp., crece sobre la colonia del patógeno, siendo este uno de esos casos, degradándolo y alimentándose del fitopatógeno, corroborando lo expresado por Harman, G (2001).

En los Gráficos 8, 9 y 10 se observa que las cepas de Trichoderma (TAC2) y los patógenos tuvieron un comportamiento similar en cuanto a crecimiento y mecanismo de acción de Trichoderma spp., ejercido sobre Fusarium spp; Sclerotinia spp. y Rhizopus spp., con la diferencia que en estos tratamientos no hubo cambio de coloración en los fitopatógenos como ocurrió en los tratamientos T1, T2 y T3, pero en el tratamiento T9 la cepa TAC2 al quinto día evaluado, invadió por completo a Rhizopus spp., parasitándolo y realizando una esporulación abundante sobre este (Figura 6), corroborando lo expresado por Biocontrol (2005), quien manifiesta que en estas pruebas se puede observar hiperparasitismo y en muchos casos incremento de la esporulación cuando Trichoderma spp., crece sobre la colonia del patógeno, siendo este uno de esos casos, degradándolo y alimentándose del fitopatógeno, corroborando lo expresado por Harman., (2001).

En los histogramas de los tratamientos se puede observar la inhibición antagónica, competencia por el sustrato y el micoparasitismo que ejercen las cepas TAC1, TAE1 y TAC2 sobre los fitopatógenos, a partir del tercer día evaluado, corroborando lo expresado por De la Cruz, (1987), que la actividad antagónica de Trichoderma spp., contra hongos fitopatógenos en pruebas “in vitro” es eficiente, determinado que Trichoderma spp., paraliza el crecimiento de los hongos patógenos.

CONCLUSIONES

En nuestros suelos contamos con una excelente microfauna benéfica que puede ser aprovechada y multiplicada a nivel de laboratorio e inoculada en nuestros campos, hasta su establecimiento y así mantener el equilibrio natural de organismos fitopatógenos, sin el uso de agroquímicos.

El medio de cultivo PDA (Papa dextrosa agar) es el más apropiado para ser utilizado en trabajos de laboratorios relacionados con hongos. Las cepas TAC1, TAC2 y TAE1 fueron las mejores en cuanto a su velocidad de crecimiento en relación a las demás cepas en estudio.

Los hongos Fusarium spp., Sclerotinia spp., y Rhizopus spp., fueron inhibidas por las cepas TAC1, TAE1, TAC2, respectivamente.

El mecanismo de acción de las cepas de Trichoderma spp., en estudio fueron, primero por competencia del sustrato por su velocidad de crecimiento y liberación de gases que inhiben el crecimiento del fitopatógeno y luego por micoparasitismo con la eliminación total del organismo.

 
Autor/es
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Nelson Diez
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Ciudad de Paysandu, Paysandu, Uruguay
Ing. Agrónomo
Re: Cultivo In Vitro de Trichoderma spp. y su antagonismo frente a hongos fitopatógenos
27/02/2014 | Estimados integrantes de este foro, nosotros en Uruguay estamos trabajando con Microorganismos en colaboración directa con al Ing.Abecasis de Argentina. No tenemos dudas de que es un camino imprescindible, pero para hacerlo bien hace falta un buen diagnóstico inicial, buenos análisis químicos, físicos y biológicos para determinar el punto de partida de cada situación (puede haber más de una en el mismo campo). Sin ese diagnóstico certero inicial, probablemente dejemos al ejército de aliados (los Microorganismos) demasiado a merced de las circunstancias y no obtengamos el resultado esperado.
Esta práctica es una nueva agronomía y requiere del agrónomo muy cerca de la producción para que operativamente se logren dar los pasos con la menor aleatoriedad posible.
Como se sabe mucho de cosas puntuales y poco del sistema en su conjunto, se hace difícil creer en él, apostar a este sistema, medirlo adecuadamente, etc.
Nosotros, en los campos propios y los asesorados, ya no tenemos dudas de la eficacia del uso de consorcios microbianos.
Cordiales saludos, Ing. Agr.Nelson Diez
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Fernando Marroquin
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Ibarra, Imbabura, Ecuador
Ing. Agrónomo
Re: Cultivo In Vitro de Trichoderma spp. y su antagonismo frente a hongos fitopatógenos
27/02/2014 | Muy bueno el articulo, en Ecuador se esta iniciando el trabajo con Trichodermas, EM; micorrizas en los invernaderos que son los que mas sufren en la invacion de patogenos por la baja rotación de cultivos y el alto monocultivo.
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Nelson Guerrero
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Gama, Cundinamarca, Colombia
Agricultor
Re: Cultivo In Vitro de Trichoderma spp. y su antagonismo frente a hongos fitopatógenos
28/02/2014 | Soy extensionista, y estamos trabajando con frutales d clima frio de la region(Uchuva-tomate de arabol-Mora-Granadilla. quisiera que me orientaran si al hacer una desinfeccion de suelo, caso del Bamid que destruye muchos hongos, debo restablecerlos con Trichoderma y si es benefico adicionar a la materia organica trichoderma.
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Ing. Agr. Carlos Abecasis
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CABA, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina
Ing. Agrónomo
Re: Cultivo In Vitro de Trichoderma spp. y su antagonismo frente a hongos fitopatógenos
01/03/2014 | Estimado Nelson Guerrero
Mi recomendación es que hagas exactamente lo contrario a lo que proponés, ya que lo que hay que hacer es aumentar la bio-diversidad y no eliminarla !!! Esa es la clave para que todo funcione en armonía. Imagina por un momento si todos los colombianos fuesen Abogados; quién educaría en los colegios, quien construiría casas, quién trabajaría el campo, etc. La biodiversidad es lo que debemos buscar, y para ello hay que trabajar la tierra de otra manera, haciendo muchos cultivos pero en pocas hectáreas, rotarlos contínuamente, aprotar los restos de esos cultivos al suelo, etc., etc. y sobre todo entender que el suelo es un ORGANISMO VIVO que cuando está en su máxima capacidad, le da TODOS los nutrientes al cultivo, por lo que no son necesiarios los fertilizantes de síntesis química, o bien se pueden usar pero en muy pequeñas proporciones, sólo como complementos si fuera necesario.
Si el suelo está vivo realmente, es capaz de activar todos los sistemas de defensas de la planta, lo cual hará que se pueda defender sola de cualquier situación de estrés y de posibles ataques de hongos o de insectos. Por lo tanto no va a ser necesario el uso de plaguicidas de síntesis. Y en el caso de haber algún desequilibrio, se pueden usar biocontroladores como Trichoderma, pero en dosis mucho más pequeñas de las que indican los marbetes, ya que cuando el suelo está sano, la posibilidad de fuertes ataques es mínima y las dosis recomendadas de biocontroladores están preparadas para problemas graves. La naturaleza está llena de Trichoderma y de millones de otros microorganismos capaces de evitar desequilibrios biológicos. El problema es que los productos elaborados a base de biocontroladores están diseñados con grandes cantidades de una especie microbiana que si no se maneja bien puede generar un problema mayor al que pretende solucionar, ya que aumenta la población de ese bicho de manera considerable, algo que la naturaleza no genera espontáneamente. Un equipo de fútbol tiene que tener 1 arquero o portero y no 4 ó 5...
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Elicio Mendoza Z
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Portoviejo, Manabi, Ecuador
Ing. Agrónomo
Re: Cultivo In Vitro de Trichoderma spp. y su antagonismo frente a hongos fitopatógenos
02/03/2014 | Es importante para la agricultura, la implementación de cultivos en los que se fomente la utilización de microorganismos benéficos,buscando estabilizar el equiibrio en los ecosistemas. Es muy interesante el trabajo de investigación realizado en la ESPAM MFL,y será importante su aplicación en campo, con el propósito de disminuir el uso de agroquímicos.
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Re: Cultivo In Vitro de Trichoderma spp. y su antagonismo frente a hongos fitopatógenos
07/03/2014 | Donato sandoval Cuisano
profesional agricultor Peru, Ancash, Huaraz

La investigacion es buena,cual seria la recomendacion en campo, por ej. yo me didico a las actividades de sostenimiento a tres niveles: 1° bajo con agua, 2° con agua suelo pendiente y 3° secano/bajo lluvia, a un mas el cambio climatico es evidente en esta region del pais peruano.

para estas condiciones cual de las CEPAS seria recomendable y como los adquiero para comprobar.
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Carmen Yolexa Buitrago
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Santa Barbara, Zulia, Venezuela
Ing. Agrónomo
Re: Cultivo In Vitro de Trichoderma spp. y su antagonismo frente a hongos fitopatógenos
20/04/2014 | buenas tardes me gustaria informacion en palma aceitera y platano gracias
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Hector Gonzalez Guerra
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Monterrey, Nuevo Leon, México
Asistente Marketing
Re: Cultivo In Vitro de Trichoderma spp. y su antagonismo frente a hongos fitopatógenos
21/04/2014 | MAGNIFICO ARTICULO MUY CLARO E INTERESANTE SIENTO QUE NOS TIENEN ACOSTUMBRADOS A RECETAS Y LAS QUEREMOS APLICAR COMO SI ESTUVIERA ASEGURADO EL EXITO.

NECESITAMOS ENTENDER LOS CONCEPTOS DE UNA FORMA INTEGRAL Y A PARTIR DE ESO USARLOS A NUESTRO FAVOR

NO TODAS LAS MEDICINAS REACCIONAN IGUAL EN EL SER HUMANO IGUAL A NUESTRO SUELO HAY QUE ENTENDERLO Y DESPUES AYUDARLO PARA NUESTRO BENEFICIO
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Carmen Yolexa Buitrago
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Santa Barbara, Zulia, Venezuela
Ing. Agrónomo
Re: Cultivo In Vitro de Trichoderma spp. y su antagonismo frente a hongos fitopatógenos
22/04/2014 | agradesco informacion sobre taller o curso sobre este tema fecha y costo gracias
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Re: Cultivo In Vitro de Trichoderma spp. y su antagonismo frente a hongos fitopatógenos
22/04/2014 | APRECIADO PIERO FAJARDO Y FORISTAS:ES EXTRAÑO DECIR QUE UN MICROORGANISMO BENEFICO ACTUE EN UN CULTIVO INUNDADO COMO EL ARROZ POR EJEMPLO Y PRODUSCA BENEFICIOS AL MISMO.PUES BIEN EN ARROZ YA HAY TRABAJOS CIENTIFICOS CON EL TRICHORMA HARZIANUM Y OTRA ESPECIE Y SE ENCONTRO QUE CON SU USO EN ESTE CEREAL SE INCREMENTO EN PROMEDIO UN 45% LA PRODUCCION ,DISMINUYERON LAS ENFERMEDADES Y LA MASA RADICULAR AUMENTO TANTO EN PESO COMO EN TAMAÑO.
MIL GRACIAS:
MARCO TULIO OSORIO S I.A
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